新城疫病毒TL1株P基因的克隆及序列分析

根据GenBank登陆的新城疫病毒P基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR技术对新城疫病毒内蒙古分离株TL1的P基因进行了扩增。将扩增产物提纯后克隆入pGEM-Teasy载体,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确。测序拼接得出P基因的序列长度为1248bp,该基因的ORF总长为1188bp,编码395个氨基酸。与GenBank下载的12株参考毒株比较P基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株核苷酸的同源性为99.8%,氨基酸的同源性为99.2%;与鹅源新城疫ZJ1株核苷酸的同源性为96.1%,氨基酸的同源性为95.5%,说明TL1株和与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株的同源性极高,它们三者亲缘关系较近,同属于基因VII型新城疫病毒。而与传统疫苗株LaSota核苷酸的同源性为83.4%,氨基酸的同源性81.8%,说明该毒株相对于经典的NDV在P基因上已发生了较大的变异。     

新城疫病毒F48E9株M和NP基因的原核表达

根据新城疫病毒（NDV）F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因。经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a（＋）上,转化E．coliBL21（DE3）,筛选表达NDVF48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果表明,NDVM蛋白在E．coliBL21（DE3）内以可溶形式存在,而NP蛋白以包涵体的形式表达。用纯化的M和NP蛋白免疫鸡制备超免疫血清,进行Western-blot分析;结果,它们可以与真核表达系统表达的M和NP蛋白以及NDV发生特异性反应,表明,原核表达系统表达的NDVM和NP蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。     

新城疫病毒V4株L基因的克隆与序列分析

设计了2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4，用RT-PCR法对新城疫病毒(NDV)V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约4．1kb的V4LA片段，用V4L3、V4L4扩增出约3．5kb的V4LB片段，分别对克隆出的2个片段进行序列测定，并用DNAsis软件比较分析后进行拼接，得到长约7．2kb、包含有NDVV4克隆株L基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株L基因mRNA全长为6704bp，拥有1个6615bp的开放阅读框，推测其编码的氨基酸数为2204个。氨基酸同源性分析表明：V4克隆株与HB92 V4株L基因的同源性为99．0％，与LaSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株)、Beaudette C、Clone30、F48E9、SF02和ZJ1株的同源性为94．1％～96．5％。     

新城疫病毒Lasota株F基因的克隆和序列分析

本试验采用RT-PCR方法对NDV Lasota株的全长F基因进行了扩增与克隆，并对其进行测序。扩出的F基因核苷酸长度为1664bp，单一的开放阅读框编码553个氨基酸的长肽，序列中有6个糖基化位点，13个半胱氨酸残基，包括完整的F1片段和完整的F2片段。裂解位点区(112-117aa)氨基酸序列为Gly-Arg-Gin-Gly-Arg-Leu，与所有弱毒株在这一区域的序列(Gy-Arg／Lys-Gin-Gly／Ser-Arg-Leu)相符。同源性分析表明，Lasota株F基因与已发表的其它NDVF基因相比，核苷酸序列同源性在88％-99％之间，推导的氨基酸序列同源性在90％～99％之间。     

新城疫病毒V4株主要基因的克隆与序列分析

设计4对引物，利用RT—PCR技术分别扩增出新城疫病毒（NDV）V4株长约4.2、4.1、4.1、3.5kb的4个互相重叠的核苷酸片段，并分别进行了克隆和序列测定。将这4个片段的核苷酸序列拼接后，得到长为15 061 bp的核苷酸序列。该序列包含有NDVv4株结构基因NP的全部编码区和5’端非编码序列，结构基因P、M、F、HN及L基因的全部编码区和非编码区序列，各结构基因之间的间隔序列以及基因组5’端部分尾巴序列（108bp）。序列比较分析表明，NDVv4株F蛋白裂解位点序列为^112GKQGRL^117，HN基因编码616个氨基酸，符合无毒株的特征；NDVv4株同基因组长度为15 192 bp的毒株一样，在基因组的1647～1648bp间比基因组长为15192bp的毒株少了6个碱基。     

鹅源新城疫病毒F基因的克隆及其序列分析

鹅新城疫是近年来我国新发现的能感染多种禽类的传染病，国内许多学者在该病的发生、发展规律以及分子病毒学等领域有了较多的研究，现已确定该病毒是禽副粘病毒Ⅰ型即新城疫病毒的一个变种。本实验选择最近分离的2株鹅源新城疫病毒，采用已经发表的鸡新城疫病毒序列设计引物，应用RT—PCR技术扩增鹅源新城疫病毒的F基因，并将其克隆至载体上，然后进行了核苷酸序列测定、进行了系统的分析，并根据遗传距离的远近确定了鹅源新城疫病毒在NDV系统发育进化树中的地位。     

鸵鸟源新城疫病毒TN株F基因的克隆与序列分析

应用PCR技术对1株鸵鸟源新城疫病毒TN株融合蛋白基因(F基因)进行扩增,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定,并与国内外NDV毒株对应序列进行比较分析.结果表明,TN株F基因的长度为1 662 bp,可编码553个氨基酸,其裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,为1株新城疫弱毒株;与贵州省其他禽源(包括肉鸡、蛋鸡、越南斗鸡、七彩山鸡和鸽子等)毒株间的核苷酸同源性为84.0%～89.6%,氨基酸同源性为87.5%～92.1%;与国内外NDV代表株(Lasota株、B1株、F48E9株、CH2000株和TW2000株)的核苷酸同源性为84.4%～98.6%,氨基酸同源性为88.3%～98.0%.经系统发生树分析,TN株与NDV弱毒株Lasota株和B1株在同一分支上,属于基因II型NDV.     

新城疫病毒(长春株)F蛋白基因的克隆和序列分析

新城疫病毒（ＮＤＶ）长春株在鸡胚增殖后纯化,提取ＲＮＡ,然后利用特异性引物,经ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出了ＮＤＶ长春株的全长Ｆ基因。将该Ｆ基因插入ｐＫＳ（－）后,进行了序列测定。序列分析表明,该Ｆ基因核苷酸长度为１７５８ｂｐ,编码５５３个氨基酸,序列中有６个糖基化位点,１３个半胱氨酸残基,裂解位点区（１１２～１１７）氨基酸序列为Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ,与所有弱毒株在这一区域的序列（Ｇｌｙ－Ａｒｇ／Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ／Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ）相符,证明长春株为弱毒株。同源性分析表明,长春株Ｆ基因与目前国外发表的其他ＮＤＶＦ基因相比,核苷酸序列同源性在８８％～９９％之间,推导的氨基酸序列同源性在９０％～９８％之间     

一株野鸭源新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

根据GenBank中新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的F基因序列设计了1对特异性引物,成功地对其中一株野鸭源NDV的F基因进行了克隆、测序,并推导其氨基酸序列,选择F基因部分片段绘制了遗传进化树。F基因全长1 662 bp,单一的阅读框架编码553个氨基酸,构成的F蛋白上有13个Cys残基位点和6个潜在的糖基化位点,其裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-116R-117F。遗传进化分析表明,该NDV分离株为基因Ⅶ型NDV,与近年来我国家禽中所报道的NDV的基因型相一致。     

新城疫病毒地方分离株HN基因的克隆及遗传变异分析

对河北省保定地区两个NDV分离株用RT-PCR技术扩增其HN基因片断,产物经转化、克隆和测序,参照国内外已发表新城疫代表株绘制NDV系统发育进化树并分析其遗传关系,结果表明,两个分离株HN基因在遗传上同源性高达99.7%,两个分离株HN基因核苷酸序列与国内外报道的相关序列同源性为82.8%～93.2%,推导氨基酸序列同源性为90.0%～96.0%,由系统发育树可见,与现今流行于国内的Ⅶ型病毒株有密切联系.     

2004年黑龙江省新城疫病毒分子流行病学分析

2004年从黑龙江省部分鸡场疑似新城疫(ND)病死鸡和鸽体内分离到9株NDV。对这9株NDV生物学特性进行测定,并对其F基因包括裂解位点在内的540bp片段进行了克隆、测序和同源性分析。结果表明,9株NDV鸡胚平均死亡时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)分别在47.8h～78.4h和1.51～2.00之间;8个分离株在F蛋白裂解位点氨基酸顺序为112RRQKRF117,1个分离株F蛋白裂解位点氨基酸顺序为112RRQRRF117,表明了它们全为ND中、强毒株。同源性分析显示,9株NDV分离株之间核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为79.7%～99.7%和79.8%～100%;系统发生树分析表明,6株分离株与台湾株(TW98、TW99和TW2000等)遗传距离较近,可能有共同的起源,为基因Ⅶe型NDV,2株为鸽源NDV基因Ⅵ型,1株与我国特有的F48E9遗传距离最近,为基因Ⅸ型NDV。     

新城疫病毒F48E9株V基因的表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鸡源新城疫病毒（NDV）强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V基因全长cDNA，并引进相应的突变位点，将其克隆到pMD18-T载体，然后亚克隆到原核表达载体pET-30c上，重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序，筛选出阳性重组质粒，并命名为pET-30c-V。将pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21（DE3），用1mmol／LIPTG 37℃过夜诱导表达，SDS-PAGE及Western-blotting分析结果表明，所表达的NDVV重组蛋白主要以包涵体形式存在，分子质量约28ku，与理论值大小相符。将包涵体用8mol／L脲变性，经Ni-NTA柱纯化，透析复性，得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡（300μg／只），成功制备了抗鸡NDVV蛋白的抗血清。     

山东新城疫病毒分离株F基因的遗传进化分析

应用特异性引物从山东某发病鸡场病鸡体内分离到的命名为JN09的新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）中扩增其F基因,预计扩增片段大小为1 700 bp。RT-PCR扩增出的目的片段大小与预计扩增片段大小相符合,测序结果表明扩增片段与新城疫病毒F基因序列相符。对其F基因进行遗传进化分析,并结合山东地区近几年来的分离毒株的相关信息,着重分析该地区近年来新城疫病毒F基因的变异情况。     

3株新城疫病毒广西分离株L基因的克隆与序列分析

根据GenBank登陆的新城疫病毒L基因序列,设计了3对引物(L1和L2、L3和L4、L5和L6)。用RT-PCR技术对3株新城疫病毒广西分离GX7/02、GX9/03、GX11/03的L基因进行了分段扩增和克隆,并对克隆出来的3个片段进行序列测定,用DNAstar软件比较分析后进行拼接,得到长约为6.8 kb、包含有L基因全长的核苷酸序列。L基因的RNA全长为6 704 bp,拥有一个6 615 bp的开放阅读框,推导其编码的氨基酸数为2 204个。氨基酸同源性分析表明广西分离株之间同源性为98.6%~98.7%;与ZJ1株同源性为98.8%~98.9%;与La-Sota、B1、F48E9、HB92同源性为92.0%~94.2%。     

一株鸽源新城疫病毒主要毒力基因分析

对2008年从广州市白云区某发病信鸽养殖场分离鉴定的一株鸽源新城疫病毒(简称CP-GD-2008),运用RT-PCR方法扩增出该病毒的F和HN基因的ORF序列,并进行序列测定。经序列对比、进化分析发现,CP-GD-2008属于基因Ⅵb亚型毒株,F蛋白具有强毒株裂解位点序列112R-R-Q-K-R-F117。该毒株与欧洲流行的鸽源基因Ⅵb亚型毒株进化关系密切,表明该毒株与欧洲分离株可能存在共同来源。对F和HN蛋白功能研究发现,除HN蛋白第347位抗原位点由E突变为G外,F和HN蛋白的中和位点、糖基化位点及半胱氨酸残基高度保守。     

表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒的部分生物学特性研究

为了评价转基因对鸡痘病毒(FPV)生物学特性的影响,通过电镜观察表达新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)基因重组鸡痘病毒(rFPV-12LSHN)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF).结果表明:在FPV中插入NDV HN基因后,不改变rFPV的形态、病毒成熟过程;rFPV-12LSHN与FPV在CEF上的产量无...