高羊茅在低氮胁迫下的蛋白组学分析

为了研究高羊茅在低氮胁迫条件下的蛋白水平变化,我们采用iTRAP技术分析了氮胁迫30 d的高羊茅叶片中蛋白组学的变化.一共检测到595个差异蛋白(295个上调,300个下调),分别参与了多个不同的代谢途径.在高严谨筛选标准下,氮代谢,氧化还原反应以及胁迫相关代谢等多个途径的基因被明显上调表达.通过生理生化测定发现,叶绿素,可溶性蛋白以及游离氨基酸的含量显著下降,而过氧化物酶(POD),超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽合成酶(GS)等活性氧清除酶活性显著升高.采用荧光定量PCR的方法验证蛋白组学数据发现所有挑选的基因都具有相同的变化趋势.分析显著富集的14-3-3基因家族的表达,发现其都能被低氮胁迫诱导,因此胁迫相关的基因可能是调节高羊茅抵抗多种不同逆境的关键基因.本文首次在高羊茅中采用蛋白组学的方法分析低氮胁迫条件下基因的表达变化,获得重要候选基因,并对其应用进行了讨论.     

基于转录组学比较研究甜高粱幼苗响应干旱和盐胁迫的生理特征北大核心CSCD

探究甜高粱响应干旱与盐胁迫的生理学差异及其分子机制,分析甜高粱在干旱和盐胁迫下的不同基因调控机制和代谢通路,可为饲草作物甜高粱抗逆栽培和育种提供依据。以辽甜1号甜高粱幼苗为材料,使用10%的PEG-6000和0.9%的NaCl模拟中度干旱和盐胁迫,胁迫2和7 d时进行光合气体交换参数、内源激素含量、有机渗透调节物质含量和抗氧化物酶活性测定,同时对幼苗叶片进行转录组测序及生物信息学分析,采用qRT-PCR方法对测序结果进行验证。结果表明:与对照相比,干旱和盐胁迫均显著影响甜高粱幼苗叶片生理指标的变化,但盐胁迫对甜高粱幼苗叶片光合参数和内源激素生长素、细胞分裂素含量抑制程度均高于干旱胁迫,可溶性糖含量在干旱胁迫下显著高于盐胁迫,抗氧化物酶活性和脱落酸含量低于盐胁迫,说明甜高粱对干旱和盐胁迫响应的生理机制不同;利用转录组测序技术鉴定出甜高粱叶片在处理2 d时,干旱和盐胁迫下分别有922和2047个上调基因以及975和1714个下调基因,处理7 d时分别鉴定到157和795个上调基因以及54和722个下调基因;同时鉴定出40个干旱胁迫响应基因和493个盐胁迫响应基因,基于GO富集分析发现甜高粱幼苗在干旱和盐胁迫下响应基因均显著富集于植物逆境响应相关通路,KEGG富集分析发现,干旱胁迫响应基因显著富集于内质网加工和剪切体代谢通路,盐胁迫响应基因显著富集在植物激素信号转导代谢通路;对光合作用、植物激素信号转导、抗氧化物酶和淀粉与蔗糖代谢通路相关差异基因进行分析发现,这些差异基因的表达模式与生理指标变化趋势吻合。因此,甜高粱在转录水平上对盐胁迫的适应稳态落后于干旱胁迫,中度胁迫下甜高粱幼苗对盐胁迫的耐受性要低于干旱胁迫,可溶性糖在甜高粱幼苗抵御干旱胁迫中发挥重要作用,植物激素信号转导和抗氧化物酶活性变化的共同调控是甜高粱幼苗对抗盐胁迫的关键。     

红三叶响应淹水胁迫的相关通路及差异表达基因分析

淹水胁迫是影响植物生长发育和分布的重要非生物胁迫，对植物淹水胁迫的研究是解决近年来极端强降水天气下植物生产管理的关键。红三叶作为优质豆科牧草，耐淹性较差，长期水淹会导致烂根死亡。为研究红三叶淹水胁迫下的分子响应机理，本研究通过Illumina高通量测序平台，以耐涝型品种“红龙”淹水胁迫下0、8和24 h三个时间点的幼苗叶片为材料进行转录组测序，将测序数据与参考基因组比对后进行差异表达基因（DEGs）分析和功能注释。结果显示，与对照0 h相比，“红龙”在淹水胁迫8 h后，有5065个DEGs，其中，上调表达基因2442个，下调表达基因2623个；在淹水胁迫24 h后，有9022个DEGs，其中，上调表达基因4279个，下调表达基因4743个。基因本体数据库富集结果显示，DEGs主要富集于代谢过程、细胞过程、生物调节、细胞、催化活性等条目；东京基因与基因组数据库富集结果显示，DEGs显著富集于植物激素信号调节、植物-病原互作、碳代谢和乙醛酸及二羧酸代谢等通路中，其中乙醛酸及二羧酸代谢通路中过氧化氢酶和甲酸脱氢酶等抗氧化酶相关基因高表达；并且发现差异表达的AP2/ERF、WRKY、bHLH、...     

基于转录组数据库的高羊茅HD-ZipⅠ转录因子的鉴定及表达模式解析

高等植物特有的同源异型-亮氨酸拉链蛋白(HD-Zip)家族转录因子在调控植物发育与逆境响应中起着重要作用。以生产中广泛应用的冷季型草高羊茅为研究材料,利用其目前已有的转录组序列,在Bioedit软件构建本地数据库。以水稻14个HD-ZIP I蛋白序列作为搜索请求,搜索本地数据库获得高羊茅中对应序列。结合序列分析及PCR克隆技术得到高羊茅13个HD-Zip I类成员的全长序列。系统进化树及MEME结构域分析发现,高羊茅13个HD-Zip I成员与水稻HD-Zip I家族成员进化关系接近,蛋白结构域的数目及排布方式也基本一致。采用荧光定量PCR技术分析短期及长期聚乙二醇6000模拟的干旱处理下11个FaHD-Zip I基因在高羊茅根颈中的mRNA相对表达水平。结果表明,短期干旱胁迫下,除FaHOX4和FaHOX6外,其余基因相对表达水平均发生一定程度的上调或者下调,且FaHOX22的响应程度最大;长期干旱胁迫下,所有基因的表达水平均在7或者14 d上调,FaHOX22在14 d时的表达水平比对照上调76.3倍。为基因组序列缺乏的非模式植物快速有效地进行基于转录组数据库的基因家族克隆及其功能研究提供了一种很好的方法。     

白羊草叶片和根系干旱胁迫下microRNAs差异表达分析

为了探索干旱胁迫下白羊草miRNAs的组织特异性,本研究在干旱胁迫下白羊草（Bothriochloa ischaemum）转录组数据的基础上,采用Illumina测序技术和生物信息学方法,对干旱胁迫和正常生长条件下白羊草苗期叶片和根系miRNAs（microRNAs）进行鉴定和表达分析研究。结果从4个库中鉴定出白羊草中有属于20个家族的79个已知miRNAs和92个新miRNAs。干旱胁迫后叶片和根系中差异表达的miRNAs分别有65个（上调28和下调37）和27个（上调15和下调12）。响应干旱胁迫的主要miRNAs为miR156,miR164,miR166,miR169,miR172,miR396,miR398,miR408,miR528。对这些miRNAs预测的靶基因进行GO生物功能和KEGG代谢通路富集分析表明,植物激素信号转导是叶片和根系响应干旱胁迫共同富集的主要代谢通路,而黄酮类化合物生物合成则是干旱胁迫下叶片富集的最主要代谢通路。     

菠萝蜜响应低温胁迫的转录组分析

通过研究抗寒性不同的菠萝蜜品系,筛选菠萝蜜抗寒关键基因,为菠萝蜜抗寒改良和耐寒良种选育提供理论依据。以自然低温胁迫后广西本土的菠萝蜜抗寒品系、泰国引进的低温敏感型菠萝蜜品系为研究材料,结合田间表型持续观测,并运用转录组测序技术从分子水平上对2个不同抗寒特性菠萝蜜进行生物信息学分析。两个品种共得到30585个差异表达基因,上调17083个,下调13502个。GO功能富集分析显示,差异表达基因显著富集在光合作用的光捕获、光反应、光合作用的调节,对光强度的反应、光系统、光系统I、光系统II,叶绿素、NADH、色素结合功能,以及叶绿素、类黄酮、类胡萝卜素、萜类等次生代谢物的代谢过程。KEGG途径富集分析结果显示,光合作用相关途径、淀粉与蔗糖代谢途径、植物激素信号转导途径及MAPK信号通路为菠萝蜜响应低温胁迫的重要代谢途径。差异表达基因注释到WRKY、ERF、bHLH、NAC、MYB等家族转录因子,与植物应答低温胁迫密切相关。光合作用相关途径、淀粉与蔗糖代谢途径、植物激素信号转导途径及MAPK信号通路是菠萝蜜应答低温胁迫的重要代谢途径,WRKY、ERF、bHLH、NAC、MYB等家族转录因子可能参与菠萝蜜应答低温胁迫。     

青海野生草地早熟禾响应干旱胁迫的代谢通路及转录调控分析

为探究青海野生草地早熟禾（Poa pratensis）响应干旱胁迫的分子机制,本研究以青海野生草地早熟禾抗旱材料‘10-202’和敏感材料‘09-61’为研究对象,采用高通量Illumina Hiseq测序技术对15% PEG-6000模拟的干旱胁迫和正常处理下的2份材料的叶片进行差异基因表达分析。结果表明：‘10-202’处理间存在3 166个差异表达基因（Different expression genes,DEGs）,上调和下调表达基因数目分别为1 979和1 187个;‘09-61’处理间共有314个DEGs,上调表达的有64个,下调表达的有250个。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析发现,2份材料的差异基因均显著富集在淀粉和蔗糖代谢通路。运用MapMan软件对‘10-202’干旱胁迫下与转录调控相关的差异基因进行了功能注释,发现bHLH,AP2/EREPB及C2H2锌指家族转录因子在响应干旱胁迫中发挥着重要作用。本研究为后续挖掘草地早熟禾耐旱相关候选基因的克隆和功能验证奠定了理论基础。     

敏旱和抗旱狗牙根叶片对干旱胁迫的转录组响应差异分析

狗牙根[Cynodon dactylon(Linn.) Pers]是一种优质抗旱草坪草，但其抗旱分子机制有待进一步明确。本研究以抗旱(C138)和敏旱(C32)2个狗牙根基因型为材料，对其正常灌溉(土壤相对含水量为田间持水量的80%～90%)、中度干旱(50%～60%)及重度(20%～30%)干旱处理10 d后的叶片进行取样，利用Illumina高通量测序平台进行转录组测序。与正常灌溉相比，干旱胁迫下C32有1 086个上调基因；C138有525个上调基因；C32整体响应基因数量更多，说明C32主要通过基因的正调控来响应干旱。差异基因GO富集分析显示，C138受到干旱胁迫时有更多的光合作用基因响应，C32主要富集在细胞分裂上。KEGG富集分析显示，中度胁迫下C138主要富集在叶绿素代谢和二萜类生物合成，C32主要富集在氮代谢和类黄酮生物合成；重度胁迫下C138主要富集在类黄酮生物合成，C32主要富集在氮代谢、苯并恶嗪类生物合成。中度胁迫下狗牙根抗旱可能与光合作用有关，重度胁迫下主要与次生代谢和渗透保护有关。次生代谢中的氮代谢、苯并恶嗪类生物合成和渗透保护中的谷氨酸代谢可能是狗牙根抗旱的...     

低氮胁迫对高羊茅苗期生理特性的影响

以'黔草1号'高羊茅(Festuca arundinacea)为材料,通过低氮条件下高羊茅的生物学特性、抗氧化酶活性、内源激素和氨基酸含量等指标探究低氮条件对高羊茅生理特性的影响.结果 表明:低氮胁迫下高羊茅的株高、生物量与蛋白质含量显著降低,而高羊茅叶片中的超氧化物歧化酶、过氧化物酶与谷氨酰胺合成酶活性受低氮胁迫诱导...     

铅胁迫下转DREB1A高羊茅对铅的吸收与耐受性研究

通过水培试验,研究转DREB1A高羊茅对铅的吸收与耐受性。分别用浓度为100 mg/L、200 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L、1500 mg/L、2000 mg/L的铅溶液对生长1个月的高羊茅进行胁迫处理,3周后测算了高羊茅植株的铅含量、枯黄率、根系耐性指数、迁移率、富集系数、转运系数等指标。结果显示,相同的铅胁迫条件下,转基因高羊茅的生长状况较好,对铅的富集与转运能力也较强。但无论是在生长状况方面还是在铅含量及分布方面,两种高羊茅对铅胁迫的反应趋势基本相同。表明DREB1A基因未改变高羊茅对铅的转移运输机制,但提高了高羊茅对铅的富集能力及耐性,转DREB1A高羊茅可成为修复铅污染土壤的备选植物。     

外源NO缓解草地早熟禾镉胁迫的转录组分析

为揭示外源一氧化氮对草地早熟禾（Poa pratensis）镉（Cadmium,Cd）胁迫缓解机制,本试验采用高通量Illumina Hiseq测序技术研究了草地早熟禾根施1 000 μmol·L^-1氯化镉和叶面喷施50 μmol·L^-1 NO供体硝普钠24 h后转录组基因的差异表达。对测序数据进行分析结果显示,4个处理组共有22 730个差异表达基因,包括15 332个上调基因和7 398个下调基因。通过富集分析发现外源NO主要通过调控与信号转导、碳水化合物转运与代谢、氨基酸生物合成及苯丙烷生物合成等途径相关的基因缓解镉胁迫。此外,本研究对Cd处理与Cd+NO处理组的差异表达基因和代谢通路进行分析,筛选出了一系列由NO信号介导的草地早熟禾响应镉胁迫关键基因,并将其列为NO缓解草地早熟禾镉胁迫相关的候选基因。本研究为挖掘草地早熟禾耐镉相关调控基因和功能基因提供基础。     

低氮胁迫对高羊茅IAA生长素代谢组影响的研究

氮是植物生长发育必须的大量元素之一,增施氮肥虽然有利于植物产量的提高,但是不利于土壤的可持续利用。牧草类作物相对于其他农作物受贫瘠土壤胁迫的危害更加严重,然而相应的理论研究还比较滞后。本文以禾本科牧草资源高羊茅为研究对象,利用LC-ESI-MS(液相色谱电离串联质谱)分析了正常和低氮条件下高羊茅叶片中的代谢组分,两种材料中分别稳定检测到1424和1251种代谢产物,利用OPLS-DA(正交偏最小二乘法判别分析)分析方法,鉴别到低氮处理后主要有13种代谢物质的含量发生变化,其中包括了生长素IAA。利用荧光定量PCR的方法检测8个IAA信号途径相关基因的表达,发现其表达在低氮处理后均被诱导,另外通过测定IAA激素的含量,也证实了IAA在高羊茅缺氮处理后升高这一事实。本研究为高羊茅氮缺乏的分子机理提供了重要的线索,也为在生产中通过喷施IAA来缓解植物应对氮缺乏的措施提供了理论依据。     

基于转录组测序的狗牙根抗旱根系关键代谢途径分析

根系是狗牙根响应干旱胁迫的重要器官,其响应不同程度干旱的分子机制有待进一步明确。以抗旱（C138）和敏旱（C32）2个狗牙根基因型为材料,对其正常灌溉（土壤相对含水量为田间持水量的80%～90%）、中度干旱（50%～60%）及重度干旱（20%～30%）下的根系进行取样,基于Illumina高通量测序平台进行转录组测序,共获得43581条单基因,有33025条得到注释。结果表明,与正常灌溉相比,中度及重度干旱下C138共7537个差异基因表达,其中上调1164个,下调6373个;C32有6731个差异基因表达,其中上调4304个,下调2427个。Top20 GO富集分析发现,中度干旱下C138主要富集于氧化还原酶活性、碳水化合物代谢和纤维素结合等,重度干旱下C138主要富集于磷酸代谢及蛋白磷酸化等,C32主要富集于过氧化物酶活性、氧化应激反应等;KEGG Pathway富集分析发现中度干旱下C138主要富集在谷胱甘肽代谢、苯丙基类生物合成和氮代谢途径;C32主要富集在氧化磷酸化、三羧酸循环（TCA）、核糖体和碳代谢途径;重度干旱胁迫下C138主要富集在谷胱甘肽代谢、花生四烯酸代谢、核糖体...     

干旱胁迫下高羊茅叶片的代谢组学分析

以禾本科牧草高羊茅为研究对象,采用液相色谱电离串联质谱(LC-ESI-MS)分析了干旱胁迫条件下高羊茅叶片中的代谢组学变化。其中,共稳定检测到282种代谢产物发生变化,148种下调表达,134种上调表达。利用MZmine软件处理原始数据,用主成分分析(PCA)与正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)方法,鉴定出4种代谢产物在干旱处理后下调,6种代谢产物上调。其中,芳香族化合物酰基基诺内酯、芳香族游离氨基酸、苏合香脂、甲烷呋喃都表现为上调;油脂代谢产物氢过氧化硬脂丁二酸酐、3-氧代十二烷酸酯、3-羟基十八烷基碳稀酸表现为下调,过氧化三甲基胺甲脂表现为上调;其他代谢产物如羟甲基茉莉酸葡萄糖苷(糖苷类)上调,胡椒新碱(生物碱)下调。芳香族化合物和脂代谢产物可能在高羊茅抗旱过程中起关键调控作用。     

不同降温模式下高加索三叶草的转录组比较分析

为探讨高加索三叶草（Trifolium ambiguum Bieb.）对不同降温模式低温胁迫的响应机制,本试验以缓慢降温（Gradual cooling,GC）和骤然降温（Sudden cooling,SC）处理对其进行了胁迫处理。通过转录组测序,比较了2个低温处理组与常温对照组（CK）间的转录组差异,并筛选了抗寒相关的基因和转录因子。结果表明：与CK相比,GC组和SC组中分别有8 020个和6 289个差异表达基因（DEGs）;GC组的DEGs主要在光合作用、光合作用天线蛋白、淀粉和蔗糖代谢等通路显著富集,SC组的DEGs主要在淀粉和蔗糖代谢、倍半萜和三萜生物合成、类黄酮生物合成等通路显著富集。此外,2处理组共有的DEGs仅在淀粉和蔗糖代谢通路显著富集;一些涉及淀粉和蔗糖代谢与植物激素信号转导通路的基因在2种降温模式下均上调表达,可作为潜在的抗寒基因,如BAM3,BFRUCT1,SUS,GH3.1,SAPK2等。进一步分析发现响应低温胁迫的转录因子主要分布在AP2/ERF,ZFP,MYB等家族。     

过量表达Fa14-3-3C促进拟南芥对低氮胁迫耐受性的研究

氮元素是植物生长发育过程必不可少的营养元素之一,对禾本科作物生长的影响更加明显。本研究采用RACE技术从高羊茅叶片中克隆获得Fa14-3-3C基因全长,并对其亚细胞定位与分子功能进行系统研究。在烟草表皮细胞中观察发现Fa14-3-3C-GFP主要定位在细胞质中与细胞膜上。将Fa14-3-3C基因在拟南芥中过量表达获得3个单拷贝转基因株系(抗性分离比为3∶1)。在低氮胁迫反应中,Fa14-3-3C过量表达株系OE-1与OE-3的根鲜重显著比野生型高,而OE-2与野生型差异不显著,通过荧光定量PCR分析发现OE-1与OE-3过量表达明显而OE-2没有过量表达,说明Fa14-3-3C对植物耐低氮胁迫调节具有剂量效应。定量观察植物根系生长发现在低氮处理早期OE-1转基因株系就显著优于野生型,主要是通过补偿根系生长的方式缓解低氮胁迫对植物的伤害。因此本研究不仅获得了耐低氮胁迫候选基因,而且验证了其在模式植物中的分子功能,为进一步通过基因工程等手段培育耐低氮胁迫种质资源奠定基础,具有重要理论研究价值与生产应用前景。     

木豆响应低温胁迫差异表达基因分析

为探讨木豆[Cajanus cajan (L.) Millsp.]响应低温胁迫的机制，本研究以1份耐低温(MD)和1份低温敏感(QZ)木豆为试验材料，经4℃低温胁迫处理后进行RNA-seq测序分析，结果表明：2份木豆RNA-seq获得了丰富的转录本信息，对转录因子和差异表达基因的基因功能进行注释。木豆响应响应低温胁迫的转录因子主要包括MYB，AP2-EREBP等；在两份材料中，GO分析发现DEGs注释在细胞组成中“膜”和生物学过程中“细胞过程”，KEGG分析均显著富集在“核糖体”通路中，而MD中还显著富集在植物激素信号转导、昼夜节律-植物等通路。通过两份材料对比，在MD材料中发现特有与耐低温相关的150个DEGs，主要为α-1，4-葡萄糖苷酶，参与碳水化合物、脂质代谢等途径。还筛选37个与耐寒相关重要差异表达基因和14条通路，并对10个DEGs进行qRT-PCR验证。本文从分子水平阐述了木豆低温胁迫下的响应机制，为未来木豆的抗寒育种奠定了理论基础。     

柑橘TIFY基因的结构特征及响应低温的表达分析

TIFY基因家族是一类包含TIFY结构域的植物特有转录因子,与植物的生长发育密切相关,且在非生物逆境响应中起着重要作用。本研究基于柑橘基因组测序结果,分析了3个TIFY基因家族成员的基因结构特征,并利用qPCR分析了低温胁迫下这些基因的表达水平。结果表明：(1)3个TIFY基因含有TIFY结构域和Jas motif,属于JAZ蛋白亚家族基因;(2)3个TIFY基因的启动子含有LTR、DRE core、STRE、TC-rich repeats等逆境相关顺式作用元件以及MeJA响应元件、ABA响应元件等激素响应相关元件,推测3个TIFY基因可以响应多种非生物胁迫;(3)Cs1g17220和Cs4g07130在果实中高表达,推测其可能与果实发育相关;(4)3个TIFY基因受低温诱导在早期上调表达,且受低温胁迫的程度越大,其受诱导上调表达的倍数越高。本研究将为进一步解析TIFY基因家族在柑橘中的作用和功能提供重要线索。     

基于转录组测序的高羊茅分蘖与株高相关差异表达基因分析

分蘖与株高是禾本科草类植物重要的农艺性状,明确参与调控分蘖与株高的基因类型对牧草和草坪草分子辅助育种具有重要意义。以表型差异明显的两个高羊茅品种“Kentucky-31”（K31）和“Regenerate”为材料,旨在构建高羊茅分蘖节转录组图谱,挖掘在分蘖节部位调控生长发育相关的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。基于高通量测序技术平台Illumina HiSeq 2500×Miseq 300进行转录组测序,并将得到的数据进行de novo组装,结果共获得77872条单基因簇（unigene）。将获得的unigenes与非冗余蛋白数据库（non-redundant protein database,NR）、蛋白质数据库（universal protein,Uniprot）、基因本体数据库（gene ontology,GO）、东京基因与基因组数据库（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）以及直系同源蛋白簇（clusters of orthologous groups,COG）数据库进行比对,结果显示：分别有59927、40213、44447、15146和13767条unigenes成功获得注释。“Regenerate”与“K31”对比有1573个上调DEGs和1441个下调DEGs。GO富集分析发现,DEGs主要富集在细胞、细胞组分、大分子复合物组装等生物过程。DEGs中共注释到42个差异表达转录因子,主要包括TCP、WRKY和ARF等19种类型。还注释到与8类植物激素相关的DEGs,包括生长素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、乙烯、油菜素甾醇、水杨酸和茉莉酸。利用实时荧光定量PCR对DEGs进行表达模式验证,发现其与RNA-Seq测序结果一致,证实了测序结果的准确性。研究结果丰富了高羊茅的转录组序列资源,初步获得控制株高及分蘖发育的候选因子,为进一步开展基因功能及分子育种研究提供了理论支持。     

密毛白莲蒿富集铅的分子机制

本研究以一种可作为牧草的植物——密毛白莲蒿为试验对象,通过添加不同浓度硝酸铅进行铅胁迫,用q-PCR测定相关样品在富集铅过程中的基因表达变化。结果表明,密毛白莲蒿根部和茎叶部组织中存在的YS3、MT基因与铅富集相关,YS3、MT基因的表达受铅胁迫诱导而上调,茎叶部组织中MT基因上调表达量显著高于根部组织(P0.05),根部组织YS3基因上调表达量比茎叶部组织高2.5倍。该研究为进一步明确牧草铅富集的分子机制,提高我国乳品安全水平提供了重要的理论依据。