脊尾白虾VgR基因克隆及其在卵巢发育过程中的表达分析

为了解卵黄蛋白原受体(vitellogenin receptor,Vg R)在脊尾白虾卵巢发育中的作用,采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾Vg R基因全长c DNA序列,用实时荧光定量PCR方法分析了Vg R基因在雌虾不同组织、卵巢发育不同时期的表达特征。结果显示,脊尾白虾Vg R基因全长5892 bp,开放阅读框5661 bp,编码1886个氨基酸。脊尾白虾Vg R具有低密度脂蛋白受体(LDLR)家族典型结构特征,属于LDLR家族,进化上与日本沼虾等甲壳动物Vg R亲缘关系最近,然后与昆虫Vg R分支聚为一支,而与LDLR家族中其他成员亲缘关系较远。脊尾白虾Vg R在各组织中均有表达,但主要在卵巢内表达。随着卵巢的发育,卵巢Vg R表达量逐渐升高,在III期达到最大,与肝胰腺Vg表达量、血液Vg浓度变化趋势相一致;而在卵巢成熟时,卵巢Vg R表达量降到了最低,与肝胰腺Vg表达情况截然相反;排卵后的恢复期,血液中Vg浓度仍维持在较高水平,卵巢Vg R表达量又升至III期水平,同时卵巢Vg表达量也升至最高。由此可见,甲壳动物与昆虫Vg R起源于同一祖先,但在进化上已形成独立一支;脊尾白虾卵巢成熟前,卵巢主要通过Vg R介导作用摄取血液中Vg,以供卵巢快速成熟;卵巢成熟期,肝胰腺呈现补偿性合成Vg,以尽快恢复其营养储备功能;卵巢恢复期,卵巢通过Vg R介导摄入外源Vg和内源合成Vg两种途径,为卵巢二次发育提供营养物质。     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)FAMeT基因在卵巢发育周期中的表达分析

为了研究法尼酸甲基转移酶(Farnesoic acid O-methyltransferase,FAMeT)在脊尾白虾卵巢发育中的作用,采用实时荧光定量PCR方法分析连续3次繁殖过程中卵巢不同发育时期(Ⅰ-Ⅴ期)大颚器、卵巢和肝胰腺中FAMeT基因的表达规律.结果显示,FAMeT基因在鳃、心脏、肌肉、肝胰腺、卵巢、大颚器等组织中均有稳定的表达,其中,在鳃和大颚器的表达量显著高于其他组织;在卵巢发育周期内,FAMeT基因在大颚器、卵巢、肝胰腺中的表达量变化趋势基本一致,从Ⅰ-Ⅳ期逐渐下降,到Ⅴ期时表达量上调;在每个卵巢发育时期,FAMeT基因在大颚器中表达量最高,约为卵巢中表达量的20-30倍.研究结果表明,大颚器是合成FAMeT的主要组织,脊尾白虾繁殖过程中FAMeT基因主要在卵巢发育前期表达,可以合成大量甲基法尼酯(Methylfarnesoate,MF),促进卵巢发育.     

脊尾白虾EcR基因的克隆及其在卵巢和胚胎发育过程中的表达分析

为了解蜕皮激素受体(EcR)在脊尾白虾卵巢和胚胎发育中的作用,采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾EcR基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KC506600),用实时荧光定量PCR方法分析了EcR基因在雌虾不同组织、卵巢以及胚胎发育不同时期的表达特征。结果显示,脊尾白虾EcR基因全长2 638 bp,开放阅读框1 713 bp,编码570个氨基酸,脊尾白虾EcR在系统进化上与行抱卵繁殖的真虾类和蟹类亲缘关系较近,而与对虾类较远。脊尾白虾EcR基因在各组织中均有表达,但主要在肝胰腺内表达。在脊尾白虾繁殖期内,肝胰腺内EcR的表达量始终高于卵巢,表达量峰值出现在卵巢成熟时期,而卵巢内EcR的表达量在卵巢成熟前期达到最大,两种组织中EcR表达量与卵黄蛋白原(Vg)质量浓度变化趋势相一致。随着胚胎发育,EcR表达量呈先上升后下降趋势,在原肠期达到最大,前溞状幼体期和溞状幼体Ⅰ期的表达量虽有下降,但仍保持较高水平。结果表明,脊尾白虾EcR基因系统进化方向与虾蟹类不同繁殖方式相吻合,其mRNA主要在肝胰腺内表达;卵巢发育过程中,EcR基因参与了肝胰腺和卵巢中Vg合成,其在肝胰腺中表达量变化与性腺发育指数变化趋势一致,对卵巢成熟有重要作用;在胚胎发育过程中,EcR基因参与了胚胎细胞分化及器官形成。     

脊尾白虾隐花色素基因cry1的克隆及其功能分析

为探究隐花色素基因(cryptochrome,cry)在甲壳类中的节律调节功能,本研究根据脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)转录组序列,利用RACE技术获得了脊尾白虾cry1基因cDNA序列全长并对其进行功能分析。脊尾白虾cry1基因全长2190bp,开放阅读框1845bp,5’端非编码区为241bp,3’端非编码区为104bp,共翻译出614个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为70.5kDa,理论等电点为5.09。同源性分析显示,脊尾白虾cry1基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannameiS)的同源性最高,为71.6％。荧光定量分析结果表明,脊尾白虾cry1基因在眼柄、鳃、心脏、胃、肝胰腺、性腺、肌肉、肠道和腹索神经中均有表达,其中眼柄的表达量最高,性腺和心脏次之；不同时段的表达结果表明,其表达量在日节律(24h)中表现出先下降再上升的趋势。不同光色条件下RNA干扰(RNA interference,SRNAi)结果显示,注射后3~6h蓝光光照下脊尾白虾cry1基因的表达量显著高于白光光照,9~24h蓝色和白色光照下的表达量无显著差异,而RNA干扰组的表达量显著低于对照组,此结果显示cry1基因可能主要响应蓝光周期节律。目前对甲壳类生物钟的研究较少,该研究为深入探究甲壳类生物钟基因的调控机制提供帮助。     

脊尾白虾的幼体发育

在实验室的条件下，对脊尾白虾幼体发育的全过程进行观察和研究。当水温保持在22℃，饵料充足的情况下，幼体自卵孵出后，有规律的每二天蜕皮一次。潘状幼体共蜕皮6次，分六个潘状幼体期，约经12天，即变态为仔虾。本文对各期幼体形态结构的变化作详细的描述，并有附图说明。     

脊尾白虾养殖技术研究

综述了脊尾白虾池塘养殖、秋冬季养殖、混合养殖和低盐度养殖等各种模式的养殖技术以及对脊尾白虾营养生理的研究情况,指出了目前我国脊尾白虾养殖中存在的主要问题,并提出了以后的研究方向。     

脊尾白虾热休克蛋白HSP90基因的原核表达与鉴定

将脊尾白虾热休克蛋白90基因克隆到原核表达载体pET-30a中,经酶切验证和DNA测序鉴定后,将重组质粒转化表达宿主大肠杆菌Rosetta,优化温度、时间、IPTG和OD600表达条件进行诱导表达,收集菌液,进行SDS-PAGE和质谱检测,并用Quantity one软件分析蛋白表达水平。结果表明,成功构建了含脊尾白虾HSP90基因的重组表达载体pET-30a-HSP90,表达目的蛋白相对分子量为82.7kD,为HSP90蛋白。通过条件优化认为重组菌株Rosetta/pET-30a-HSP90的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1.0mmol/L,最佳诱导时机和诱导时间分别为0.58h、7h。     

脊尾白虾丝氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆及表达分析

采用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因的cDNA序列。该基因全长1 516 bp, 开放阅读框1 245 bp, 编码414个氨基酸, 其预测分子量为45.06 kD, 理论等电点为5.694, 并含有两个糖基结合位点。同源性分析发现其与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高, 达到49%。组织表达分析表明, serpin基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高, 其次是肝胰腺和鳃组织, 在肌肉中表达量最低。不同盐度胁迫后脊尾白虾的血细胞serpin基因表达量在盐度胁迫8 h时显著高于对照组(P<0.05), 肝胰腺组织中serpin基因表达量在盐度胁迫后2 h和24 h出现明显峰值, 且显著高于对照组(P<0.05)。上述结果表明, 脊尾白虾serpin基因参与了急性盐度胁迫下机体的应激反应。本研究通过克隆脊尾白虾酚氧化酶原激活系统中的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因cDNA全长, 分析盐度胁迫后其在血细胞和肝胰腺组织中的表达变化规律, 以期为脊尾白虾的健康养殖提供理论基础和参考依据。

     

脊尾白虾的性腺发育及组织结构观察

为系统研究脊尾白虾的性腺发育及组织学特征,采用常规的石蜡切片及H.E染色方法对脊尾白虾的性腺发育及其组织结构进行观察。结果表明,脊尾白虾的雌性生殖系统由卵巢、输卵管及排卵孔组成。卵子发生经历了卵原细胞、卵黄合成前期卵母细胞、内源性卵黄合成期卵母细胞、外源性卵黄合成期卵母细胞,最后发育为成熟的卵母细胞。卵巢发育可分为增殖期、小生长期、大生长期、成熟期及产后恢复期。脊尾白虾雄性生殖系统由精巢、输精管及排精孔组成。精巢由生精小管构成,不同生精小管内精子发育可不同步。精子发生经历了精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞,最后发育为精子。输精管可分为前、中、后输精管及末端壶腹,精荚在输精管中形成。     

长期碳酸盐碱度胁迫对脊尾白虾生长及卵巢发育的影响

为探讨碳酸盐碱度对脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）生长及卵巢发育的影响。本研究设置3 mmol/L（对照组）、5 mmol/L和8 mmol/L 3种碳酸盐碱度梯度养殖脊尾白虾60天,比较不同碳酸盐碱度胁迫对脊尾白虾生长性能、组织结构、酶活性以及卵巢发育的影响,结果显示：5 mmol/L组与对照组体长增长率、体重增长率以及成活率差异不显著（P>0.05）,8 mmol/L组体长增长率、体重增长率以及成活率显著低于对照组（P<0.05）。肝胰腺组织切片显示,5 mmol/L组中部分B细胞体积增大,部分转运泡内出现颗粒物质,8 mmol/L组管腔的形态结构严重变形。鳃组织切片显示,5 mmol/L组出现轻微鳃丝肿大现象,角质层略有变形,且角质层下间隙扩张变长,上皮细胞与支柱细胞排列紊乱;8 mmol/L组鳃丝肿大,排列不规则,出现血细胞肿胀现象,鳃丝上皮细胞严重破坏,毛细血管网结构形态改变,角质层下间隙变形。肌肉组织酶活性测定结果显示,5mmol/L组的碳酸酐酶活性显著高于对照组（P<0.05）,Na+/K+-ATP酶活性在肌肉中差异不显著（P>0.05）;肝胰腺组织酶活性测定结果显示,碳酸酐酶在肝胰腺组织中差异不显著（P>0.05）,8 mmol/L组Na+/K+-ATP酶活性显著低于其他组（P<0.05）,鳃组织中,5 mmol/L和8 mmol/L组鳃组织中和Na+/K+-ATP酶活性均显著高于对照组（P<0.05）,且两组间差异显著。卵巢发育统计结果显示,三组脊尾白虾卵巢均能发育,其发育至Ⅱ期的百分比分别为20.51%、10.52%和6.25%,其中5 mmol/L组与对照组间无显著差异（P>0.05）,8 mmol/L组显著低于对照组（P<0.05）;3 mmol/L组和5 mmol/L组均有卵巢发育至Ⅲ期的脊尾白虾,但两组差异不显著（P>0.05）,8 mmol/L组未见有卵巢发育至Ⅲ期的脊尾白虾。卵巢组织切片显示,8 mmol/L组卵原细胞细胞排列疏松,周围滤泡细胞排列疏松且数量较少。综上所述,脊尾白虾可以在低于8 mmol/L的碳酸盐碱度中生长发育,但高碳酸盐碱度可能会造成脊尾白虾鳃和肝胰腺组织损伤,导致其生长受到影响,同时猜测高碳酸盐碱度可能也会影响卵巢的发育速度。     

脊尾白虾EcERR基因的克隆与表达分析

雌激素相关受体(estrogen-relatedreceptor,ERR)是一种真核转录因子,与雌激素的效应有密切关系,参与生物体的能量代谢、细胞增殖分化和性腺发育等生理过程.为了解ERR基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢发育中的作用,采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得脊...     

脊尾白虾14-3-3 基因cDNA 全长的克隆和表达分析

利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞cDNA文库中脊尾白虾14-3-3巨球蛋白基因EST序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆获得脊尾白虾14-3-3基因c DNA全长,命名为Ec14-3-3。该基因全长2905 bp,包含744 bp的开放阅读框,编码247个氨基酸组成的蛋白质,分子量为27.95 kD,理论等电点为4.65。同源性分析表明,脊尾白虾Ec14-3-3氨基酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)14-3-3的同源性最高,达到98%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec14-3-3基因在血细胞、卵巢、肝胰腺等组织中均有表达,其中血细胞中Ec14-3-3相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后6 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec14-3-3基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究结果表明,Ec14-3-3基因在脊尾白虾免疫反应中发挥重要作用。     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda) 2-巨球蛋白cDNA全长的克隆和表达分析

根据本实验室前期获得的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda) α2-巨球蛋白基因EST序列,采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA end, RACE)技术克隆获得脊尾白虾α2-巨球蛋白基因cDNA全长,命名为Ecα2M基因。该基因全长4823 bp,由4413 bp的开放阅读框、64 bp的5?端非编码区以及346 bp的3?端非编码区组成。开放阅读框编码1470个氨基酸,分子量为163.0 kDa,理论等电点为5.03。序列分析显示,Ecα2M序列N端含有23个氨基酸组成的信号肽。同源性分析显示,脊尾白虾Ecα2M氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii) α2M的同源性最高,达到80%。荧光定量PCR分析结果显示,Ecα2M基因在血细胞、肝胰腺、肌肉、鳃、卵巢、眼柄、胃及肠中均有表达,其中在血细胞中的相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后,脊尾白虾血细胞中Ecα2M的相对表达量于6 h达到最大值且显著高于对照组(P<0.05),肝胰腺中Ecα2M的相对表达量于3 h达到最大值且显著高于对照组(P<0.05),相对表达量变化具有明显的时间差异性。     

脊尾白虾甘露糖结合凝集素(MBL)基因在抗镉胁迫中的生物学功能分析

为研究Cd2+胁迫下脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)甘露糖集合凝集素(MBL)在肝胰腺中表达量的变化特征,本研究利用重金属镉(Cd2+)对脊尾白虾进行96 h急性毒性实验。实验共设置5组Cd2+浓度胁迫(0、0.01、0.0175、0.021和0.0278 mmol/L),分别在Cd2+胁迫后0、3、6、12、24、48、72和96 h共8个时间点取样。实时荧光定量结果显示,高浓度Cd2+(0.0175、0.021和0.0278 mmol/L)胁迫下,脊尾白虾MBL基因的表达量先呈上升趋势,在72 h达到峰值后随后下降,但各时间点表达量均与对照组存在显著性差异(P<0.01);Cd2+浓度为0.01 mmol/L时,脊尾白虾MBL基因的表达量整体呈下降趋势。进一步采用RNA技术干扰该基因表达后,发现Cd2+胁迫后的脊尾白虾个体死亡率显著增加。本研究表明,脊尾白虾MBL在应答Cd2+胁迫过程中可对机体起到一定的保护作用。     

脊尾白虾GAPDH基因的克隆及其内参基因稳定性分析

为比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18S rRNA和β-actin基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)作内参基因的优劣,本研究采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾GAPDH基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KX893516),通过实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR,qPT-PCR)技术,检测3种基因在脊尾白虾不同组织及不同蜕壳后时间点的表达量变化,在此基础上进行内参稳定性分析。结果显示,脊尾白虾GAPDH基因全长1514 bp,开放读码框1002 bp,编码333个氨基酸,二级结构预测显示GAPDH蛋白具有一个高度保守的NAD~+结合功能域(NAD binding domain)和行使糖运输和代谢的催化功能域。分析qRT-PCR结果并结合ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种软件的分析发现,在不同组织和不同蜕壳后时间点,3种内参基因的稳定性由高到低依次为18S r RNA、GAPDH、β-actin。因此,在脊尾白虾不同组织和不同蜕壳后时间点的定量分析中,选取单内参基因时,推荐使用18S rRNA为内参基因,双内参时推荐18S rRNA和GAPDH,而18S rRNA、β-actin和GAPDH在其他生理条件下作内参基因的稳定性还有待进一步研究。     

脊尾白虾丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及其表达特征分析

本研究根据脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)转录组序列,采用cDNA末端快速扩增技术克隆获得了脊尾白虾丝氨酸羟甲基转移酶基因(SHMT)。该基因cDNA全长为1855 bp,其中,开放阅读框为1407 bp,5?端非编码区为39 bp,3?端非编码区为409 bp,共编码468个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为152.55 kDa,理论等电点为4.90。同源性分析显示,脊尾白虾SHMT基因与甲壳类动物真宽水蚤(Eurytemora affinis)同源性最高,为96%。荧光定量分析结果显示,SHMT基因在脊尾白虾眼柄、胃、肝胰腺、心脏、鳃、肠、肌肉、腹索神经、皮下脂肪以及卵巢中均有表达,其中,卵巢表达量最高,心脏次之。不同浓度Cd2+胁迫结果显示,其在低浓度(0.0100、0.0175和0.021 mmol/L) Cd2+胁迫中的表达模式基本一致,呈先升高后下降再升高再下降的趋势;而在高浓度(0.0278 mmol/L) Cd2+胁迫中,该基因表达量很低,甚至不表达,说明高浓度Cd2+胁迫可以抑制该基因的表达,具体机制有待进一步研究。