紫花苜蓿MsUGT87A1基因克隆及其对非生物胁迫的响应分析

尿苷二磷酸(Uridine diphosphate, UDP)糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase, UGT)催化植物体内黄酮等次生代谢产物的糖基化反应，在植物抵御逆境胁迫过程中具有重要作用。本研究从紫花苜蓿(Medicago sativa)中克隆UGT家族基因MsUGT87A1,利用生物信息学方法对其蛋白质理化性质、二级结构和亚细胞定位等进行分析，并通过荧光定量PCR分析MsUGT87A1基因的组织表达特异性及对不同非生物胁迫的响应情况。结果表明，MsUGT87A1基因全长1 353 bp,编码450个氨基酸，蛋白质相对分子量为50.98 kDa,理论等电点(pI)为5.78,属于亲水性蛋白，主要定位于细胞质中。系统进化树结果表明紫花苜蓿MsUGT87A1与蒺藜苜蓿、红三叶等豆科植物的UGT87A1同源性较高。MsUGT87A1基因在紫花苜蓿根中表达量最高，对干旱、盐和ABA处理均有响应，初步确定MsUGT87A1基因参与紫花苜蓿应对干旱及盐胁迫响应。该研究为进一步探究MsUGT87A1基因功能奠定基础，为紫花苜蓿抗逆性遗传改良提供理论依据。     

紫花苜蓿MsHSP17.7基因的克隆及功能分析

热激蛋白是一类普遍参与抗逆的保护性蛋白,在植物生长发育及逆境调控中起重要作用。为了解紫花苜蓿(Medicago sativaL.)热激蛋白基因特性及功能,本研究通过同源克隆法获得热激蛋白基因MsHSP17.7,该基因包含477bp开放阅读框,编码158个氨基酸,蛋白分子量为17.67kDa。序列比对发现MsHSP17.7与截形苜蓿(Medicago truncatula)和豌豆(Pisum sativum)中的2个小分子热激蛋白同源性较高,相似度分别是93.38%,83.13%。组织差异性表达显示,MsHSP17.7在茎中表达最多,叶和花次之,在根中最少;实时定量PCR分析显示,MsHSP17.7受高温、高盐诱导表达,在过氧化诱导下表达量变化不明显。对T3代转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)实时定量PCR分析显示,该基因在高盐和过氧化胁迫下均能大量表达,结果表明MsHSP17.7基因可能参与了高盐与过氧化逆境下的胁迫应激调控。     

Cloning and function analysis of MvP5CS in Medicago varia xinmu-1

为研究苜蓿（Medicago sativa）耐盐分子机制，为抗逆分子育种提供依据，通过同源克隆和RTPCR技术克隆了新牧一号杂花苜蓿（M．varia Xinmu-1）的MvP5CS基因，MvPSCS全长2148bp，Genbank登录号为：EU371644。荧光定量PCR分析发现，在盐胁迫下MvPSCS基因表达明显上调，说明MvP5CS与苜蓿的耐盐性相关。利用农杆菌介导的叶盘转化法。将MePSCS基因成功转入烟草（Nicotiana tabacum），盐胁迫下转MvP5CS基因T1代烟草萌发率和根长均高于非转基因烟草．表明新牧一号首蓿P5CS基因能够据高转基因烟草的耐盐性。     

新牧一号苜蓿MvP5CS基因的克隆和功能分析

为研究苜蓿（Medicago sativa）耐盐分子机制，为抗逆分子育种提供依据，通过同源克隆和RT PCR技术克隆了新牧一号杂花苜蓿（M.varia Xinmu 1）的MvP5CS基因， MvP5CS全长2 148 bp，Genbank登录号为：EU371644。荧光定量PCR分析发现，在盐胁迫下MvP5CS基因表达明显上调，说明 MvP5CS与苜蓿的耐盐性相关。利用农杆菌介导的叶盘转化法，将MvP5CS基因成功转入烟草（Nicotiana tabacum），盐胁迫下转MvP5CS基因T1代烟草萌发率和根长均高于非转基因烟草。表明新牧一号苜蓿P5CS基因能够提高转基因烟草的耐盐性。     

唐古特白刺类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(NtUFGT)的克隆与功能分析

花青素是植物体内重要的黄酮类次生代谢产物,其强大的抗氧化能力对植物抵抗由各种非生物胁迫带来的氧化损伤发挥着重要的作用。本研究基于转录组数据,从唐古特白刺cDNA中克隆得到一个类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因,将其命名为NtUFGT。该基因开放阅读框长度为1407 bp,编码468个氨基酸,预测该基因编码的蛋白质相对分子质量为51.37 kDa。多重序列比对分析结果显示,其编码蛋白属于UDP-glycosyltransferases蛋白家族。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了该基因在唐古特白刺中的表达模式,发现该基因的表达具有组织特异性,由高到低依次为花果实茎叶根;同时该基因能被聚乙二醇(PEG)和脱落酸(ABA)等非生物胁迫强烈诱导表达。构建该基因的真核表达载体pPZP221:35S:NtUFGT,使用花序浸染法转化拟南芥并筛选至T_3代,RT-PCR验证表明,NtUFGT基因在转基因拟南芥3个株系中均明显表达。测定干旱胁迫条件下野生型(WT)和转基因拟南芥(OE株系)生长状况和抗逆相关生理生化指标,结果发现转基因拟南芥生长状况明显优于野生型,根长更长,鲜重和叶绿素含量更高,同时OE株系积累了更多的花青素和总黄酮。与表型一致,相较于WT,OE株系具有更高的抗氧化酶活性[超氧化物歧化酶(SOD);过氧化物酶(POD);过氧化氢酶(CAT)],积累了更多的还原性谷胱甘肽(GSH)和脯氨酸,同时其丙二醛(MDA)、过氧化氢(H_2O_2)含量显著低于WT;基因定量分析结果显示,OE株系拟南芥中抗逆相关基因AtCAT1、AtPOD1、AtRD29A及脯氨酸合成基因AtP5CS的表达量明显高于WT。以上结果说明,NtUFGT能有效提高转基因拟南芥中花青素和总黄酮含量,赋予植物更强的活性氧清除能力和渗透调节能力,从而增强了植物对干旱胁迫的耐受性。     

柳枝稷PvbZIP8基因的克隆与表达分析

bZIP转录因子在植物非生物逆境胁迫的响应中发挥着重要作用,本研究通过同源克隆在柳枝稷（Panicum virgatum L.）中获得PvbZIP8基因,并对该基因进行了初步的生物信息学分析,同时利用荧光定量PCR技术进行了非生物胁迫下基因表达模式分析以及组织特异性表达分析。结果显示：基因的开放阅读框长度为468 bp,编码155个氨基酸,分子式为C₇₆₁H₁₂₄₈N₂₄O₂₃S₈,分子量为17.81 kDa,为亲水性蛋白。系统进化分析表明该蛋白与哈氏黍（Panicum hallii）、谷子（Setaria italica）和糜子（Panicum miliaceum）相似性较高,并且具有典型的bZIP保守结构域,属于bZIP转录因子家族成员。定量PCR结果显示,PvbZIP8基因在盐、干旱、高温和低温胁迫下上调表达,在柳枝稷抗逆过程中发生作用。组织特异性表达分析表明,PvbZIP8在多个组织或器官均有表达,其中在根、茎、叶中表达量较高。本研究初步确定柳枝稷PvbZIP8基因响应抗逆性反应,并为进一步研究柳枝稷PvbZIP8基因的生物学功能奠定基础。     

羊草LcCBF6基因的表达特性和功能研究

羊草是我国重要的牧草和生态草资源,具有耐盐碱、耐旱、耐低温等特性,是天然的抗逆基因资源库.CBF/DREB属于AP2转录因子家族,在植物抗逆中发挥着重要作用.本研究克隆得到羊草LcCBF6(Leymus chinensis C-repeat binding factor 6)基因,该基因含有AP2结构域,编码245个氨基酸.氨基酸序列比对发现,LcCBF6与蒙古冰草和黑麦的CBF6蛋白的同源性分别为92％和91％.组织特异性表达模式分析表明,LcCBF6基因在羊草根、叶、种子中均有表达,且受盐胁迫诱导表达.过表达LcCBF6能显著提高转基因拟南芥的抗盐性.在盐胁迫条件下,转基因株系的绿色子叶数、根长、植株生物量以及存活率等均明显高于野生型.上述结果表明羊草LcCBF6基因在提高植物盐胁迫抗性方面发挥了重要的作用,将为牧草及重要农作物抗逆分子育种提供优异的基因资源.     

枇杷ASR基因分离及其在果实发育中的表达分析

ASR（abscisic acid, stress, and ripening-induced）基因是近年来从植物中发现的一类与环境胁迫和果实成熟相关的重要基因。本研究分离了枇杷ASR cDNA全长基因EjASR1,该基因长为877bp,含有一个822bp的开放阅读框,编码241个氨基酸。EjASR1基因编码的蛋白质与荔枝、甜橙亲缘关系较近,与水稻等亲缘关系较远。荧光定量RT-PCR分析显示,EjASR1表达量随着果实发育呈上升趋势,在果实发育后期EjASR1的表达量显著高于发育前期,表明该基因与成熟相关,研究结果为进一步研究枇杷果实品质形成机理奠定了基础。     

唐古特白刺类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(NtUFGT)的克隆与功能分析

花青素是植物体内重要的黄酮类次生代谢产物,其强大的抗氧化能力对植物抵抗由各种非生物胁迫带来的氧化损伤发挥着重要的作用。本研究基于转录组数据,从唐古特白刺cDNA中克隆得到一个类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因,将其命名为NtUFGT。该基因开放阅读框长度为1407 bp,编码468个氨基酸,预测该基因编码的蛋白质相对分子质量为51.37 kDa。多重序列比对分析结果显示,其编码蛋白属于UDP-glycosyltransferases蛋白家族。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了该基因在唐古特白刺中的表达模式,发现该基因的表达具有组织特异性,由高到低依次为花>果实>茎>叶>根;同时该基因能被聚乙二醇(PEG)和脱落酸(ABA)等非生物胁迫强烈诱导表达。构建该基因的真核表达载体pPZP221:35S:NtUFGT,使用花序浸染法转化拟南芥并筛选至T₃代,RT-PCR验证表明,NtUFGT基因在转基因拟南芥3个株系中均明显表达。测定干旱胁迫条件下野生型(WT)和转基因拟南芥(OE株系)生长状况和抗逆相关生理生化指标,结果发现转基因拟南芥生长状况明显优于野生型,根长更长,鲜重和叶绿素含量更高,同时OE株系积累了更多的花青素和总黄酮。与表型一致,相较于WT,OE株系具有更高的抗氧化酶活性[超氧化物歧化酶(SOD);过氧化物酶(POD);过氧化氢酶(CAT)],积累了更多的还原性谷胱甘肽(GSH)和脯氨酸,同时其丙二醛(MDA)、过氧化氢(H₂O₂)含量显著低于WT;基因定量分析结果显示,OE株系拟南芥中抗逆相关基因AtCAT1、AtPOD1、AtRD29A及脯氨酸合成基因AtP5CS的表达量明显高于WT。以上结果说明,NtUFGT能有效提高转基因拟南芥中花青素和总黄酮含量,赋予植物更强的活性氧清除能力和渗透调节能力,从而增强了植物对干旱胁迫的耐受性。     

四翅滨藜AcDREB2转录因子编码基因的克隆及其表达

脱水应答元件结合蛋白(DREB)在植物响应盐和干旱胁迫中发挥重要作用。为研究DREB在耐盐碱耐干旱的先锋植物四翅滨藜(Atriplex canescens)中的功能及其应用前景,本研究设计了一对简并引物,通过PCR扩增和RACE法克隆得到四翅滨藜DREB转录因子编码基因AcDREB2。该基因cDNA全长为867 bp,共编码242个氨基酸。序列BLAST比对与同源性分析结果表明,该基因与其他植物的DREB具有较高的同源性。利用RT-PCR方法进行表达模式分析发现,AcDREB2在四翅滨藜叶中高丰度表达,且其表达受NaCl和渗透胁迫处理的快速诱导,表明AcDREB2参与了四翅滨藜的抗逆响应。     

四翅滨藜AcDREB2转录因子编码基因的克隆及其表达

脱水应答元件结合蛋白(DREB)在植物响应盐和干旱胁迫中发挥重要作用.为研究DREB在耐盐碱耐干旱的先锋植物四翅滨藜(Atriplex canescens)中的功能及其应用前景,本研究设计了一对简并引物,通过PCR扩增和RACE法克隆得到四翅滨藜DREB转录因子编码基因AcDREB2.该基因cDNA全长为867 bp,共编码242个氨基酸.序列BLAST比对与同源性分析结果表明,该基因与其他植物的DREB具有较高的同源性.利用RT-PCR方法进行表达模式分析发现,AcDREB2在四翅滨藜叶中高丰度表达,且其表达受NaCl和渗透胁迫处理的快速诱导,表明AcDREB2参与了四翅滨藜的抗逆响应.     

紫花苜蓿GDP解离抑制蛋白基因cDNA的克隆、分析及烟草转化

采用RT-PCR方法,克隆得到紫花苜蓿(Medicago sativa L.)GDP解离抑制蛋白基因cDNA核心区域序列,命名为MsGDI1。序列分析结果表明,该cDNA核心区域全长1575 bp,包含一个1332 bp的最大开放阅读框,编码444个氨基酸。半定量RT-PCR分析结果表明,在盐胁迫和铝胁迫条件下,MsGDI1基因的表达随着胁迫时间的增加而上升,该基因可能与紫花苜蓿抗盐耐铝机理有关。借助于新构建的该基因超表达载体,用农杆菌介导方法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。转基因烟草植株PCR检测的结果表明,MsGDI1基因已经成功插入到烟草基因组中,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

紫花苜蓿atpA基因的克隆及表达模式分析

叶绿体atpA基因位于ATP合酶的CF₁上,编码α亚基,是光合作用不可缺少的关键基因。本研究利用RT-PCR技术,从‘新疆大叶’苜蓿(Medicago sativa L.‘Xinjiang Daye’)中克隆出atpA基因,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术进行基因表达模式检测。结果显示,MsatpA基因编码510个氨基酸,相对分子质量为55.71 KD,等电点为5.22。MsAtpA蛋白含有多个磷酸化位点且无跨膜结构和信号肽,二级结构中α-螺旋占比最高;亚细胞定位预测该基因编码的蛋白位于叶绿体中,与同为豆科苜蓿属的黄花苜蓿(Medicago falcata)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的AtpA氨基酸序列同源性较高。表达模式检测结果显示,MsatpA基因在叶中的表达量最高,根中最少;结荚期的基因表达量显著高于其他发育时期;MsatpA基因响应低温、高温、盐和渗透胁迫应答,且呈现出不同的表达特点。研究结果为紫花苜蓿atpA基因功能研究奠定基础。     

长叶红砂RtMYB1基因的克隆及表达

MYB转录因子家族在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥着重要的调控作用。基于转录组测序数据,从珍稀泌盐盐生植物长叶红砂(Reaumuria trigyna)中克隆一个MYB转录因子基因,命名为RtMYB1。RtMYB1基因具有780bp的ORF(open reading frame)序列,编码236个氨基酸残基组成的蛋白。RtMYB1能够被盐、冷、高温、紫外照射(UV)和干旱(PEG)5种非生物胁迫诱导表达,这表明RtMYB1基因可能参与长叶红砂响应非生物胁迫的调节途径。本研究为深入了解长叶红砂的抗逆机理及发掘优异的抗逆基因奠定了基础。     

紫花苜蓿MsRBP基因的克隆、分析及烟草的遗传转化

采用RACE技术以一段紫花苜蓿(Medicago sativa)盐诱导基因的EST(expressed sequence tag)序列为模板设计引物克隆此基因的全长序列.序列分析结果表明,该基因全长1551 bp,包含一个1230 bp的最大开放阅读框,编码409个氨基酸,包含3个RNA结合蛋白结构域(RRM domain),命名为MsRBP(GenBank accession No.JN986878.1).亚细胞定位分析表明此基因编码蛋白定位于细胞核.经同源比对和进化树分析,MsRBP基因编码的氨基酸序列与截形苜蓿(Medicago truncatula)、大豆(Gl ycine max)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等物种中的某些RNA结合蛋白的氨基酸序列具有很高的相似性.RT-PCR (Real-time PCR)分析结果表明,在NaCl,ABA和PEG胁迫下MsRBP基因的表达水平均上调,推测该基因可能在紫花苜蓿逆境胁迫调控中发挥重要作用.经构建植物超表达载体pBI21-MsRBP,采用农杆菌介导法对烟草(Nicotiana tabacum)进行遗传转化,获得了抗性转化再生植株.通过PCR,RT-PCR及GUS组织化学染色分析表明:MsRBP基因在烟草的基因组中能够进行转录和表达.本研究为该基因的功能鉴定与调控机制研究奠定了基础.     

紫花苜蓿GPAT基因家族鉴定及在盐碱胁迫下的表达模式分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)是甘油生物合成的限速酶，参与多种脂类的生物合成途径，在植物生长发育和抗逆过程中具有重要作用。为了解GPAT基因在紫花苜蓿(Medicago sativa)应对非生物胁迫过程中的作用，本研究利用生物信息学方法共鉴定出73个紫花苜蓿MsGPATs基因。研究表明，MsGPAT基因在染色体上不均匀分布，大多数基因存在大片段复制现象。系统进化树分析将其分为3个亚组。基因结构和蛋白质保守基序分析表明MsGPAT基因家族成员多数含有2～3个外显子或11～12个外显子，至少含有1个保守基序。顺式作用元件分析表明不同MsGPATs基因含有不同的光、生长素和胁迫应答元件。基因表达谱分析显示，分别有10,5,18个MsGPATs基因积极响应高盐、高碱和混合盐碱胁迫，可作为紫花苜蓿耐盐碱研究的候选基因。     

地毯草铝响应基因AcABCG1的克隆与表达分析

铝毒抑制植物根系生长,是酸性土壤上限制作物产量的重要因素之一。ABC转运蛋白在金属离子转运和非生物胁迫应答等方面起作用。本研究以地毯草（Axonopus compressus）为材料,克隆了地毯草编码ABC转运蛋白AcABCG1基因,并对其进行了生物信息学和基因表达模式分析。结果表明,AcABCG1基因cDNA全长为2 434 bp,编码811个氨基酸残基,蛋白分子量为91.85 kD。亚细胞定位预测表明AcABCG1定位于细胞质膜上。定量PCR结果发现,金属铝（Al）、镉（Cd）和镧（La）处理均能显著增强AcABCG1基因在地毯草根系中的表达。不同铝浓度和时间处理进一步表明了AcABCG1基因在转录水平上响应铝胁迫。此外,AcABCG1基因在根中的表达量显著高于茎和叶中的表达量,且AcABCG1基因主要在0~1 cm根尖中表达。本研究结果为进一步挖掘AcABCG1基因参与地毯草耐铝毒的生物学功能奠定基础。     

盐生草根系基因HgAKR6C的克隆与初步功能分析

醛酮还原酶（AKR）是构成Shaker型K+通道蛋白的保守核心结构域，在植物应对非生物胁迫时起到关键作用。本研究采用西北旱区典型盐生植物盐生草作为研究材料，基于课题组前期盐生草根系盐胁迫转录组学数据分析结果，筛选并克隆得到耐盐基因HgAKR6C。HgAKR6C基因蛋白质编码区（CDS）全长951 bp，共编码氨基酸317个。系统发育进化树分析表明，HgAKR6C与拟南芥中AtAKR6C1基因亲缘关系最近。亚细胞定位表明该基因可能主要定位于细胞质和细胞核中。qRT-PCR结果表明HgAKR6C在盐处理24 h时表达量达到峰值。构建酵母异源表达载体转化缺陷型菌株发现，HgAKR6C基因可能参与Na+的外排和介导K+的吸收。综上所述，HgAKR6C具有调节盐生草耐盐性的功能，而盐生草根系耐盐基因HgAKR6C的调控机制还需进一步的研究验证。     

转PeDREB2a和KcERF基因紫花苜蓿的表型及抗旱耐盐性

以紫花苜蓿(Medicago sativa)‘中苜1号’为受体材料，通过根癌农杆菌介导法将抗旱基因PeDREB2a、KcERF转入‘中苜1号’，获得转基因抗性苗66株，基因组PCR检测阳性率为93.94%,RT-PCR检测表明目的基因在转录水平上能够稳定表达；利用Taqman PCR方法检测目的基因的拷贝数，结果表明PeDREB2a、KcERF基因在转基因株系Z6、Z7、Z9中均为单拷贝。在正常生长条件下，转基因株系Z6和Z7株高、分枝数、叶片吲哚乙酸含量、纤维素含量均显著高于野生型，而叶片乙烯含量显著低于野生型(P<0.05)。用20%PEG-3350和250 mmol·L^-1 NaCl胁迫处理进行表型观测和抗逆生理指标检测，表明转基因株系与野生型相比抗旱、耐盐能力明显增强。本研究为进一步培育抗逆优质高产苜蓿新品种提供了新种质。     

紫花苜蓿MsCCD4基因克隆及耐盐功能鉴定

为验证紫花苜蓿(Medicago sativa L.)胡萝卜素裂解双加氧酶(Carotenoid cleavage dioxygenase, CCD)基因的耐盐功能,本试验克隆了紫花苜蓿MsCCD4的CDS全长序列,并以其叶片为试验材料,通过发根农杆菌介导的毛状根诱导法获得过表达MsCCD4的转基因毛状根,验证过表达MsCCD4对紫花苜蓿耐盐性的影响。结果表明：MsCCD4为稳定的酸性亲水蛋白质,二级结构以无规则卷曲为主,C-端含有RPE65保守结构域;MsCCD4启动子区含有光响应、激素应答和非生物胁迫响应结合元件;盐胁迫可诱导MsCCD4表达量升高;盐胁迫生理实验证明,过表达MsCCD4可以增强毛状根的耐盐性。本研究为紫花苜蓿耐盐遗传改良提供基因资源及耐盐基因快速鉴定方法。