紫斑牡丹表型性状与SSR分子标记的关联分析

利用筛选出的11对多态性简单重复序列(SSR) 标记对99份紫斑牡丹材料进行多态性扫描,在分析其遗传多样性和群体结构的基础上,采用TASSEL2.1软件的一般线性模型(GLM)进行标记与32个观赏性状的关联分析。结果表明:11个多态性SSR标记共检测到94个等位变异,平均每个位点检测到等位变异8.5个;引物的多态性信息含量(PIC)变幅为0.146~0.850,平均值为0.593;遗传多样性变幅为0.152~0.862,平均为0.630。群体结构分析将供试材料划分为3个亚群;通过关联分析,发现5个标记位点与6个性状显著关联(P＜0.01),各标记位点对表型变异的解释率为30.4%~55.8%,其中FJ024285和FJ024294标记与株高相关联,FE528073与顶小叶长、柱头颜色和房衣颜色相关联,FJ024287与柄叶比相关联,EU678295与色斑大小相关联。研究表明:所选紫斑牡丹种质资源群体的群体结构简单、遗传变异较为丰富,适用于紫斑牡丹目标性状的关联分析。关联分析能够有效地找到与紫斑牡丹表型性状紧密连锁的SSR标记,用于分子标记辅助育种。      

亚麻EST-SSR标记开发

为了进一步开发利用现有亚麻EST-SSR资源,从NCBI公共数据库下载7 947条亚麻EST,去除低质量和冗余序列后,筛选得到含有SSR的序列共239条,检出率为3.0%。其中二核苷酸重复49条,共7个重复类型;三核苷酸重复160条,共41个重复类型;四核苷酸重复30条,共11个重复类型。根据不同的重复类型共设计65对EST-SSR引物,在20份材料PCR扩增检测结果表明,有52对引物有目的扩增产物,其中32对扩增条带清晰且具有多态性,占设计引物的49.2%,通过聚类分析可将20份亚麻材料划分为五大类,验证了EST-SSR分子标记在亚麻遗传多样性分析中应用的可行性。     

基于EST-SSR的福建地区茶树资源遗传多样性和亲缘关系分析

 【目的】通过对福建地区茶树资源进行遗传多样性和亲缘关系分析,为今后茶树亲本选择或遗传改良等提供依据。【方法】利用中国农业科学院茶叶研究所茶树分子生物学实验室新开发的23对和他人3对共26对EST-SSR引物对福建省的42份茶树种质资源进行PCR扩增,在所得相似系数的基础上进行UPGMA聚类,并绘制亲缘关系树状聚类图。【结果】26对引物共检测到等位位点86个,每个引物为2～5个,平均3.31个;遗传多态性信息含量（PIC）在0.05～0.75,平均值为0.56。期望杂合度（He）大小在0.02～0.81,平均值为0.60;观测杂合度（Ho）在0.02～0.97,平均值为0.55;群体内的Shannon指数为1.16。按相似系数为0.40可将参试的42份种质资源分为两大类。【结论】研究发现福建地区茶树资源具有相对较高的遗传多样性,并明确了不同资源间的亲缘关系。     

基于簇毛麦No.1026转录组的SSR序列分析及其PCR标记开发

【目的】 探究从前苏联引进的簇毛麦No.1026（Dv#4）的EST-SSR序列特征及其在染色体的分布,分析它们在不同簇毛麦间及与小麦间的多态性,为其进一步的研究与利用提供依据。【方法】通过Illumina HiSeq测序获得No.1026植株的转录组序列,利用MISA软件分析转录组SSR序列及特征,采用Primer 3设计SSR引物,随机合成238对引物,对小麦中国春与簇毛麦Dv#4和引自英国剑桥的簇毛麦Dv#2的基因组DNA进行扩增,在琼脂糖凝胶上分离评价扩增产物的多态性,并利用一套小麦-簇毛麦异染色体系进行扩增分析。【结果】 检测了No.1026总长62.76 Mb的转录组序列,发现10 497个SSR位点,它们分布于8 735条Unigene上。在1—6个核苷酸的重复单元中,单、双、三碱基的重复占95.85%,其中三核苷酸串联重复数量最多,占SSR总数的50.33%,而CCG/CGG基序的重复占三核苷酸串联重复的41.66%;单核苷酸重复是第二大类型,出现频率为27.13%,其中A/T重复占单核苷酸重复的74.58%。二核苷酸重复类型的数量位列第三,占SSR总数的18.39%。在238对EST-SSR引物中,88对在中国春与簇毛麦（包括Dv#2和Dv#4）之间的扩增产物显示多态性;8对只在簇毛麦和单一异染色体系扩增;4对可在簇毛麦和多个异染色体系中特异扩增;但多数可在簇毛麦中清晰扩增的引物不能在任何异染色体系中扩增,推测可能与簇毛麦基因组及染色体导入小麦过程中的变异有关;47对（19.74%）在2份不同来源的簇毛麦Dv#2和Dv#4之间的扩增产物呈现多态性。利用1对EST-SSR引物和1个EST-PCR标记检测48个簇毛麦植株,证明多态性的SSR引物可有效用于检测簇毛麦的异质性。【结果】 簇毛麦No.1026（Dv#4）的转录组中存在丰富的SSR序列,其中CCG/CGG、A/T和AG/CT等三核苷酸、单核苷酸和二核苷酸是其最主要的串联重复基序。部分EST-SSR的侧翼保守序列与单一或若干外源染色体特异相关联,据此开发特异的分子标记,可用于跟踪检测小麦背景中特异的簇毛麦染色体或染色体片段。Dv#4与Dv#2间的部分EST-SSR具有多态性,提示2份不同来源簇毛麦的表达序列间存在一定程度的遗传差异,因此,簇毛麦Dv#4值得进一步的发掘研究。     

荔枝EST资源的SSR信息分析及EST-SSR标记开发

 【目的】明确荔枝EST序列中SSR的总体特点,开发荔枝EST-SSR引物,为利用EST-SSR分子标记进行荔枝种质资源遗传多样性、连锁图谱构建及亲缘关系研究奠定基础。【方法】应用SSRIT软件,按照设定标准从自行构建的一个荔枝果皮发育关键期的cDNA文库中的1 331条Unigene（惟一序列）中搜索SSR位点。利用软件Primer primer5.0设计EST-SSR引物。选用16份表型差异较大的荔枝种质资源检测引物的有效性及多态性,利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行片段分离。【结果】荔枝的1 331条EST序列中共搜索出220个SSR位点,分布于189条EST中,出现频率是16.53%。这些EST-SSR的平均长度为18.43 bp,平均分布频率1/4.42 kb。在1—6 bp的重复基元中,二核苷酸和三核苷酸重复类型占主导地位,共占总SSR的69.09%,二者出现的频率分别为37.27%和31.82%。共观察到72种重复基元,出现频率最高的是GA/TC（16.82%）;其次是AG/CT、A/T、AT/TA及GAA/TTC,频率分别为14.55%、11.82%、5.00%和3.64%。不同核苷酸数目的重复基元的重复次数差异很大。设计、合成150对EST-SSR引物,122对（81.33%）引物在荔枝中获得有效扩增,100对引物具有多态性。【结论】荔枝EST资源中含有高频率的SSR位点,且EST-SSR 标记开发效率较高。本研究为利用EST-SSR标记开展荔枝遗传研究提供了100 对EST-SSR引物,并为进一步开发荔枝EST-SSR标记提供了含SSR位点的候选序列。     

豌豆EST-SSR标记在蚕豆中的通用性与应用

对豌豆表达序列标签-微卫星(EST-SSR)分子标记在蚕豆中的通用性与应用进行研究,以期为蚕豆开发出新的分子标记.结果表明:163对豌豆EST-SSR引物中有99对可在蚕豆中获得有效扩增,其中36对引物呈现明显的多态性,共检测到等位位点148个,平均每个位点的等位基因变异数为4.1个;各多态性引物的多态信息量(PIC)值变化范围为0.035到0.810,平均PIC值为0.483 4;实际观察杂合度(HO)变化范围为0.000 1到0.700 0,平均值为0.210 3;期望杂合度(HE)变化范围为0.035 7到0.845 2,平均值为0.538 8;主成分分析与非加权配对算术平均法(UPGMA)聚类分析表明,30份蚕豆种质资源可明显分成2大类群.以上结果表明,本研究所开发的豌豆EST-SSR标记在蚕豆上具有通用性和多态性,可为今后蚕豆遗传多样性、种质资源保存、比较作图和分子标记辅助育种提供新的研究依据.     

绿豆高密度分子遗传图谱的构建

【目的】在前期研究的基础上,进一步利用绿豆基因组SSR、EST-SSR、STS和普通菜豆基因组SSR等标记构建绿豆遗传连锁图谱,为绿豆重要性状相关基因的定位、克隆及分子标记辅助选育新品种等研究搭建技术平台。【方法】利用澳大利亚引进的Berken（高感豆象绿豆栽培种）× ACC41（高抗豆象绿豆野生种）及其重组自交系（recombinant inbreed line,RIL）群体,对6 686对引物进行PCR扩增及多态性筛选,包括6 100对绿豆基因组SSR、149对EST-SSR、13对STS和424对普通菜豆基因组SSR引物,将亲本间多态性引物,进一步分析重组自交系群体。结合前期研究的分子标记数据,利用Mapmarker/Exp 3.0软件构建遗传图谱,并设置LOD≥3.0,最大图距50.00 cM。用Joinmap 4.0软件进行图谱整合。【结果】用2个亲本共筛选了6 686对SSR引物,共有3 691对引物有稳定的扩增产物,得到有多态的引物有588对。其中,通过磁珠富集法开发的绿豆SSR引物6 100对,有效扩增3 459对,有效扩增率56.7%,得到多态性引物559对;通过转录组测序开发的绿豆MGCP引物149对,有效扩增126对,有效扩增率84.6%,得到多态性引物21对;通过磁珠富集法开发的菜豆SSR引物424对,有效扩增97对,有效扩增率22.9%,得到多态性引物6对;绿豆STS引物13对,有效扩增9对,有效扩增率69.2%,得到多态性引物2对。表明不同来源和种类的SSR引物在RIL群体亲本中的有效扩增率有明显差别,绿豆EST-SSR引物（84.6%）最高,绿豆STS引物（69.2%）和SSR引物（55.7%）次之,菜豆SSR引物（22.9%）最低。获得一张含有585个标记（499个SSR标记、74个RFLP标记、9个STS标记和3个RAPD标记）的绿豆遗传图谱,图谱总长732.9 cM,包括11个连锁群,每个标记间的平均距离为1.25 cM,平均长度为66.63 cM。每个连锁群长度为45.2-112.8 cM,每条染色体上面的标记数为35-92个,平均53.18个。标记位点数最多的连锁群LG1含92个标记,长度为112.8 cM;标记位点数最少的连锁群LG11仅含有35个标记,长度为48.7 cM。对图谱的585个标记位点进行χ2测验,在P＜0.05和P＜0.01条件下,分别有79个和151个标记表现为偏分离,占总标记位点数的39.3%。【结论】构建了一张目前国内外发表的标记数最多、密度最高的绿豆遗传连锁图谱。     

赤峰地区紫斑牡丹的引种与抗寒性研究

从甘肃兰州引入赤峰地区紫斑牡丹11个品种的2年生嫁接苗和5年生实生苗,进行了3年驯化栽培与适应性观察,并与中原牡丹‘洛阳红'对比,开展了抗寒性研究.结果表明:1)紫斑牡丹能够适应赤峰地区的气候环境,经适当防寒后能够止常露地越冬生长,其生长量从引种后第2年迅速增加,第3年除个别品种外均能正常开花,与原产地相比,萌动期(3...     

牡丹遗传作图最适F1分离群体的选择

以3株‘凤丹’植株M24、M49、M68为母本,分别以中原牡丹‘红乔’、日本牡丹‘花王’和‘黑龙锦’为父本,采用控制授粉杂交方式,制备了3个规模较大的F1杂交分离群体(个体数量分别为366、233、197)。采用简单重复序列(SSR)标记技术,对这3个分离群体亲本进行多态性检测,结果表明,‘凤丹’M24ב红乔’分离群体亲本间的多态性水平最高,19对SSR引物共检测到27个多态性位点,亲本间遗传距离为0.707 0;因此,选取了该分离群体作为构建牡丹遗传图谱的作图群体。在此基础上,利用SSR标记技术对作图群体中随机抽取的195株子代个体进行了基因型检测,结果显示19对SSR引物在作图群体中有15对具有多态性,其中13对引物在P0.01水平上符合孟德尔期望分离比,占多态性标记总数的86.7%;测量分析了这195株子代个体的苗高、地径、当年生枝长、复叶长、复叶宽和叶柄长等6个表型性状,结果显示这6个表型性状在作图群体中变异明显,表型值的变异系数均超过15%。综上所述,‘凤丹’M24ב红乔’F1分离群体适合作为构建牡丹遗传连锁图谱的作图群体。      

紫斑牡丹新品种选育及牡丹品种分类研究

该文报道了兰州和平牡丹园培育紫斑牡丹新品种的方法和过程,讨论和分析了新品种形成的原因,并提出了一个新的牡丹品种分类系统．主要结果有：①２０年从３２万多株实生苗中选育出９种花色、７种花型、５００多个紫斑牡丹新品种;②甘肃紫斑牡丹品种（群）与中原普通牡丹品种（群）大规模反复杂交,极大地丰富了后代的遗传多样性,为大量选育新品种奠定了基础;③按色、类、型、组和品种五个等级组成的牡丹品种分类系统,“色型兼备、科学实用”,有推广价值．     

牡丹绿化油用品种繁殖栽培技术

本文述及绿化油用的牡丹品种及其生物学特性、繁育技术和立地造林措施。‘凤丹’和紫斑牡丹抗逆性强,具有抗旱关键基因DREB2A、WRKY和XET,而‘凤丹’适应性更广。牡丹籽油在5个种和芍药2个居群中不饱和脂肪酸含量为84%以上,其中‘凤丹’、紫斑牡丹、牡丹、四川牡丹的α-亚麻酸和大花黄牡丹的油酸含量超过40%,食品卫生指标均符合国家标准。‘凤丹’种籽发育根据转录组差异表达基因功能差异划分为3个时期,即有丝分裂期、细胞扩展与物质积累期和成熟期,α-亚麻酸合成关键基因为SAD、FAD2/FAD6和FAD3;其繁殖栽培与管理技术对绿化油用牡丹产业发展有启示。      

以‘凤丹白'为母本的杂交及其育种潜力分析

对药用和油用牡丹品种凤丹白'自交亲和性进行验证的同时,对其育性以及育种潜力进行研究。分别于 2008 年、2009 年、2011 年以凤丹白'为母本与中原牡丹、日本牡丹以及紫斑牡丹进行了大量杂交,共设置57 个杂 交组合,授粉2 023 朵花,获得43 508 粒杂交种子。结果表明:1)凤丹白'自然授粉结实率高(19.13 粒/ 朵),且明 显高于自花授粉结实率(0.4 粒/ 朵),属于异花授粉植物,且不存在无融合生殖现象;2)凤丹白'与中原牡丹、日本 牡丹、紫斑牡丹杂交结实率(18.44、23.84、26.62 粒/ 朵)均较高,表明凤丹白'的杂交亲和性较强;3)结实率受父 本花型影响,皇冠型最低(10.42 粒/ 朵)且与其他花型存在极显著差异,这与雄蕊高度瓣化而花粉减少且生活力下 降有关;4)凤丹白'与贵妃插翠'黑龙锦'等39 个品种杂交结实率(33.33、35.89 粒/ 朵等)高于其自然授粉结 实率,对提高油用牡丹种子产量有重要参考价值。总之,凤丹白'的育性强、亲和性高,是一种育种潜力巨大的优 良牡丹种质资源,值得进一步挖掘与利用。      

根据花粉形态探讨中国栽培牡丹的起源

该文对中国栽培牡丹各品种群 4 8个代表品种的花粉形态进行了扫描电镜观察 ,结果表明 :中国栽培牡丹的花粉形态具有较明显的多样性 .在此基础上 ,结合形态分析 ,提出了绝大多数栽培牡丹起源于多个野生原种的观点 .矮牡丹、紫斑牡丹、杨山牡丹是最主要的起源种 ,卵叶牡丹的作用较小 .杂交是中国栽培牡丹最重要的起源方式 .少数栽培牡丹是单种起源的 ,它们直接起源于紫斑牡丹或杨山牡丹 .四川牡丹未参与中国现有栽培牡丹的起源 .最后讨论了花粉形态对品种分类和鉴定的价值及不同制样方法对花粉粒形状的影响     

根据花粉形态探讨中国栽培牡丹的起源

该文对中国栽培牡丹各品种群48个代表品种的花粉形态进行了扫描电镜观察,结果表明:中国栽培牡丹的花粉形态具有较明显的多样性.在此基础上,结合形态分析,提出了绝大多数栽培牡丹起源于多个野生原种的观点.矮牡丹、紫斑牡丹、杨山牡丹是最主要的起源种,卵叶牡丹的作用较小.杂交是中国栽培牡丹最重要的起源方式.少数栽培牡丹是单种起源的,它们直接起源于紫斑牡丹或杨山牡丹.四川牡丹未参与中国现有栽培牡丹的起源.最后讨论了花粉形态对品种分类和鉴定的价值及不同制样方法对花粉粒形状的影响.     

环境生态因子对“生紫斑牡丹空间 遗传结构形成的影响

环境生态因子与“生紫斑牡丹种内空间遗传结构的分化密切相关。通过对紫斑牡丹空间遗传变异模式 与生态环境因子（包括经纬度、海拔高度、1 月和8 月的平均温度、光照时间、年降雨量、年蒸发量、土壤类型）的相关 性分析,表明空间遗传结构与空间地理距离和环境因子均呈正相关。空间上越接近的居群,环境地理与气象因子方 面的差别就越小。生态选择（自然选择）对紫斑牡丹大部分居群的现有分布格局有相当大的贡献。     

桂花EST-SSR引物开发及在品种鉴定中的应用

利用L₁₆（45）正交实验设计,针对模板DNA,镁离子（Mg2+）,dNTPs,TaqDNA酶和引物5个因素进行正交优化,建立适用于桂花Osmanthus fragrans表达序列标签-简单重复序列（EST-SSR）的最优扩增反应体系,将其用于桂花转录组EST-SSR多态性引物的筛选,最后利用筛选得到的多态性引物和聚类分析对14份四川省常见的栽培丹桂（SC01~SC14）样本进行品种鉴定。结果表明:桂花EST-SSR最优反应体系包含40 ng模板DNA,2.25 mmol·L-1 Mg2+,0.3 μmol·L-1引物,0.3 mmol·L-1 dNTPs,1.25×16.67 nkat TaqDNA聚合酶,10×PCR Buffer缓冲液2 μL,双蒸水补至20 μL;从150对EST-SSR引物中筛选得到了19对稳定性好、多态性高的SSR引物,多态性从高到低依次为五核苷酸（25.00%）,六核苷酸（19.44%）和三核苷酸（16.67%）重复类型。利用筛选得到的3对高度多态性SSR引物（OF8623-1677,OF24299-844和OF28774-2088）对四川省成都市周边常见栽培的14份丹桂（Aurantiacus group）样本进行了有效鉴定。结果表明:14份样本中,有12份可判定为‘朱砂丹桂’‘Zhusha Dangui’,SC06为‘堰红桂’‘Yanhong Gui’,SC08与‘满条红’‘Mantiao Hong’和‘状元红’‘Zhuangyuan Hong’亲缘关系较近。本研究也为今后利用EST-SSR标记对桂花指纹图谱构建、遗传多样性分析、分子育种及品种鉴定与保护等工作奠定基础。     

基于干旱胁迫下杉木转录组序列的EST-SSR分子标记开发

利用干旱胁迫下杉木转录组数据进行杉木EST-SSR分子标记的开发。对干旱胁迫下的杉木组培材料在Solexa mRNA-Seq平台的二代高通量测序技术下进行了转录组测定,序列拼接后共得到75 357个片段,总长度65.29 Mb,共含有EST-SSR位点2 383个,其中三核苷酸重复类型数量最多,占总数的41.21%。随机挑选120个EST-SSR,用Primer Premier 5软件设计引物,再以遗传距离较远的8份杉木DNA样品为模板,通过8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,从120对引物中初选出电泳条带较好的24对引物,用24份杉木DNA样品进行毛细管电泳检测。结果表明:在初选出的24对EST-SSR引物中有23对引物检测出特异性峰;在24份杉木样品中共检测到等位基因94个,平均每个位点4.087 0个,等位基因变异数范围2~9个;有效等位基因数范围1.086 8~6.914 3个,平均有效等位基因2.089 0个;观测杂合度范围0.250 0~1.000 0;期望杂合度范围0.082 4~0.896 1;多态性信息指数范围0.173 2~2.035 3。开发得到的一组杉木EST-SSR分子标记为研究杉木的遗传多样性、种群结构、DNA指纹数据库构建和遗传信息的保存提供了基础。     

草莓EST-SSR标记开发及在品种遗传多样性分析中的应用

 【目的】探讨草莓EST序列中SSR位点的分布规律,开发草莓EST-SSR引物,并分析其在草莓品种遗传多样性研究中的应用。【方法】从NCBI公共数据库下载草莓表达序列标签（expressed sequence tag,EST）55 750条,利用MISA软件查找SSR位点,并利用Primer3.0 Plus软件设计60对引物,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）研究这些SSR引物的PCR扩增特点,并对部分扩增产物进行克隆和测序,以验证其真实性。【结果】55 750条草莓EST序列含有SSR位点的序列1 334条,SSR位点1 490个。其中,二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的SSR类型,分别占36.17%、26.51%和19.87%。60对引物中有42对引物能在20个草莓品种中扩增出理想的PCR产物,其中36对引物扩增条带具有多态性。利用11对验证的EST-SSR引物分析了20个草莓品种的亲缘关系。【结论】草莓EST-SSR标记的开发对于草莓品种鉴定与遗传多样性分析具有重要应用价值。     

牡丹基因库营建技术研究

在原牡丹品种园的基础上,采取集中保存方式,重新规划圃地,划出28.67 hm^2土地营建基因库,其中8.67 hm^2为品种区（主要为中原牡丹）,包括品种展览区、品种繁殖区和新品种种植区;3.33 hm^2为野生牡丹区（含紫斑牡丹）;16.67 hm^2作为实生苗繁殖区,将每年采收的种子播种,从中选育新品种、作为砧木或药用等。重新鉴定原有品种,并拍照,登记造册,将收集的牡丹品种按色系进行分类定植,每个品种定植10--15株,对收集交流及繁育的新品种也按每个品种5--15株定植,以便于管理、观察、记载、对比及鉴定。     

胡桃EST-SSR标记的筛选及引物设计

[目的]筛选胡桃的EST-SSR分子标记并对其进行引物设计。[方法]利用生物信息学方法对NCBI网上公开的5213条胡桃（Juglans regia Linn.）ESTs序列进行EST-SSR特征分析,利用利用Primer3.0软件对筛选出的EST序列设计引物。[结果]在ESTs序列中共检索出207个SSR,其中无冗余序列188,检出率为3.97%,平均分布距离为21.12kb,包括92种重复基元,其中以二核苷酸和三核苷酸重复类型为主,分别占总数目的31.40%和35.27%;对随机筛选出的50条SSR引物进行PCR扩增验证,初步筛选出30对引物。[结论]通过对胡桃EST序列中SSR位点的发掘分析,有针对性地设计EST-SSR引物,将为胡桃科EST-SSR分子标记的开发奠定基础。