抑制素基因免疫多克隆抗体制备

为制备成本低廉、效价高的抗抑制素抗体,将6只2．5—3kg的健康大白兔分为3组（n=2）,分别皮下多点注射100μg纯化的抑制素质粒pCISI（T1、T22组）或100μg生理盐水（S对照组）,T1组加强免疫1次,而T2组加强免疫2次,每隔10d采血1次,用辛酸-硫酸铵法纯化抗血清;用ELISA法检测血清中抗抑制素抗体水平,以P／N值〉2判为阳性。ELISA检测结果表明,T1、T2组血清中均检测到抗抑制素抗体,效价为1：6400。研究结果表明,抑制素质粒pCISI免疫大白兔可产生较高效价的抗抑制素抗体,且只须加强免疫1次。     

磺胺嘧啶多克隆抗体的制备

为制备磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD)多克隆抗体(pAb),用重氮化方法将SD偶联于载体蛋白BSA和OVA上,合成免疫抗原BSA-SD和包被抗原OVA-SD。用紫外扫描、SDS-PAGE凝胶电泳试验检测,结果表明偶联成功。用BSA-SD免疫新西兰大白兔,间接ELISA测定多克隆抗体效价。阻断ELISA结果显示:SD单克隆抗体(pAb)的IC50达19.19ng/mL,和其他磺胺类药物交叉反应小于等于2.7%。结果表明,获得了高效价和特异的pAb。     

特异性RBBP10多克隆抗体的制备

目的: 制备RBBP10多克隆抗体.方法:用纯化的RBBP10蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,stern印迹检测抗体特异性.结果:抗血清效价可达1:1000以上.结论:经Western印迹检测证明抗体效价高,特异性强,此抗体可通过免疫组化方法检测RBBP10蛋白在各种肿瘤中的表达,具有一定的应用价值.     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备

[目的]克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并对其进行鉴定。[方法]以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,Western Blotting检测抗体的特异性。[结果]构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可高效表达NrfA蛋白;免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1∶204 900;经Western Blotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,并构建了其表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性,为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

水牛Tle6基因表达模式分析及其多克隆抗体制备

【目的】明确水牛Tle6基因表达组织特异性及其在卵母细胞和早期胚胎中的表达模式,并通过构建原核表达载体诱导表达融合蛋白及免疫小鼠制备TLE6多克隆抗体,为进一步揭示Tle6基因在水牛生殖发育中的作用机制提供理论依据。【方法】采用RT-PCR扩增水牛Tle6基因编码区（CDS）序列,经生物信息学分析后,分别以半定量PCR和实时荧光定量PCR检测分析水牛Tle6基因表达组织特异性及其在卵母细胞和早期胚胎中的表达模式。构建重组原核表达载体,以IPTG诱导表达的融合蛋白免疫小鼠制备TLE6多克隆抗体,再利用TLE6多克隆抗体检验TLE6蛋白在水牛不同组织及卵母细胞和早期胚胎中的表达情况。【结果】水牛Tle6基因CDS序列全长1731 bp,编码576个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为64.09 kD,理论等电点（pI）为5.69,属于亲水性蛋白。Tle6基因仅在水牛的卵母细胞中特异性表达。重组原核表达载体p ET-32a-Tle6转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导6 h,融合蛋白TLE6的表达量最高,且以可溶性蛋白和包涵体2种形式进行表达;以纯化的融合蛋白TLE6免疫小鼠成功制备获得TLE6多克隆抗体,其抗体效价为1∶64000,能与融合蛋白TLE6及水牛卵母细胞发生特异性反应,即具有很强的特异性。【结论】Tle6基因仅在水牛卵母细胞中特异性表达,而在其他组织中未见表达。不同于其他MEGs的表达模式,Tle6基因在水牛卵母细胞及胚胎早期发育过程中呈特异性持续表达,可能在水牛卵母细胞成熟及附植前的胚胎发育过程中发挥重要作用。     

梅花鹿Thymosin beta 10基因的原核表达、活性鉴定和多克隆抗体制备

为研究梅花鹿Thymosin beta 10基因(Tβ10)在鹿茸快速生长过程中的作用,利用Gateway技术构建梅花鹿Tβ10基因的原核表达载体—pDEST17-Tβ10并诱导表达,对融合蛋白进行功能检测及多克隆抗体制备。结果表明:1)获得了190bp Tβ10基因开放阅读框序列,并获得重组表达载体pDEST17-Tβ10。2)pDEST17-Tβ10在宿主BL21-SI中诱导表达条件为0.3mol/L NaCL诱导2h,获得产物的最终浓度为0.50mg/mL。3)制备的Tβ10蛋白多克隆抗体血清效价在105之上,该抗体可以特异性结合天然和原核表达的Tβ10蛋白。4)离体检测发现,Tβ10融合蛋白一方面可以促进人脐静脉内皮细胞增殖,另一方面可以抑制鹿茸前成软骨区细胞的增殖。综上所述,本研究获得了具有生物活性的Tβ10融合蛋白,并制备了高度特异性的梅花鹿Tβ10蛋白多克隆抗体,为深入研究Tβ10基因的生物学功能奠定了基础。     

诺氟沙星多克隆抗体的制备

为了制备诺氟沙星(NFLX)抗体,将修饰成功的NFLX-NH2分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备完全抗原,用免疫抗原免疫小鼠,获得了高效价的诺氟沙星多克隆抗体.     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备(英文)

[目的]为克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并鉴定。[方法]以以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,WesternΒlotting检测抗体的特异性。[结果]适构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可以高效表达NrfA蛋白,免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1:204900,经WesternBlotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,构建了表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

猪c-Myc蛋白多克隆抗体的制备

【目的】克隆猪c-Myc基因CDS序列并构建其原核表达载体,同时纯化c-Myc蛋白并以此为抗原制备多克隆抗体,为进一步研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Rep蛋白与宿主c-Myc蛋白之间的交互作用奠定基础。【方法】根据猪c-Myc全基因序列(GenBank No. NM＿001005154)设计引物,以反转录PCR方法扩增c-Myc基因CDS序列,经Nde I/Xho I双酶切后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+);转化至Arctic-Express^TM大肠杆菌后诱导表达;表达产物经变性、复性和His-Band Ni+层析柱亲和纯化后免疫新西兰白兔。抗原亲和层析法纯化抗体后,用间接ELISA法测定其效价,用Western blot检测其特异性。【结果】经检测,克隆产生的猪c-Myc基因CDS序列长度为1 359 bp,c-Myc-His重组蛋白主要以包涵体形式出现,分子质量约为63 kDa,由此蛋白制备的多抗效价可以达到1∶1 093 500,并能特异性识别猪c-Myc蛋白和重组蛋白c-Myc-His。【结论】...     

大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白多克隆抗体的制备与应用

【目的】制备大口黑鲈蛙虹彩病毒主衣壳(MCP)蛋白兔多克隆抗体,以期为该病毒蛋白功能研究奠定基础。【方法】对pET32a(+)MCP/BL21重组大肠杆菌进行诱导表达,将重组蛋白进行纯化、复性,以此为抗原免疫大耳兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,间接免疫荧光试验（IFA）和Western Blot 法分析MCP多克隆抗体的特异性。【结果】纯化的MCP重组蛋白条带特异;间接ELISA结果显示,制备的兔多克隆抗体血清效价为1∶1 024 000;IFA和Western Blot检测结果表明该多抗特异性良好,能够与大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白发生特异性反应,IFA试验表明血清最适稀释度为1∶500。【结论】成功制备了大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP兔多克隆抗体,该抗体可特异性识别大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白。     

奶山羊DDX3Y蛋白多克隆抗体的制备

【目的】制备针对奶山羊DDX3Y蛋白的特异性多克隆抗体,为奶山羊H Y抗原蛋白DDX3Y的功能研究奠定基础。【方法】以奶山羊睾丸组织提取的RNA反转录所得的cDNA为模板,采用PCR方法扩增得到奶山羊DDX3Y基因CDs区全序列,测序后通过生物信息学方法比对分析确定DDX3Y蛋白N端1-120氨基酸及C端570-660氨基酸为抗原片段,然后用PCR分别克隆这2个片段的基因,最后利用搭桥PCR方法得到奶山羊DDX3Y截短抗原基因序列。将DDX3Y截短抗原基因序列连接pET32a(+)质粒,构建pET32a(+)-DDX3Y原核表达载体,将该载体导入到大肠杆菌BL21中诱导表达。通过Ni-NTA Resin纯化重组蛋白后免疫3月龄雌性新西兰大耳兔,采用间接ELISA(iELISA)法测定抗体效价,用Western blot测定抗体特异性。【结果】PCR扩增得到1 983 bp奶山羊DDX3Y基因CDs区全长序列及CDs区5′端360 bp(1-360 bp)序列和3′端273 bp(1 710-1 983 bp)序列。搭桥PCR获得了633 bp的DDX3Y截短抗原基因序列。成功构建了pET32a(+)-DDX3Y载体,并表达出分子质量约为42 ku的重组蛋白。制备出奶山羊DDX3Y截短抗原蛋白多克隆抗体,iELISA法检测抗体效价为1∶10⁵;Western blot检测表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别原核表达的奶山羊DDX3Y截短抗原蛋白以及公羊睾丸组织DDX3Y蛋白。【结论】成功制备出了奶山羊DDX3Y截短抗原蛋白多克隆抗体。     

巨型艾美耳球虫IMP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

免疫映射蛋白1(IMP1)是一种从巨型艾美耳球虫中发现的蛋白,具有良好的免疫原性和免疫保护性.本试验通过Em IMP1基因的克隆、原核表达以及多克隆抗体的制备,为后续深入研究该蛋白的生物学及免疫学功能奠定基础.首先,从未孢子化的巨型艾美耳球虫新疆株卵囊中提取总RNA,反转录合成c DNA,PCR扩增Em IMP1基因片段.其次,将Em IMP1基因扩增片段连接到原核表达载体p ET-28a构建表达质粒p ET-28a-Em IMP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株并进行表达;将纯化后的蛋白与等量弗氏佐剂乳化后皮下注射至2只新西兰大白兔体内,每隔2周免疫一次,一共免疫4次后取得的兔血清即为多克隆抗体.最后,用所获得的多克隆抗体,对纯化后的Em IMP1进行免疫印迹试验鉴定,用酶联免疫吸附测定法检测多克隆抗体的效价.结果表明,克隆出的Em IMP1基因的全长为1 140 bp,诱导出的蛋白大小为70 ku,且该蛋白在上清液和包涵体中均有存在.免疫印迹试验检测结果显示,用上述方法制备的多克隆抗体具有良好的特异性,酶联免疫吸附测定法检测结果表明该多克隆抗体具有高效价.因此,可通过原核表达蛋白Em IMP1免疫兔子制备特异性好且效价高的多克隆抗体.     

氯霉素人工多克隆抗体的制备、纯化与特性分析

通过合成氯霉素完全抗原,制备氯霉素的多克隆人工抗体,建立氯霉素(CAP)的免疫学检测方法。采用重氮法合成氯霉素完全抗原,以氯霉素牛血清白蛋白(CAP-BSA)免疫大耳白家兔,用ELISA方法进行鉴定和特性分析。结果显示,该抗血清与链霉素、青霉素、四环素等常见抗生素的交叉反应率均小于2.1%,IC50为13.65 ng/ml,检测限达到1.01μg/L。获得了选择性好、特异性较高的氯霉素特异抗体,可用于氯霉素的快速定量检测。     

鸡传染性支气管炎病毒HH06株膜蛋白多克隆抗体制备及生物学功能研究

文章通过RT-PCR方法扩增传染性支气管炎病毒（IBV）HH06株M全长基因,经抗原性和亲水性分析,将M部分序列成功亚克隆于pET-30a（+）和PVAX1载体中。将阳性重组质粒pET30a-M转化E. coli Rosetta （DE3）感受态细胞,诱导表达获得20 ku重组M蛋白。Western blot检测表明,重组蛋白能够与IBV参考阳性血清反应。以纯化重组M蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,其ELISA效价达到1??218;Western blot结果证实,其具有良好的反应性和特异性。间接免疫荧光试验表明,抗M蛋白多克隆抗体可检测到PVAX-M1转染BHK-21细胞表达的M蛋白,与IBV HH06毒株具有很好的特异性反应。病毒感染抑制试验表明,多抗血清对IBV Beaudette株的抑制率可达到25.9%。为IBV检测及M蛋白功能的研究奠定基础。     

溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。ELISA法获得OmpK抗血清效价达1∶1 600,Western-Blotting试验证实抗血清具有很好的特异性。OmpK菌株最佳诱导表达条件为:菌液OD600值0.8,IPTG终浓度0.3mmol/L,诱导时间8h,诱导温度32℃;最佳培养条件为:不添加葡萄糖,转速230r/min,装液量50mL。【结论】成功制备了OmpK蛋白多克隆抗体,确定了OmpK蛋白菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。     

鸡氨肽酶N蛋白多克隆抗体制备及其生物学功能研究

试验参考Gen Bank上鸡氨肽酶N(g APN)基因序列(登录号为NM_204861.1)设计多对特异性引物,利用RT-PCR分段克隆g APN基因各段克隆产物并利用SOE-PCR将其进行连接,得到大小为2 906 bp的全长基因。利用原核表达载体p ET-30a(+)构建重组质粒p ET-g APN并转化E.coli Rosetta,经诱导表达得到大小为113 ku目的条带。以纯化g APN重组蛋白为免疫原制备兔抗g APN多克隆抗体,间接Elisa方法检测多抗血清效价为215。Western Blot试验证明,此多克隆抗体可以与原核表达的蛋白产生特异性条带,同时与18日龄鸡肾组织中获得的天然g APN蛋白样品有良好的反应性。间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体可检测到pc DNA-g APN转染HELA细胞所表达的g APN蛋白。上述结果可为g APN蛋白的深入研究奠定基础。     

口疮病毒O2O基因的克隆、表达及多抗制备

羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病。020基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白。根据Gen Bank中020基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因。然后将其亚克隆至p ET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒p ET-32a-ORF-020。鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清。SDS-PAGE结果表明,ORFV 020基因在体外获得正确表达,大小约37 k Da。Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与020蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性。     

黄海希瓦氏菌多克隆抗体部分特性的分析

采用免疫学方法,以仿刺参Apostichopus japonicus＂化皮病＂病原菌——黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi AP629福尔马林灭活疫苗作为免疫原,对新西兰大白兔进行免疫,制备了高效价的多克隆抗体。通过间接酶联免疫、间接免疫荧光和免疫印迹等技术对多克隆抗体的部分特性进行了分析。结果表明：获得的多克隆抗体的效价为1∶32768;多抗与黄海希瓦氏菌标准菌株存在很强的阳性反应,与弧菌和气单胞菌、链球菌和大肠杆菌交叉反应很弱或不存在交叉反应;多抗不仅与菌体本身反应,与菌株表面的分泌物也发生特异性结合。免疫印迹结果显示,多克隆抗体与黄海希瓦氏菌AP629结合的抗原决定簇主要蛋白带有6条,相对分子质量分别为131 000、128 000、113 000、62 000、38 000和33 000,其中38 000和33 000蛋白条带的抗原性最强;与胞外产物结合的抗原决定簇清楚的蛋白条带主要有3条,相对分子质量分别为62 000、38 000和33 000,其中62 000蛋白条带的信号最强。     

人XIAP基因多克隆抗体的快速制备方法研究

【目的】探索快速制备高品质X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)多克隆抗体的方法,为研究XIAP基因的功能及XIAP蛋白在肿瘤组织中的表达量检测提供参考。【方法】通过RT-PCR方法获得人XIAP基因的CDs区序列,与pET151/D-TOPO载体连接,构建XIAP基因的原核表达载体;考察细胞密度(OD600)、IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对XIAP重组蛋白表达量的影响,以确定XIAP重组蛋白的最佳诱导条件,并用Ni-NTA亲和层析柱法纯化XIAP重组蛋白;用纯化的XIAP重组蛋白对2只成年新西兰白兔进行常规免疫后,再对其中1只进行耳静脉注射加强免疫,连续3d,每天免疫1次,用ELISA检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性。【结果】①通过RT-PCR方法获得人XIAP基因的CDs区序列,与pET151/D-TOPO载体连接,构建XIAP基因的原核表达载体,测序后,与GenBank中序列的的相似度为97%。②XIAP重组蛋白的最佳诱导条件为:温度30℃,初始诱导细胞密度(OD600)为0.6,IPTG浓度0.5mmol/L,诱导时间4h。在此条件下,XIAP重组蛋白多以包涵体的形式存在于细胞沉淀中。③利用Ni-NTA亲和层析柱法,在pH为5.9和4.5的洗脱液中均可获得质量浓度为600μg/mL的XIAP重组蛋白。④耳静脉连续加强免疫是刺激动物机体快速产生抗体的有效方法(31d)。ELISA和Western blot检测结果表明,耳静脉连续加强免疫产生的XIAP抗体的效价和特异性均明显高于常规免疫所产生的抗体。【结论】耳静脉连续加强免疫能够显著提高XIAP抗体的效价,且能有效缩短多克隆抗体的制备时间。