蓝塘猪与长白猪背最长肌全基因组DNA甲基化分析

【目的】分析蓝塘猪与长白猪背最长肌组织全基因组DNA甲基化水平,筛选2个猪品种的差异甲基化基因（DMG）,为优质肉猪选育提供理论依据。【方法】利用全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）技术,分析1日龄雄性蓝塘猪与长白猪背最长肌组织全基因组DNA的甲基化水平、差异甲基化区域（DMR）和DMG,并对DMG进行GO注释,揭示蓝塘猪与长白猪差异甲基化基因的功能。【结果】蓝塘猪和长白猪样本测序获得的原始序列数量分别为300 005 805和300 012 190条,有效序列数量分别为210 334 070和210 758 564条,有效序列与猪参考基因组的比对成功率分别为70.11%和70.25%,Bisulfite转化率分别为98.54%和98.36%。蓝塘猪全基因组范围内胞嘧啶（C）的甲基化率为4.07%,其中CG、CHG和CHH中胞嘧啶的甲基化率分别为74.50%,1.74%和1.51%;长白猪全基因组范围内胞嘧啶的甲基化率为4.44%,其中CG、CHG和CHH中胞嘧啶的甲基化率分别为76.92%,2.13%和1.87%。共检测出13 126个差异性甲基化区域,总长度为3 357 954 bp,含有78 234个胞嘧啶。68.50%的差异性甲基化区域分布在基因间区,25.74%分布在内含子,1.89%分布在外显子,1.85%分布在上游2 kb区域,1.78%分布在下游2 kb区域,0.24%分布在CpG岛。甲基化差异基因显著富集于凋亡过程的负调控、细胞迁移的正调控等24个GO条目,其中FAM135B、NR1H2、ID4、ZFPM2、FOXO1等５个基因与蓝塘猪和长白猪的脂肪代谢相关,长白猪FAM135B、NR1H2、ZFPM2和FOXO1的表达水平高于蓝塘猪,而ID4略低于蓝塘猪。【结论】明确了蓝塘猪和长白猪背最长肌组织全基因组DNA的甲基化情况,为深入研究2个猪种肉质差异的分子机制提供了基础数据。     

槐猪和杜洛克猪背最长肌差异表达基因的筛选与注释

为了筛选槐猪和杜洛克猪背最长肌中的差异表达基因,对槐猪和杜洛克猪背最长肌进行转录组测序,并进行生物信息学分析.结果表明,槐猪和杜洛克猪分别获得36 177 844和34 496 450条可用读段,且与猪参考基因组的比对率分别为78.71%和80.09%.槐猪和杜洛克猪间共有953个差异表达基因,以杜洛克猪为对照组,槐猪与之相比,有589个上调基因和364个下调基因.槐猪和杜洛克猪的差异表达基因共分类到48个基因本体(GO)条目中,其中,细胞组分13个、分子功能12个和生物学过程23个.显著富集的KEGG通路共计6个,其中,PPAR信号通路是与调节脂类代谢显著相关的通路.     

基于RNA-seq技术对不同品种猪背最长肌差异表达基因的筛选与注释

【目的】筛选皖南花猪和大约克猪背最长肌组织差异表达基因。【方法】采集皖南花猪和大约克猪背最长肌(各3头),测定其肉质性状指标,并提取其RNA,采用高通量转录组测序(RNA-seq)技术进行测序,对所获序列进行GO和Pathway显著性富集分析。【结果】测序后皖南花猪3个样本得到的总序列数分别为65 584 126,64 327 738和59 244 502,其中有效序列达到94.4%,94.3%和94.2%;大约克猪3个样本得到的总序列数分别为57 969 134,68 254 168和72 298 142,其中有效序列达到93.8%,93.7%和93.8%。测序饱和度良好,证明测序数据真实可靠。差异表达分析结果显示,共筛选到347个差异表达基因,其中包含94个上调基因,253个下调基因。GO功能显著性富集和Pathway显著性富集分析发现,差异表达基因富集在与糖酵解代谢和肌肉发育相关的生物学过程中以及与脂肪酸代谢和生长性状、胴体性状相关的信号通路上。【结论】获得了猪背最长肌组织基因表达谱,筛选出了一些与肉质性状和生长性状有关的候选基因。     

猪心肌和骨骼肌miRNA转录组比较分析

【目的】研究microRNA(miRNA)在猪不同类型肌肉生长发育中的作用。【方法】以猪心肌以及2种骨骼肌(背最长肌和腰大肌)为材料,采用Illumina高通量测序技术鉴定其miRNA转录组,并进行差异表达分析和靶基因富集分析。【结果】从猪心肌、背最长肌和腰大肌组织的3个小RNA测序文库中共获得约56M的序列,通过生物信息分析共鉴定出907个非冗余miRNA,其中441个miRNA在3个文库共同表达,123个miRNA在文库间表现为显著的差异表达(P10-6)。对3个文库差异表达miRNA的相关性分析发现,背最长肌与腰大肌的相关性最高(r=0.94),证明2种骨骼肌的表达模式十分相近,而心肌与2种骨骼肌的表达模式不同。通过对各文库高表达的miRNA分析发现,表达量前十的miRNA中有6个miRNA的表达量在心肌中极显著上调。对在心肌内上调的6个miRNA进行的靶基因预测和生物学功能预测发现,这些差异miRNA主要靶向作用于钙信号通路和胰岛素信号通路。荧光定量PCR(qRT-PCR)验证结果表明高通量测序结果准确可靠。【结论】从miRNA层面揭示了猪心肌和骨骼肌的差异,这种差异在一定程度上印证了心肌和骨骼肌之间迥异的生理学特征。     

重度冷应激下民猪背最长肌应答分子调控网络分析

为解析家猪在重度冷应激下骨骼肌应答反应的分子机制,本研究利用民猪的重度冷应激模型结合RNA-seq测序技术,对遭受重度冷应激后民猪背最长肌的基因和lncRNA的表达变化、功能注释以及两者间的调控关系进行了分析。结果表明：1）民猪在遭受3d的重度冷应激（-17℃～-26℃）后,背最长肌的53个基因发生了显著上调表达,35个基因发生了显著下调表达;53个lncRNA发生了显著上调,38个lncRNA发生了显著下调。差异表达基因中有多个与炎症反应相关的基因,如AREG、HAS1、MMP25和SLC11A1等基因发生了显著上调表达;与低温胁迫相关的TREH和与应激反应相关的TRIB3、与碳水化合物、葡萄糖和脂质代谢相关的HGFAC等基因也发生了显著上调表达。2）差异表达基因所参与的生物过程主要集中在胶原代谢、伤口愈合表皮细胞扩散和肌肉肥大调节过程等,且多位于细胞外区间;差异表达基因显著富集的生物学通路仅1个MAPK通路。3）存在显著表达差异的91个lncRNA顺式调控129个基因,反式调控750个基因,lncRNA与靶基因间的互作关系复杂。预测到的靶基因显著富集到MAPK和TNF 2个生物学通...     

近红外光谱仪测定东北民猪眼肌肌肉组分的研究

试验旨在探讨近红外仪光谱仪应用于测定猪眼肌肉质指标分析的可行性.利用TQ Analyst分析软件采用偏最小二乘回归(PLS)方法建立蛋白质、水分、粗脂肪和脂肪酸含量的定量检测模型.结果表明,蛋白质的相关系数达到0.98、SD/RMSEP达到3.9;水份的相关系数达到0.97、SD/RMSEP达到3.67;肌内脂肪的相关系数达到0.96、SD/RMSEP达到3.75;脂肪酸中C18:2相关系数达0.92、SD/RMSEP达到3.27,PUFA相关系数达0.92、SD/RMSEP达到3.65.结果表明,采用近红外光谱法能同时检测猪眼肌中蛋白质、水份、肌内脂肪和脂肪酸含量,检测误差小、结果准确可靠,与化学分析方法无明显差异且重现性好,可应用于猪眼肌肉组分指标快速定量检测.     

二花脸猪和大白猪背最长肌中肌肉生长抑制素和生肌调节因子基因的表达及其性别特点

用相对定量RT—PCR方法研究大白猪和二花脸猪背最长肌中肌肉生长抑制素（Myostatin）和生肌调节因子（Myo—genin）基因表达的发育性变化并进行品种及性别间比较。研究结果表明：大白猪公猪Myostatin mRNA表达水平在20日龄时达到高峰且显著高于相同日龄二花脸公猪（P〈0．05）,而二花脸公猪在45日龄时才显著升高,其他日龄品种间差异不显著。二花脸公猪和母猪出生后Myostatin mRNA表达水平均表现为上升,45日龄时达到高峰,120日龄时公母猪间差异显著（P〈0．05）。二花脸公猪与大白猪公猪Myogenin mRNA的表达发育模式基本相同,均在20日龄达到最高值,品种问差异不显著。90日龄二花脸母猪Myogenin mRNA表达水平较公猪显著下调（P〈0．05）。结果提示,猪背最长肌中Myostatin和Myogenin基因表达水平在猪出生后早期均较高,但没有出现随着日龄的增加而一直升高或降低的趋势;两种基因的表达在20日龄出现品种间差异;性成熟前后二花脸公母猪间表达有差异。     

猪IGF2 Intron3 G3072A突变及其在背最长肌中差异表达

采用错配PCR-RFLP法检测胰岛素样生长因子2基因(IGF2)内含子3的G3072A位点变异对长×大杂交猪肌肉生长和脂肪沉积的影响,并采用实时荧光定量PCR法分析该变异对出生后的长×大杂交后代猪背最长肌中IGF2mRNA表达发育性变化的影响。结果显示:IGF2内含子3的G3072A位点变异(G→A)对猪背膘厚和活体瘦肉率均存在显著或极显著影响,表现为遗传父本A等位基因的个体能够增加活体瘦肉率和减少背膘厚;在长×大杂交后代的背最长肌中,IGF2mRNA的表达量在遗传父本A等位基因的个体中显著高于遗传父本G等位基因的个体,在42和180日龄时达显著水平(P<0.05),而在70、90和120日龄时达极显著水平(P<0.01)。     

MicroRNA-22 inhibits proliferation and promotes differentiation of satellite cells in porcine skeletal muscle

Pig is an important economic animal in China. Improving meat quality and meat productivity is a long time issue in animal genetic breeding. Micro RNAs(mi RNAs) are short non-coding RNAs that participate in various biological processes, such as muscle development and embryogenesis. mi R-22 differentially expresses in embryonic and adult skeletal muscle. However, the underlying mechanism is unclear. In this study, we investigated mi R-22 function in proliferation and differentiation of porcine satellite cells(PSCs) in skeletal muscle. Our data show that mi R-22 expressed in both proliferation and differentiated PSCs and is significantly upregulated(P0.05) during differentiation. After treated with the mi R-22 inhibitor, PSCs proliferation was significantly increased(P0.05), as indicated by the up-regulation(P0.01) of cyclin D1(CCND1), cyclin B1(CCNB1) and down-regulation(P0.05) of P21. Conversely, over-expression of mi R-22 resulted in opposite results. Differentiation of PSCs was significantly suppressed(P0.05), evidenced by two major myogenic markers: myogenin(Myo G) and myosin heavy chain(My HC), after transfecting the PSCs with mi R-22 inhibitor. Opposite results were demonstrated in the other way around by transfection with mi R-22 mimics. In conclusion, the data from this study indicated that mi R-22 inhibited the PSCs proliferation but promoted their differentiation.     

基于全基因组重测序分析藏猪骨骼肌发育相关基因

为从全基因组水平探索影响藏猪骨骼肌发育的遗传变异,本研究对5头迪庆藏猪进行全基因组重测序,并合并NCBI数据库中来自3个省的藏猪、与藏猪同样小体型及生长慢的巴马香猪、及体型大且生长快速的杜洛克和大白猪共70个猪只的全基因组重测序数据进行整合分析,获得全基因组SNP后结合选择信号检测与等位基因频率(AF)分析鉴定藏猪-香猪与杜洛克-大白猪的遗传差异;利用GO和KEGG功能富集分析藏猪骨骼肌转录组与蛋白组相关基因。结果发现:1)2 211个基因在藏猪-香猪与杜洛克-大白猪2个比较组中存在遗传差异,138个基因富集到骨骼肌发育相关的GO功能集及KEGG通路;2)9个基因(UCHL3、POSTN、COL12A1、PGK1、JPH1、GPT2、RBFOX1、FLNB和DCX)已报道参与藏猪60 d胚胎背最长肌发育调控,1个(CKM)参与6月龄藏猪背最长肌发育调控;3)10个基因共包含936个SNP,其中655个SNP位于基因间区,255个是内含子变异,少量SNP是外显子及调控区变异。本研究从全基因组水平鉴定了与藏猪骨骼肌发育相关基因及其遗传变异,为以后持续深入解析藏猪骨骼肌发育的遗传机制提供参考。     

秦川牛胎儿骨骼肌卫星细胞的分离培养

【目的】探索胎牛骨骼肌卫星细胞分离、培养、鉴定及基因转染的方法。【方法】分别采用Ⅰ型胶原酶消化、Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化及链霉蛋白酶消化法对胎牛骨骼肌卫星细胞进行培养,比较了3种不同分离方法所得细胞数及其存活率的差异;利用差速贴壁法和Percoll密度梯度离心相结合的方法纯化骨骼肌卫星细胞,对纯化后的细胞进行myostatin基因RT-PCR以及结蛋白(Desmin)免疫细胞化学染色鉴定,最后通过电转染法对纯化的骨骼肌卫星细胞进行EGFP基因转染研究。【结果】3种消化培养方法中,以链霉蛋白酶消化法分离得到的胎牛骨骼肌卫星细胞数显著高于其它2种方法(P0.05),但细胞存活率较低(P0.05);而采用Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化法可以得到相对较高的细胞数及存活率。利用差速贴壁和Percoll密度梯度离心相结合的方法可以得到纯化的骨骼肌卫星细胞;电转染法适用于骨骼肌卫星细胞的基因转染。【结论】建立了胎牛骨骼肌卫星细胞分离、培养、纯化、鉴定及基因转染的方法,为通过转基因方法改良秦川牛产肉性能研究奠定了基础。     

基于全转录组测序的绵羊胚胎不同发育阶段 骨骼肌circRNA的分析与鉴定

【目的】肉用性状是家养动物的重要性状,尤其是产肉性能与骨骼肌的发育密切相关,对多数动物而言,骨骼肌的生长取决于肌纤维的早期发育。本研究将揭示绵羊（Ovis aries）胚胎期骨骼肌组织发育重要节点、肌纤维的形成及转换机制,探究骨骼肌在动物胚胎期的生长对后续发育潜力的影响。【方法】在前期绵羊胚胎期组织结构试验的基础上,选择肌纤维发育及类型转换的3个重要时间节点：胎龄85 d（D85）、105 d（D105）、135 d（D135）,并对处于这些节点期的中国美利奴绵羊胚胎背最长肌进行全转录组测序。通过生物信息学分析和功能预测筛选出差异表达显著的circRNA,采用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）对其进行验证。【结果】通过条件筛选（|log2| ≥1且P≤0.05）获得差异表达circRNA 1 126个。将3组进行比较,在各时间节点都发现较多的特异性表达circRNA。在D85 vs D135比较组中,特异性差异表达数量最多：共发现差异表达circRNA 374个,上调表达201个,下调表达173个,其中具有4倍以上差异的基因167个,占差异基因的44.7%。对这些差异性表达的circRNA进行GO和KEGG功能分析和靶向预测,富集到与肌肉分化和肌纤维发育相关的能量代谢和信号转导通路,包括MAPK、PI3K-Akt、Ras、Regulation of actin cytoskeleton等。结果表明：在D85至D105期间富集到的差异circRNA多与肌细胞发育调控、细胞增殖和存活、细胞周期等相关,而在D105至D135期间富集到的通路则主要与能量转换、物质运输、RNA转运和DNA修复有关。靶向预测结果通过Cytoscape软件绘制出可视化共表达网络,筛选到circRNA8239、circRNA19073,circRNA2765、circRNA1616等核心调控转录物,并在D105找到调节快慢肌类型转换的关键因子circRNA7527,其靶向作用于bta-miR-135a、bta-miR-615、chi-miR-133a-5p进而调控MEF2C基因。通过3个时间节点的差异表达情况和功能预测描述选取了与肌肉发育相关的4个核心circRNA和其靶向的4个miRNA进行qRT-PCR分析,其基因表达趋势与测序数据一致。【结论】本试验在转录水平上验证了绵羊胚胎发育D85至D105是肌纤维数量的稳定发生期,而D105至D135则是肌纤维的肥大期,由此推断D105可能是绵羊胚胎发育的关键时间窗口。本研究首次基于全转录组测序构建了绵羊胚胎期骨骼肌发育的circRNA图谱,揭示了不同发育阶段的转录组差异,并对绵羊胚胎骨骼肌发育期间重要的调控因子进行挖掘和验证,发现了以MEF2C为靶基因的多个circRNA和miRNA参与MAPK信号通路,为绵羊肌纤维发育分子机制以及其它家畜非编码RNA的研究提供了参考。     

肌纤维类型组成对猪肌肉品质与能量代谢的影响研究进展

肌纤维是肌肉组织的基本结构单位,通过改变肌纤维类型组成提高肌肉品质是当前的研究热点之一.成年哺乳动物骨骼肌肌纤维类型按肌球蛋白重链基因(MyHC)的多态性表达可分为Ⅰ、2a、2x、2b型4种类型,Ⅰ、2a型属偏氧化型肌纤维,2x、2b型属偏酵解型肌纤维.动物出生前,肌纤维MyHC异构体一般表达为胚胎型、胎儿型、Ⅰ和2a...     

运输应激猪骨骼肌中热应激蛋白HSP70和HSP90家族的表达

利用Western blot技术，检测长途运输试验猪骨骼肌（背最长肌和臀长肌）中分属于HSP70家族和HSP90家族的4种应激蛋白（HSP70，HSP72，HSP86和HSP90）的表达，所有运输应激猪和对照猪肌肉组织 中均检测到了上述4种HSP，对照猪组织中HSP的表达说明HSP除了在受应激 的细胞内行使生理功能外，还具有独立于应激刺激应答以外的其它作用，6h长途运输后，HSP的表达量明显不同，HSP70和HSP72在肌肉组织中的表达虽然有一定的增加，但统计学分析差异不显（P＞0．05），而HSP86和HSP90在骨髓肌中的表达明显下降，尤以HSP90下降最显（P＜0．01），提示HSP90家族成员与肉品品质相关，可能作为判应激损伤的的指征。     

饲粮水平对猪IMF含量、脂肪酸合成酶mRNA表达量及血液激素含量的影响

试验选用84头10 kg左右杜洛克×长白×大约克(DLY)三元杂交阉公猪,随机分成2组,组内设6个重复,每个重复7头猪,研究了在NRC(1998)标准(对照组)、荣昌猪(GB 7223-1987)饲养标准(试验组)2种饲粮条件下营养水平对DLY猪生长肥育期背最长肌I MF含量、HSL及FAS mRNA表达量和血液激素含量的影响。结果表明:降低饲粮营养水平可降低35、80及110 kg DLY猪血清胰岛素含量和35及80 kg猪生长激素含量;同时可升高20、50及110 kg DLY猪血清肾上腺素含量和35、50及110 kg DLY猪胰高血糖素含量。各阶段试验组背最长肌肌内脂肪含量均高于对照组,DLY猪50 kg时达到了显著水平;除50 kg组外,其余各阶段试验组背最长肌HSL mRNA及FAS mRNA表达量均高于对照组;降低饲粮营养水平有升高20、35及80 kg DLY猪FAS mRNA/HSL mRNA的趋势。     

高原雨点鸽与詹森鸽胸肌转录组差异表达基因筛选与功能分析

筛选高原雨点鸽与詹森鸽胸肌飞行能力差异的关键基因,为赛鸽选育奠定基础.选择性别相同、体况与日龄相近的高原雨点鸽、詹森鸽各3只,屠宰后取胸肌,进行转录组测序,筛选差异表达基因,对差异基因进行Gene Ontology(GO)分析、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分...     

鸡长链非编码RNA发掘及组织特异性表达分析

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)是一类长度大于200个核苷酸、缺少蛋白编码功能的RNA。lnc RNA可从多层面调控基因表达,影响表型性状。鸡作为重要经济动物和模式生物,lnc RNA研究相对滞后。为加快鸡lnc RNA研究进展,利用公共数据库(如NCBI-SRA等)中鸡高通量转录组测序(RNA-seq)数据,通过生物信息学方法发掘8 040条鸡lnc RNA,发现大量组织特异性表达lnc RNA,为鸡lnc RNA功能研究奠定基础。     

乙二胺四乙酸钠、能量基质、氨基酸对猪卵母细胞体外成熟和早期孤雌发育的影响

猪的卵巢卵母细胞在含不同剂量葡萄糖+丙酮酸钠的成熟培养基中体外成熟培养44-48 h,检查核成熟率(试验一),进行化学法孤雌激活后,在含不同浓度的乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na)和不同剂量的葡萄糖+谷氨酰胺+牛磺酸+亚牛磺酸的培养基中进行体外培养,检查孤雌激活胚第48小时的卵裂率和第168小时的囊胚发育率(试验二),研究成熟培养基中葡萄糖+丙酮酸钠剂量对卵母细胞体外成熟核成熟率的影响及培养基中不同浓度EDTA-Na和葡萄糖+谷氨酰胺+牛磺酸+亚牛磺酸的剂量对孤雌激活胚胎体外发育的影响.结果表明:(1)葡萄糖+丙酮酸钠在1倍剂量时,猪卵母细胞体外成熟的核成熟率为(59.3±5.0)%;当剂量加倍时,核成熟率极显著下降(P<0.01),为(51.0±4.4)%.(2)当EDTA-Na浓度增高,囊胚发育率上升,当浓度达50μmol.L-1时囊胚发育率最高,为(7.2±4.1)%,此后随浓度升高囊胚发育率下降;添加适当浓度(25-100μmol.L-1)EDTA-Na对猪孤雌激活胚的囊胚发育有利(P<0.05),当浓度达200μmol.L-1时其有利作用消失.(3)培养基中葡萄糖+谷氨酰胺+牛磺酸+亚牛磺酸的剂量过高对卵裂率无显著影响(P>0.05),但对囊胚发育不利(P<0.05).可见:(1)适当浓度(25-100μmol.L-1)EDTA-Na对猪早期胚胎体外发育具有促进作用;(2)成熟培养基中能量基质剂量过高会抑制猪卵母细胞体外成熟;(3)胚胎培养基中葡萄糖+谷氨酰胺+牛磺酸+亚牛磺酸的剂量过高会抑制猪早期胚胎的体外发育.