应用间接ELISA检测微小隐孢子虫抗体的研究

以在大肠埃希氏菌中表达的微小隐孢子虫(Cryptosporidum parvum)子孢子表面抗原CPl5为抗原，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG为二抗，建立了检测微小隐孢子虫抗体的间接ELISA。试验筛选出的最佳反应条件为：大肠埃希氏菌CPl5抗原包被量为1μg/孔，用100mL／L的兔血清进行封闭，以正常大肠埃希氏菌裂解上清液稀释待检血清。试验结果表明，应用CPl5重组蛋白作为诊断微小隐孢子虫抗体的抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点。     

鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC2和SO7蛋白的原核表达及SIgA抗体间接ELISA检测方法建立

【目的】建立检测鸡肠道黏膜柔嫩艾美耳球虫SIgA抗体的间接ELISA检测方法以期对鸡柔嫩艾美耳球虫特异性黏膜免疫水平进行评价。【方法】将鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC2和SO7基因克隆至pET-28a(+)原核表达载体,构建EtMIC2-SO7重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。采用镍柱亲和层析法对EtMIC2-SO7重组蛋白进行纯化,用Bradford法测定蛋白浓度。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定法,确定ELISA检测抗原、待检黏膜的最佳工作浓度,通过单一变量法确定最佳待检黏膜孵育时间、封闭液种类、酶标二抗、显色液工作条件,参照ELISA抗体检测试剂盒阴阳性判定标准,以S/P≥0.4为阳性,S/P<0.4为阴性作为黏膜样品阴阳性判定标准,对ELISA检测方法的重复性、特异性、敏感性进行验证并与鸡柔嫩艾美耳球虫全蛋白包被ELISA板检测结果进行符合率比较。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果显示,获得大小约70 ku的EtMIC2...     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG7基因的克隆与表达

应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫杨陵株的第二代裂殖子总RNA扩增出表面抗原SAG7的基因序列,并将其克隆至pGEM-T easy载体转化DH5a菌中。再用一对特异性引物扩增出N端不含信号肽序列的SAG7基因,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与同样双酶切的PET-32a(+)连接并转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用PCR方法和双酶切筛选阳性克隆并测序,验证读码框是否正确。将筛选的阳性克隆菌经IPTG诱导,获得了SAG7重组抗原在大肠埃希氏菌中的高效表达,表达量占菌体总蛋白的50%以上,融合蛋白的分子量约为45kDa。菌体经超声裂解后经SDS-PAGE分析,重组抗原是以包涵体形式存在。     

堆型艾美球虫表面抗原基因cSZ1在大肠埃希氏菌中的表达

根据已克隆的堆型艾美球虫(Eimeria acervulina)广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计了特异性引物，用PCR方法扩增cSZ1的开放阅读框架(ORF)后克隆至表达载体pET-32a( )，构建了重组表达质粒pET-32a( )-cSZ1，并将其转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)。经IPTG诱导，获得了cSZ1重组抗原在大肠埃希氏菌中的高效表达，表达产物量可达菌体总蛋白的9．3％，融合蛋白的分子质量约为40ku。重组菌诱导表达的产物经SDS—PAGE后，用堆形艾美球虫感染鸡的超免疫血清进行免疫印迹分析，结果为阴性，提示cSZ1所编码的抗原可能主要是T细胞抗原表位。     

绵羊支原体HSP70的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立绵羊支原体(Mycoplasma ovis)的血清学检测方法,根据GenBank收录的绵羊支原体HSP70蛋白C端的基因序列(登录号：CP006935.1),构建了重组原核表达质粒。通过原核表达获取重组蛋白,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了绵羊支原体间接ELISA抗体检测方法。结果显示,成功构建了绵羊支原体HSP70蛋白的重组原核表达质粒;重组蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞中,同时以可溶性蛋白和包涵体蛋白的形式表达;以重组蛋白作为包被抗原建立的绵羊支原体间接ELISA抗体检测法,抗原包被最佳浓度为4μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 000。建立的ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,为绵羊支原体的检测及试剂盒的开发提供了技术支持。     

柔嫩艾美耳球虫SAG2基因的克隆及其在卡介苗中表达

为获得柔嫩艾美耳球虫SAG2的克隆株并在卡介苗中表达该蛋白,根据柔嫩艾美耳球虫SAG2基因序列和表达载体图谱设计特异性引物,引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,RT-PCR扩增SAG2基因,连接到pMD18-T载体。双酶切后,将SAG2基因插入到大肠埃希菌-分支杆菌整合表达载体pMV361中,获得重组质粒pMV361-SAG2,经电穿孔转染到卡介苗中,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析。结果成功构建了重组质粒pMD18-T-SAG2和pMV361-SAG2,SAG2在卡介苗中高效表达,表达产物能够被柔嫩艾美耳球虫阳性血清识别,表明具有良好的免疫原性,为下一步重组卡介苗对鸡球虫病的免疫保护研究奠定了基础。     

以番鸭呼肠孤病毒σC表达蛋白为抗原的ELISA检测方法的建立

将鸭呼肠孤病毒小外壳dC蛋白编码基因克隆于原核表达栽体pET32a上，经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析，获得了重组质粒pET32a-σC，转化DH5a大肠埃希氏菌感受态细胞后，经SDS—PAGE和Western—blotting分析，融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应；以0．15mmol／L IPTG诱导，5h后融合蛋白σC表达量可达高峰，分子质量为50ku；融合蛋白纯化后被用作包被抗原，建立了检测鸭血清中呼肠孤病毒抗体的间接ELISA，经对检测条件优化，最佳包被浓度为5μg／mL，标准阳性血清的最适稀释倍数为1：40。用该方法对50份鸭血清样品进行了检测，与琼脂扩散抗体检测法相比，ELISA具有良好的特异性和敏感性。     

柔嫩艾美耳球虫MAGL基因的克隆及表达

酰基甘油酯酶(MAGL)是将酰基甘油分解为甘油和游离脂肪酸的丝氨酸水解酶家族成员之一,在酯代谢中起着关键酶的作用,是研制抗鸡球虫药物的重要靶标。本研究利用生物信息学技术预测拼接了柔嫩艾美耳球虫MAGL基因序列,以第二代裂殖子总RNA为模板,通过RTPCR技术获得Etmagl基因。将Etmagl与pCold-43a载体连接,构建pCold-43a-Etmagl重组载体,并在大肠杆菌BL21中获得可溶性蛋白,经亲和层析获得纯化的重组蛋白。结果显示,扩增的Etmagl序列ORF长1 752 bp,编码584个氨基酸,与预测序列相似度为99%,与弓形虫MAGL相似度好(55%);IPTG诱导后融合蛋白高效表达,大小约为114 ku,经免疫印迹鉴定为目的蛋白。本研究成功利用大肠埃希菌原核表达体系重组表达并纯化了柔嫩艾美耳球虫酰基甘油脂肪酶,为建立以MAGL为靶标的抗球虫药物筛选模型奠定了基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因的原核表达及动物免疫试验

为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因原核表达重组蛋白的免疫效力,分析其在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中对鸡平均增重、抗球虫指数(ACI)、减少盲肠病变和卵囊数量中的作用,从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA作为模板,用RT-PCR扩增出SO7基因片段,再应用DNA重组技术将SO7基因克隆到原核表达载体pET32a(+)中并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示,pET32a(+)-SO7表达的目的蛋白约为40ku,主要以包涵体形式存在。用纯化的重组蛋白进行动物免疫试验显示,SO7重组蛋白在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中有较好的免疫保护作用,能够显著提高鸡柔嫩艾美耳球虫感染鸡的平均增重和抗球虫指数(ACI),对减少盲肠病变和卵囊数量也有部分作用。     

大肠埃希氏菌F18菌毛结构蛋白与黏附特性的关系

利用已表达的F18ab和F18ac菌毛各结构亚单位的融合蛋白（GST-FedA／ab、GST-Fe-dA／ac、GST-FedE、（；STFed-F／ab、GST-FedF／ac）分组肌肉注射健康家兔，制备抗FedA／ab、Fe-dA／ac、FedE、FedF／ab、FedF／ac多价血清。结果表明，所制备的5种抗Fed多价血清均能凝集F18ab^＋。大肠埃希氏菌107／86株和F18ac^＋大肠埃希氏菌8813株。利用抗大肠埃希氏菌F18菌毛主要结构亚单位FedA特异抗体和次要结构亚单位FedE、FedF特异抗体，研究了F18菌毛与小肠上皮细胞的黏附特性。结果发现，FedA抗体和FedE抗体单独和合并均不能抑制F18^＋菌与小肠上皮细胞的黏附，而单用抗FedF抗体即能明显抑制F18^＋大肠埃希氏菌与小肠上皮细胞的黏附，表明FedA和FedE与F18菌毛的黏附不具相关性，而FedF才是F18菌毛的黏附性结构亚单位。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒（AIV）A／Goose／HLJ／p46／2003（H5N1）的NSl基因，将其克隆于融合蛋白表达载体pMAL-c2X上，转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定及序列分析，表明筛选到了重组质粒pc2X-NS1。SDS-PAGE电泳结果显示，重组质粒转化TB1大肠埃希氏菌后，经0．3mmol／L的IPTG诱导，融合蛋白MBP-NS1得到大量表达，融合蛋白以可溶形式存在，分子质量约为67ku。Western-blotting检测结果表明，融合蛋白MBP-NS1能够与H5N1亚型AIV活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应，而不能够与H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。试验初步建立了以纯化的融合蛋白MBP-NS1为包被抗原的间接ELISA检测方法，为AIV灭活疫苗免疫家禽与AIV感染家禽的鉴别诊断奠定了基础。     

柔嫩艾美球虫扬州株S07抗原基因表达条件的研究

通过RT—PCR扩增柔嫩艾美球虫YZ株折光体SO7抗原基因，并进行克隆和测序。将不舍信号肽编码区片段的S07基因克隆入表达载体pGEX6p-1谷胱甘肽-S-转移酶基因的下游，构建表达质粒pGEX6p-1-SO7，转化宿主菌BL21，获得重组菌。通过建立生长曲线，对诱导条件的摸索，根据SDS—PAGE确定融合蛋白的最佳表达条件。通过融合蛋白切胶免疫小鼠制备超免疫血清，经间接EL-ISA检测其与E。tenella子孢子抗原反应的特异性。结果显示，诱导时机和诱导时间是影响表达的主要因素，诱导温度、1PTG浓度次之；诱导时机以3h为最佳，诱导时间以4．5h为最佳；诱导温度以37℃最佳，0．008～1．000mmol／L的IPTG对表达量的影响不大。在优化的表达条件下，表达产物主要以包涵体存在，表达量占菌体总蛋白的37．5％。间接ELISA结果表明融合蛋白具有一定的免疫原性，保留了天然蛋白的部分抗原性。     

ETEC K88菌毛蛋白抗体PPA-ELISA检测方法的建立

以纯化的大肠埃希菌K88菌毛蛋白为包被抗原,建立了检测大肠埃希菌K88IgG抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA的最适反应条件,即最佳抗原包被浓度为1μg/mL,兔抗体稀释倍数为1∶10,猪抗体稀释倍数为1∶100,确定最佳封闭液为50g/L脱脂奶粉,最佳封闭时间为0.5h,血清反应时间0.5h,二抗反应时间1h,底物室温反应时间为15min,阴阳性临界值兔血清为0.33、猪血清为0.45。证实该间接PPA-ELISA方法特异性强、重复性好、敏感度高,可以作为疫苗效力检验和流行病学调查的参考方法。     

犬圆环病毒Rep蛋白的原核表达

犬圆环病毒(CanineCV)是一种新发现的圆环病毒。制备针对CaineCV Rep的抗体,为建立CaineCV ELISA检测方法及研究Rep蛋白的功能奠定基础。以CaineCV基因组作为模板,扩增出Rep基因序列。PCR产物克隆至pET-28a原核表达载体上,获得了重组质粒pET(28a)-Rep。将重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞后进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明重组Rep蛋白在大肠埃希菌BL21中获得表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。该研究构建了pET(28a)-Rep重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得表达,为进一步制备Rep的抗体奠定了基础。     

鸡干扰素调节因子7的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达鸡干扰素调节因子7蛋白并制备其多克隆抗体,通过RT-PCR技术扩增chIRF7基因的编码序列,构建重组质粒PET30a-chIRF7。将重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coil)BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,重组蛋白rchIRF7分子量约为60ku。将纯化的重组蛋白免疫接种小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA测定血清抗体滴度在1∶51 200以上,IFA检测结果显示制备的鼠抗chIRF7蛋白多抗能够与AIV刺激的CEF细胞内的chIRF7蛋白发生特异性反应,表明通过原核表达系统表达的重组蛋白rchIRF7具有很好的免疫原性,以其制备的鼠抗chIRF7蛋白多克隆抗体滴度高、特异性好。     

微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体检测ELISA方法的建立

为建立快捷的含病毒隐孢子虫的检测方法,本研究利用已构建的微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白重组表达质粒表达并纯化重组蛋白,建立以该重组衣壳蛋白为包被抗原检测抗体的间接ELISA检测方法.经优化后间接ELISA的最佳条件为:抗原包被浓度为0.25 μg/孔,被检血清稀释度为1:200,酶标二抗稀释度为1:2000,封闭液为含5％脱脂奶粉的PBST溶液.该方法检测安氏隐孢子虫阳性血清,柔嫩艾美尔球虫阳性血清,蓝氏贾第虫阳性血清,弓形虫阳性血清与微小隐孢子虫阳性结果均为阴性.该方法灵敏度为1:1600,特异性较强且具可重复性,可用于含病毒隐孢子虫的抗体检测及流行病学调查.     

携带兔斯氏艾美耳球虫MIC-5基因减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗的安全性、稳定性与免疫原性

对携带兔斯氏艾美耳球虫微线蛋白-5基因(MIC-5)真核表达质粒asd-pBMIC-5-IL-15的减毒鼠伤寒沙门菌X4550(X4550/asd-pBMIC-5-IL-15)进行了安全性、稳定性与免疫原性试验.结果显示,重组菌在109CFU剂量以下对家兔安全;连续培养30代重组菌,重组表达质粒可稳定存在于X4550内,具有良好的遗传稳定性;用重组菌2次免疫动物后,既能诱导机体产生抗兔斯氏艾美耳球虫抗体,也能显著增强淋巴细胞增殖水平,抗球虫指数为164.4.试验表明,减毒沙门菌介导的兔球虫调节型DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性.     

柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其在蛋白定位中的应用

为了制备柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶(Eimeria tenella lactate dehydrogenase,Et LDH)单克隆抗体,用大肠杆菌表达的重组Et LDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,经5次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,经3次亚克隆后获得2株能稳定分泌Et LDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7和2H4,抗体亚类鉴定均为Ig G1,腹水效价分别为1:8000和1:64 000。Western blot结果显示2F7抗体能识别柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中大小约为35 k Da的天然蛋白。利用该单抗对Et LDH在柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中的分布进行了定位,结果显示该蛋白主要分布于裂殖子的细胞质,表明成功地制备了Et LDH单克隆抗体,为深入研究Et LDH的功能和特性奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫SO7-IL-2重组酵母蛋白的表达及其免疫效果评价

为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella) SO7重组酵母蛋白的表达及其免疫保护效果,试验用E.tenella的保护性抗原基因SO7与鸡IL-2基因串联在毕赤酵母表达载体pPICZαA中进行表达,用Western-blot检测表达是否成功。分别以重组酵母全菌体破碎蛋白和诱导表达纯化的重组酵母蛋白免疫鸡只,并以1×10~4个/只柔嫩艾美耳球虫卵囊进行攻虫,观察免疫保护效果。结果表明:诱导后的重组酵母全菌蛋白pPICZαA-SO7-IL2成功表达;两种蛋白抗球虫指数(ACI)分别为175.48,174.35,说明pPICZαA-SO7-IL2对感染鸡只具有较高的抗球虫效果。     

抗柔嫩艾美耳球虫EtRP单克隆抗体的制备及其免疫保护效果

棒状体蛋白(EtRP)在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞的过程中起重要作用。该蛋白在球虫发育阶段的早期表达,具有保护性抗原的性质,其相应抗体可抑制球虫对宿主的感染。采用纯化后的p GEX-6P-1-EtRP重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备了抗EtRP的单克隆抗体,将不同剂量的单克隆抗体注射试验鸡群再对免疫鸡群攻虫,7 d后致死鸡群并计算卵囊减少率、相对增重率以及盲肠病变评分情况。结果表明,所制备的单克隆抗体亚型为IgG1,经Western-blot检测能特异性识别重组蛋白,经间接ELISA测定其效价大于1∶128 000。此外,单克隆抗体对鸡的被动保护性试验结果显示相对增重率、病变评分、卵囊减少率均随着免疫剂量的增加而增大,表明一定剂量的单克隆抗体可以有效减少柔嫩艾美耳球虫对鸡群的感染。