永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系的建立

[目的]建立永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系,为基础研究和动物病毒的研究提供稳定的体外细胞模型。[方法]采用组织块贴壁法培养绵羊瘤胃成纤维细胞（ovine ruminal fibroblasts cells,ORFCs）,利用PEI试剂将带有hTERT基因的pCI-neo-hTERT质粒转染ORFCs,经G418筛选得到阳性克隆细胞。采用RT-PCR、Western Blot检测F₁₅和F₃₅代阳性克隆细胞的hTERT基因的转录和表达情况;利用血球计数法绘制原代ORFCs和F₃₅代阳性克隆细胞的生长曲线比较其增殖能力。[结果]将hTERT基因成功转入ORFCs并稳定表达;阳性克隆细胞的增殖能力显著高于原代ORFCs。[结论]该试验成功建立了永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系。     

MDCK过表达SV40-LT基因稳定细胞系的构建

细胞永生化使细胞能够在保持遗传性状的同时无限增殖,细胞的体外永生化需要将HPV的E6和E7基因、SV40的LT基因或人端粒酶逆转录酶(hTERT)等导入目标内,而SV40-LT是建立永生化细胞最便捷的基因.本试验利用慢病毒感染方式将SV40-LT导入MDCK细胞中,阳性筛选后经qPCR和免疫荧光实验均检测到SV40-LT的表达,成功建立了利用慢病毒方式导入SV40-LT的实验体系,为后续永生化细胞建系研究提供了技术依据.     

SV40LT抗原介导的蝙蝠胎儿肾细胞永生化

蝙蝠是许多新发人兽共患病病毒的自然储存宿主,由于缺乏蝙蝠细胞系,只能利用其他哺乳动物细胞系来分离蝙蝠病毒,因此成功分离的几率较低。为建立稳定的蝙蝠细胞系,本研究利用胰酶消化法培养东亚水鼠耳蝠(Myotis petax)的胎儿原代肾细胞。利用重组逆转录病毒转导法将SV40 LT抗原基因转导入蝙蝠胎儿原代肾细胞,经嘌呤霉素筛选获得LT基因整合和表达的阳性细胞,并进行连续传代培养。RT-PCR和western blot检测表明转导的细胞中有SV40 LT基因的整合和表达。转导细胞在软琼脂中培养不能够形成克隆,表明其未发生癌性转化。对第33代的转导细胞进行单细胞克隆,获得了3个衍生的细胞系,其中Mp-Ki03细胞系已培养至第60代。病毒感染试验表明蝙蝠西江病毒和蝙蝠轮状病毒均可以感染该转导细胞系。本研究通过SV40 LT抗原建立了永生化的蝙蝠胎儿肾细胞系,并且该细胞系对蝙蝠病毒易感,对分离与鉴定蝙蝠病毒以及研究病毒感染蝙蝠细胞的机制具有重要的作用。     

构建稳定表达JSRV受体Hyal-2小鼠肺上皮细胞系

为了构建稳定表达绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)蛋白的小鼠肺上皮细胞系,试验采用将重组质粒p DsRed-monomer-N1-Hyal-2转染小鼠肺上皮细胞后,用G418对转染后的细胞进行筛选、纯化,通过对不同培养代次的细胞系进行倒置荧光显微镜观察、RT-PCR、基因测序、Western-blot等方法加以验证。结果表明:试验成功构建了JSRV受体Hyal-2蛋白小鼠肺上皮细胞系,在传至20代后Hyal-2仍在该细胞系中稳定表达。说明该细胞系的成功建立,为研究绵羊Hyal-2对JSRV转化目的细胞能力的影响提供了一种体外试验平台。     

慢病毒载体介导的稳定表达eIF5A细胞系的建立及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响

本研究旨在通过慢病毒载体构建稳定表达真核翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145细胞系并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。全基因合成eIF5A序列，双酶切后构建慢病毒表达载体pLV-CMV-MCS-EF1a-Puro。将该载体和慢病毒包装质粒psPAX2与包膜蛋白质粒pMD2.G共转染HEK293T细胞，包装得到能表达eIF5A的慢病毒。将慢病毒转导至MARC-145细胞，经过嘌呤霉素筛选、细胞有限稀释法获得能稳定表达eIF5A的MARC-145细胞系。MTS试验证实构建的细胞系细胞活力无显著变化，病毒TCID₅₀测定、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹和间接免疫荧光技术检测eIF5A稳定表达对PRRSV滴度、PRRSV N基因及N蛋白表达的影响，发现MARC-145-eIF5A细胞系能显著促进PRRSV的增殖。本研究成功构建了稳定表达eIF5A的细胞系MARC-145-eIF5A,PRRSV感染试验证实体外稳定表达eIF5A可以促进PRRSV在MARC-145细胞的...     

永生化绵羊附睾上皮细胞系的建立及其生物学特性分析

旨在建立绵羊附睾上皮永生化细胞系,为进一步研究绵羊附睾功能调节机制提供基础。本研究采用酶消化法分离培养原代绵羊附睾上皮细胞,利用脂质体将pCI-neo-hTERT质粒转入绵羊附睾上皮细胞(SEECs),经G418筛选得到了细胞系hTERT-SEECs,免疫荧光法鉴定其角蛋白18(CK18)和人端粒酶逆转录亚基(hTERT)表达情况;RT-PCR检测其hTERT mRNA的表达;采用CCK-8法绘制细胞生长曲线检测其增殖能力;利用流式细胞仪检测其周期和细胞凋亡情况;核型分析检测其倍体情况;从mRNA和蛋白水平检测其谷胱甘肽过氧化物酶5(GPX5)和雄激素受体(AR)的表达情况。结果显示,原代绵羊附睾上皮细胞呈典型的铺路石状形态。hTERT成功转入绵羊附睾上皮细胞,传45代后,hTERT-SEECs仍呈铺路石状;hTERT-SEECs仍可稳定表达CK18和hTERT,并且拥有正常的二倍体核型;hTERT-SEECs增殖能力高于原代细胞,hTERT-SEECs处于G1期的细胞比例显著低于SEECs(P0.05),处于S期细胞比例显著高于SEECs(P0.05),且其活细胞率显著高于SEECs(P0.05),凋亡率显著低于SEECs(P0.05); hTERT-SEECs和SEECs的GPX5和AR蛋白表达量差异不显著(P0.05)。本研究所建立的hTERT-SEECs经长期培养后仍具有正常的附睾上皮细胞形态,增殖能力强并保留了附睾上皮细胞的生物学特性。     

荧光真核表达载体pEGFP—N1—hTERT的构建及鉴定

采用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切质粒pBABE—hygro hTERT，获取端粒酶催化亚基（hTERT）。将其定向克隆至载体pEGFP-N1，构建重组的荧光真核表达载体pEGFP-N1-hTERT。经双酶切、测序及转染成纤维细胞鉴定均证实hTERT、基因忆拷入pEGFP—N1载体中，成功构建了荧光真核表达载体pEGFP—N1—hTERT。构建的pEGFP-N1-hTERT，为进一步筛选目的细胞和建立永生化细胞系奠定了基础.     

人端粒酶催化亚基和SV40大T抗原永生化猪脐静脉血管内皮细胞

为建立稳定的猪血管内皮细胞系,用于猪瘟病毒(CSFV)的致病机理研究提供理想的细胞模型,本研究利用逆转录病毒分别转导人端粒酶催化亚基(hTERT)基因或SV40大T抗原(SV40 LT)基因进入猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),通过G418或嘌呤霉素筛选阳性克隆,并进行细胞传代研究和细胞形态学及表型鉴定。分别获得了两种方法建立的永生化猪血管内皮细胞系SUVEC-hT和SUVEC-ST。两种细胞系均呈铺路石样单层排列生长,具有高度的增殖活性,在传代70代后不表现任何衰老细胞的特征,并保持接触生长抑制。SUVEC-hT细胞系持续表达hTERT、CD31、CD34和von Willebrand factor,并能摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)。SUVEC-ST细胞系持续表达SV40 LT、CD31和CD34,并能摄取Dil-Ac-LDL。两个细胞系均保持正常的核型并对CSFV敏感。结果表明通过表达外源的hTERT或SV40 LT,SUVEC已被永生化,并且保留了血管内皮细胞的主要生物学特征。     

GDF9慢病毒载体的构建及其在山羊原代成纤维细胞中的稳定表达

试验旨在构建山羊生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）慢病毒载体,并使其在山羊原代成纤维细胞中稳定表达。利用全基因合成法克隆了绵羊GDF9基因的CDS全长片段,长约1 362 bp,编码453个氨基酸。利用双酶切和连接,将GDF9基因片段亚克隆至慢病毒载体中,构建了过表达GDF9的慢病毒载体。将慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞后,获得了滴度为1×10⁶ TU/mL的慢病毒。利用制备的GDF9慢病毒感染山羊原代成纤维细胞后,观察荧光表明,60%以上的细胞能够观察到红色荧光,说明制备的慢病毒对山羊原代成纤维细胞具有较高的感染效率。经过嘌呤霉素筛选后,所有的细胞均能观察到红色荧光。实时荧光定量PCR分析表明,制备的细胞系中GDF9表达水平比对照组高12.17倍,说明成功获得了稳定表达GDF9的山羊成纤维细胞系。本试验结果为进一步研究GDF9基因的生物学功能,以及山羊未来的种质资源创新奠定基础。     

稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）核衣壳（N）蛋白的非洲绿猴肾（Vero）细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。     

抗禽流感病毒(H5N1)入胞单分子抗体过表达慢病毒载体的构建及其稳转细胞株的建立

构建过表达抗禽流感病毒(H5N1)M1蛋白入胞单分子抗体(TAT-ScFv-mFc)的慢病毒载体,筛选获得稳定表达TAT-ScFv-mFc的HEK293T稳转细胞株。PCR扩增目的基因,将其插入质粒pLVX-mCMV-ZsGreen1-Puro中,构建pLVX-TAT-ScFv-mFc-ZsGreen1-Puro慢病毒过表达质粒,对重组质粒进行慢病毒包装后使用转染试剂复合物转染HEK293T细胞系,并使用嘌呤霉素(Puro)筛选阳性表达细胞,经过扩大培养及裂解后,以ProteinG纯化目的蛋白并对蛋白纯品进行鉴定。Western blot检测结果显示,成功获得了稳定表达TAT-ScFv-mFc的HEK293T细胞株。ELISA、SDS-PAGE、BCA结果显示成功获得预期目的蛋白2 mL(0.39 g/L)。结果表明,本研究成功建立了稳定表达抗H5N1病毒抗体的293T细胞系,为进一步研究TAT-ScFv-mFc的功能结构奠定了基础,也同时为真核表达系统的抗体制备研究提供了参考依据。     

hTERT永生化细胞的研究进展及应用前景

人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)诱导的永生化细胞兼具原代细胞的生物学特性和传代细胞系连续传代的能力,是一种理想的细胞来源,在基础研究、临床应用和生物工程领域具有无可比拟的优势。本文主要就hTERT永生化细胞的研究进展及应用前景作一综述。     

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的BHK细胞系的构建

猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。     

稳定表达猪SAMHD1蛋白的MARC-145细胞系构建与鉴定

SAMHD1作为宿主的天然免疫限制性因子,参与机体的天然免疫调控,在机体抗病毒感染过程中发挥重要的作用。为了建立稳定表达猪SAMHD1的细胞系,本研究将猪SAMHD1全长编码基因克隆至慢病毒载体pWPXL,构建重组质粒pWPXLpSAMHD1。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染MARC-145细胞,经嘌呤霉素筛选后,获得表达猪SAMHD1基因的MARC-pSAMHD1细胞系。经检测发现,该细胞系传至10代,仍能稳定表达猪SAMHD1蛋白。该细胞系的建立为猪SAMHD1抗病毒特性和猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理等研究奠定了坚实的基础。     

东方田鼠皮肤成纤维永生化细胞的建立

为建立东方田鼠皮肤成纤维细胞(MfSF)系,本研究采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的pSV3neo重组质粒导入原代MfSF中,通过G418筛选,阳性克隆扩大培养,建立永生化MfSF系.实验结果表明,阳性细胞克隆在G418筛选第三周后出现,经扩大培养已稳定传代达42代,而且生长状态良好,PCR及RT-PCR检测结果表明,SV40 T基因已整合到MfSF中并稳定表达.本研究利用SV40 T基因导入制备了永生化MfSF细胞系,为动物间成纤维细胞比较研究及相关病原的研究提供了敏感细胞系.     

表达PRRSV N蛋白稳定细胞系的构建与鉴定

旨在通过慢病毒表达系统构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) N蛋白的Marc-145细胞系。以PRRSV SH1株感染性克隆质粒为模板，通过PCR扩增N基因，并将其克隆到慢病毒载体中，获得重组慢病毒质粒pSin-Ires-Puro-N,将重组质粒pSin-Ires-Puro-N与辅助质粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共转染293T细胞进行慢病毒包装，获得表达N蛋白的重组慢病毒颗粒并将其感染Marc-145细胞，嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，筛选几代后的细胞采用有限稀释法和终点稀释法获得稳定表达N蛋白的Marc-145细胞系。通过PCR鉴定表明细胞系中存在N蛋白基因，通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验验证N蛋白能在细胞系中能稳定表达。本研究成功构建了稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系，为研制PRRSV新型复制缺陷型疫苗奠定基础。     

蒙古马胎儿成纤维细胞永生化细胞体系建立的研究

【目的】试验旨在建立永生化蒙古马胎儿成纤维细胞(equine fetal fibroblasts, EFFs)系,为马繁殖与发育生物学研究提供参考。【方法】采用1 mg/mL胶原酶Ⅳ消化分离原代EFFs,利用表达人端粒酶逆转录亚基(hTERT)和潮霉素B抗性的pLV-hTERT-IRES-hygro慢病毒感染EFFs,经潮霉素B筛选得到阳性细胞hTERT-EFFs,以第3代EFFs为对照,采用实时荧光定量PCR检测hTERT mRNA的表达水平,CCK-8法绘制生长曲线检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况。使用DNAMAN软件比对分析人、马、小鼠、牛、绵羊、猪多物种TERT核苷酸、蛋白和端粒酶RNA组分(TERC)序列相似性。【结果】原代EFFs在实验室培养体系下可传至17代,但第17代细胞发生了衰老。hTERT基因可成功转入EFFs,并至少稳定表达20代。然而hTERT-EFFs增殖能力显著低于EFFs(P<0.05),hTERT-EFFs凋亡早期细胞率显著高于EFFs(P<0.05)。细胞衰老检测结果表明,hTERT-EFFs...     

稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系的建立

为建立稳定表达施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳(N)蛋白的BHK-21细胞系,本研究在SBV-N蛋白编码基因的C端加入6个组氨酸(6×His)标签,将其克隆至慢病毒载体p LV-EGFP-C中构建重组慢病毒质粒p LV-EGFP-SBV-N,将其与慢病毒包装质粒p Helper1.0和p Helper2.0共转染HEK-293T细胞,包装表达SBV-N蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染BHK-21细胞,采用嘌呤霉素(Puromycin)法和细胞有限稀释法筛选出一株稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系,命名为BHK-21-EGFP-SBV-N。间接免疫荧光试验进一步表明,该细胞系能够被SBV抗体阳性动物血清和特异性单克隆抗体2C8识别。稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系的建立,为SBV血清学检测方法的建立提供材料。     

稳定表达非洲猪瘟病毒E165R蛋白PK 15细胞系的构建

旨在构建稳定表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)E165R蛋白的PK 15细胞系。ASFV E165R基因经PCR扩增连接到p3×FLAG-CMV-10载体，再由同源重组连接克隆到慢病毒载体得到重组质粒V2-FLAG-E165R。在HEK 293T细胞中进行慢病毒包装得到慢病毒颗粒并转导至PK 15细胞中，经嘌呤霉素初筛得到的多克隆细胞，接着以终点稀释法筛选获得稳定表达E165R蛋白的单克隆PK 15细胞系。通过PCR扩增、Western blot和间接免疫荧光鉴定构建的PK 15细胞系，进一步利用RT-qPCR技术检测NF-κB及炎症相关基因P65、IKBa、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平。结果表明，稳定过表达ASFV E165R蛋白的PK 15稳定细胞系构建成功，与对照细胞系相比，E165R蛋白显著增强NF-κB以及炎症相关基因IL-6、IL-8和TNF-α的基因表达。本结果为后续研究ASFV E165R对先天免疫信号通路的影响提供生物材料。