广东省罗非鱼及其养殖环境中食源性致病菌菌相分析

对广东省3个不同产区罗非鱼及其养殖环境中食源性致病微生物的构成进行了分析。采用选择性培养基、生物梅里埃微生物鉴定系统与Biolog微生物自动化鉴定系统相结合的方法对罗非鱼和养殖环境中的主要食源性致病菌种类进行分离鉴定。结果表明：罗非鱼鱼体及其养殖环境中存在的主要食源性致病菌种类,随季节的不同而有变化,其中以夏季致病菌种类最多,鱼体及其养殖环境分别为11和12种致病菌;而春季鱼体中致病菌较少,为6种。罗非鱼鱼体及其养殖环境中以致病性嗜水气单胞菌、致泻大肠埃希氏菌、沙门氏菌最为常见,四季均有,其中致病性嗜水气单胞菌以春夏季节检出率较高,环境中检出率达83％～89％,鱼体中达44％～67％;致泻大肠埃希氏菌环境中春夏秋季检出率达83％～100％,鱼体夏秋季中达48％～67％;沙门氏菌环境中春秋季检出率达33％～39％,鱼体中达44％～52％。其次在罗非鱼鱼体还分离到霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、阴沟肠杆菌、阪崎肠杆菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌等致病菌。     

常见病害防治方法

淡水鱼类细菌性败血症 病原：嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、鲁氏耶尔森菌、豚鼠气单胞菌和产碱假单胞菌等多种革兰氏阴性杆菌。     

嗜水气单胞菌毒力因子研究进展

嗜水气单胞菌是一种广泛分布于自然界中的革兰氏阴性菌,是一种人一兽一鱼共患病的条件致病菌。其危害的产生与其外毒素、胞外蛋白酶及表面分子等毒力因子的分泌、表达相关。研究其毒力因子有利于深入了解该菌的致病机理,探索有效的防治方法。本文综述了嗜水气单胞菌毒力因子的相关研究进展。     

肉桂醛纳米乳的制备及其抑菌效果研究

为评价肉桂醛纳米乳对水产动物致病菌的抑菌效果,以吐温-80为表面活性剂、乙醇为助表面活性剂、乙酸乙酯为油相,加蒸馏水按比例配制成空白纳米乳,加入肉桂醛制备得肉桂醛纳米乳,并评价了肉桂醛纳米乳的部分特性;探究肉桂醛纳米乳对迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)4种常见水产动物致病菌的抑菌效果。结果显示,肉桂醛纳米乳中吐温-80、乙醇、乙酸乙酯、蒸馏水和肉桂醛质量比为10∶5∶11∶73∶1,空白纳米乳对肉桂醛的最大载药量为20.11 mg/m L,肉桂醛纳米乳为水包油型淡黄色澄清透明液体,粒径5~20 nm,平均粒径10.74 nm;与同浓度肉桂醛溶液相比,肉桂醛纳米乳具有更强的抑菌活性,在最大载药量时,对嗜水气单胞菌、鳗败血假单胞菌、迟缓爱德华氏菌、温和气单胞菌的抑菌强度分别提高了65.56%、46.99%、41.94%、26.91%。肉桂醛纳米乳对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、鳗败血假单胞菌、迟缓爱德华氏菌的最小抑菌浓度(MIC)分别0.31、0.51、0.72、1.00 mg/m L。研究表明,肉桂醛纳米乳在水产养殖中具有潜在的应用价值。     

鱼菌清治疗银鲫细菌性疾病的效果

近几年,鱼类人工养殖已经形成规模化和集约化的养殖模式.在银鲫养殖中,细菌性疾病已成为常见疾病,其发生概率逐年增高,严重影响银鲫的经济效益.银鲫养殖中常见的病原菌主要有荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌和副溶血弧菌等.鱼菌清主要的成分为盐酸环丙沙星盐酸小檗碱预混剂,对革兰氏阴性菌和球菌均有效,包括铜绿...     

美国青蛙膨气病病原菌的分离鉴定及药敏试验

经对膨气病病原菌的分离鉴定，嗜水气单胞菌与假单胞菌属细菌是致病菌。药敏试验结果：庆大霉素，氯霉素对致病菌有较强的杀灭作用，中草药黄连，黄岑也有一定的抑制作用，该病发生与环境条件密切相关，保持良好的养殖水质环境是预防该病的最好方法。     

27株嗜水气单胞菌致病性及ERIC—PCR指纹图谱分析

从福建省淡水养殖鱼类体内分离到27株嗜水气单胞菌,根据嗜水气单胞菌16SrDNA基因和气溶素基因（aerolysin）的保守序列,设计2对引物,对所分离到的27株嗜水气单胞菌进行双重PCR扩增,扩增结果表明,其中18株为含有Aer毒力基因的潜在致病性嗜水气单胞菌,占总菌数的66．67％。应用ERIC-PCR分型技术对27株嗜水气单胞菌菌株进行分析,以相似度54．00％为限,所有菌株可分为Ⅰ和Ⅱ两大聚类,以76．00％相似度为界,27株嗜水气单胞菌可分为11个聚类,同一个聚类中菌株分离区域基本相同。分析结果表明,分离的嗜水气单胞菌基因型的多样性和分离地域具有一定的关联,也表明ERIC-PCR可以有效应用于嗜水气单胞茵分子流行病学调查。     

鲤隐性败血症病原菌的分离与鉴定

本文对东北地区流行的鲤隐性败血症进行了病原菌的分离、人工感染、病原菌生理、生化特性和药物敏感性的测定,观察了病理组织变化等。从病鱼内脏分离到场22株致病菌,其中标7株的生长及生化特性均符合嗜水气单胞菌种的特性,嗜水气单胞菌hec毒素检测呈阳性。有3株菌V—P(-)、赖氨酸(-)、葡萄糖产气(-)是区别嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及温和气单胞菌(A．Sobrie)主要特征,这三株菌符合豚鼠气单胞菌(A．Caviae)种的特征。     

嗜水气单胞菌感染后牛蛙血清中抗菌物质的初步研究

用1×107 mL-1的嗜水气单胞菌腹腔注射感染牛蛙,注射后7 d内试验组牛蛙血清抗菌活性都高于对照组,其中在3 d、7 d时存在显著性差异,峰值出现在感染后第3天。收集第2批人工感染后3 d时牛蛙的血清。该血清经Sephadex G25凝胶柱分离后,并在波长280 nm处测定紫外吸收值,得到两个吸收峰。以嗜水气单胞菌检测分离物的抗菌活性,结果表明经诱导的血清抗菌物质主要集中在第1个吸收峰。通过对金黄色葡萄球菌等10株指示菌抗菌谱的测定,其对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等具有明显的抗菌作用;SDSPAGE分析显示抗菌蛋白分子量较大。结果说明：牛蛙被嗜水气单胞菌感染后能很快产生多种抗菌物质,主要的抗菌物质是分子量比较大的物质,这些抗菌物质对部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有抗菌作用。图3表1参24 关键词：牛蛙;嗜水气单胞菌;抗菌蛋白;抗菌活性     

大黄鱼源气单胞菌的分离鉴定及致腐表型

为鉴别大黄鱼腐败菌气单胞菌的致腐能力,采用生理生化和分子方法(16S r RNA)鉴定冷藏大黄鱼货架期终点不产H2S的菌株。分析菌株在体外培养条件下的生长、胞外酶活性、三甲胺(TMA)和生物胺形成的腐败表型,将菌株接种在灭菌鱼汁中测定其致腐能力。结果显示,分离株AE03和AE04在0~37°C及0~60的盐度下生长良好,在4和25°C条件下AE03菌株的生长速率显著高于AE04菌株。2株细菌不产H2S,能还原氧化三甲胺(TMAO),分解尿素和液化明胶,氧化酶、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸水解酶等都呈阳性,能利用葡萄糖。结合16S r RNA鉴定发现分离株AE03为杀鲑气单胞菌,AE04为软体动物气单胞菌。在体外培养中,2种气单胞菌均能产生蛋白酶、形成TMA和生物被膜,其中AE03菌株生成各指标的能力高于AE04菌株,同时AE03菌株还具有脂酶活性,产生生物胺,其中尸胺含量较高。气单胞菌AE03在灭菌鱼汁中产生的挥发性盐基氮(TVB-N)显著高于AE04。通过紫色杆菌CV026和根癌农杆菌A136 2种报告菌检测发现,2株气单胞菌是高丝氨酸内酯(AHLs)产生菌,其中AE03菌株产生的AHLs含量显著高于AE04菌株。研究表明,杀鲑气单胞菌AE03为冷藏大黄鱼的强致腐菌,且能分泌高含量的AHLs,研究为从群体感应角度阐明气单胞菌的致腐机理奠定了良好的基础。     

芽孢杆菌R1共培养对嗜水气单胞菌NJ-1毒力基因表达的影响

为探讨芽孢杆菌潜在的淬灭靶点,本研究通过芽孢杆菌R1与嗜水气单胞菌NJ-1共培养,并对NJ-1生物量、信号分子产生量、毒力因子基因和群体感应(QS)关键调控基因表达量进行检测。结果显示:1NJ-1单独培养时,信号分子BHL和HHL的产量与NJ-1生长趋势一致,在27 h时达到峰值并启动Lux R表达,进而调控毒力因子金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、肠毒素、气溶素和血溶素等表达,其在27~30 h时呈现峰值表达,通路Qse B在27~30 h启动表达,48 h时达到峰值,而种间调控Lux S基因表达一直处于低水平状态;2与芽孢杆菌R1共培养时,仅痕量AHLs信号分子被检出,毒力因子相关基因表达量均显著下调;Lux R表达受抑制,Lux S在36 h时表达量显著上调,未影响Qse B正常表达;3AHLs与R1共培养可被显著降解。研究表明,芽孢杆菌R1抑制NJ-1毒力因子相关基因表达可能与其对NJ-1多QS系统进行调控相关联。     

致病性嗜水气单胞菌生物膜的形成特性

应用改良的微孔板法研究了致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B 11的生物膜形成特性.结果显示,嗜水气单胞菌Bil能够在聚苯乙烯酶标板表面形成稳定而明显的生物膜,其生物膜的OD_590值在6h即达到小高峰,于22 h达到峰值,其后随着培养时间的延长而降低;随着初始菌液浓度的增加,生物膜的OD_590值逐步降低;25℃的生物膜的OD_590值显著高于其他温度的生物膜生成量(P<0.05);在起始pH值为3～4的营养肉汤中,嗜水气单胞菌几乎不能形成生物膜,OD_590值接近空白对照,而在pH值为5-10的营养肉汤中,嗜水气单胞菌均能形成明显的生物膜,且差异性不显著(P>0.05);培养液中添加氯化镁达到1 mmol/L时,生物膜的OD_590值会显著性降低(P<0.05);培养液中添加氯化钙达到lmmol/L时,生物膜的OD_590值显著性提高(P<0.05);嗜水气单胞菌在肌肉组织液包被的96孔酶标板上的生物膜形成量有所增加(P<0.05),而在其他黏液和组织提取液包被的酶标板上的生物膜形成量与对照组相比没有显著性差异(P>0.05).研究结果表明,嗜水气单胞菌Bil能在聚苯乙烯酶标板表面形成稳定而明显的生物膜;其生物膜的形成能力受温度、酸碱度、起始菌液浓度、钙、镁离子浓度等因素的影响;肌肉组织提取液也存在能影响生物膜形成的成分.本研究旨在为探讨嗜水气单胞菌生物膜形成机制和致病机理提供参考.     

循环水养殖系统中高毒力嗜水气单胞菌的鉴定与药敏试验

为探究中华鳖(Pelodiscus sinensis)循环水养殖过程中出现体表穿孔和溃疡的病因,对患病中华鳖的肝、脾、肺和肾等部位取样并进行病原菌分离及革兰氏染色,利用16S rRNA测序和生化鉴定相结合进行细菌鉴定,通过毒力基因PCR检测和人工回感试验评估细菌的致病性,以纸片扩散法评估几种抗生素的抑菌效果,利用琼脂打孔法评估中药提取物的抑菌效果。结果显示,从病鳖的脏器中分离到一株优势菌AH0421,该菌为革兰氏阴性菌,菌体呈短杆状;菌株AH0421与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)模式菌株ATCC 7966的16S r RNA序列相似性高达99.66%。菌株AH0421能利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖,具有O/129耐受性,其携带act、aerA、aha、ahh、ahp、ahpA、alt、ast、hlyA、lip、ompA毒力基因。回感试验出现与自然发病相似病症,菌株AH0421半致死浓度(LC₅₀)为1.7×10⁶CFU/mL。中药五味子提取物、诺氟沙星、多西环素、恩诺沙星、新霉素以及头孢克肟、头孢曲松等头孢类抗生素对该...     

淡水养殖动物致病性嗜水气单胞菌ERIC-PCR分型与耐药性

以质控菌株ATCC7966为对照,采用ERIC-PCR方法对49株分别采集于中国浙江、江苏、江西、广东、湖北、上海等主要淡水养殖区的致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了基因分型,并分析了嗜水气单胞菌对12种抗生素的耐药模式,探讨了嗜水气单胞菌的基因型与区域性分布及其耐药性的关联性。实验结果表明,50株受试嗜水气单胞菌菌株可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ这12个基因型,其中Ⅷ型菌株最多,Ⅲ型和Ⅹ型菌株最少。此外,50株受试菌株对氨苄青霉素(AMP)的耐药率高达100%,对头孢氨苄(CX)的耐药率高达98%,94%以上的菌株对氨基糖苷类及喹诺酮类抗生素未产生耐药性。受试菌株对12种抗生素呈现出AMP、CX/AMP、CX/AMP/POL(多黏菌素)、CX/AMP/SMZ(复方新诺明)、CX/AMP/NM(新霉素)、CX/AMP/SMZ/POL、CX/AMP/SMZ/POL/GM(庆大霉素)、CX/AMP/SMZ/LOM(洛美沙星)/ENR(恩诺沙星)、CX/AMP/SMZ/LOM/ENR/OF(氧氟沙星)/LEV(左氟沙星)这9种不同的耐药模式,其中Ⅻ型菌株的耐药...     

luxR基因调控嗜水气单胞菌耐药性的分子机制初探

LuxR家族蛋白是一类在革兰氏阴性细菌中发挥重要作用的调控蛋白,参与细菌多项重要生理活动。采用RNAi技术构建嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) luxR05735稳定沉默菌株luxR05735-RNAi,并利用qRT-PCR检测基因沉默效果。结果显示,与野生株相比,沉默株中luxR05735的表达量降低了96.8%。药物敏感性实验表明,与野生株相比,luxR05735-RNAi对庆大霉素、诺氟沙星、卡那霉素、吡哌酸的耐药性显著降低。对野生株与沉默株luxR05735-RNAi的转录组数据进行分析发现,表达差异显著的基因共有1286个,其中,上调基因353个,下调基因933个;显著富集的通路4条,分别是核糖体通路、精氨酸生物合成通路、硫代谢通路、硒化合物代谢通路;在这4条通路中可能与嗜水气单胞菌耐药性相关的重要功能基因包括metE、glnA、rplB、rplX、rpsA、rpsJ等,这些功能基因编码的蛋白主要与细菌的生物成膜及核糖体蛋白合成相关。综合以上研究结果,可以推测嗜水气单胞菌的luxR05735通过调控细菌的生物膜形成相关基因及核糖体蛋白相关基因的表达,从而调控细菌对药物的耐受性。     

Effect of biofilm formation on antimicrobial tolerance of Flavobacterium psychrophilum

Treatment of bacterial fish diseases can be complicated by resistant bacterial biofilms harbouring pathogenic bacteria and causing recurrent exposure of fish to infections. In this study, the effect of biofilm formation on antimicrobial tolerance was examined using three bacterial isolates of the fish pathogen Flavobacterium psychrophilum and two antimicrobial agents, oxytetracycline and flumequine, commonly used in aquaculture. Planktonic and biofilm cells were exposed to a minimum inhibitory concentration (MIC), to a 3 × MIC concentration and to an environmental concentration level of each antimicrobial in 96-well microtitre plates after which growth on agar plates was measured. The type strain NCIMB1947 of F. psychrophilum was further used to study the development of antimicrobial resistance in biofilm cells. The results suggest that at high bacterial densities (>10(7) CFU mL(-1)), biofilm cells of F. psychrophilum are less susceptible to antimicrobial agents. Furthermore, the results imply that biofilm cells of F. psychrophilum may rapidly develop resistance to both oxytetracycline and flumequine if exposed to subinhibitory concentrations of these antimicrobials.     

革胡子鲶出血性败血症病原菌的分离鉴定

从暴发性死亡的革胡子鲶(Clarias gariepinus)中分离出可疑病原菌株2010111403(简称1403),分别采用细菌全细胞脂肪酸鉴定系统、Biolog微生物自动鉴定系统及细菌16 S rDNA序列分析三种方法对其鉴定,结果表明菌株1403为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。分离菌株对健康革胡子鲶致病性测试表明其对革胡子鲶的半数致死剂量(LD50)为6.32×106菌落形成单位(CFU);实验感染革胡子鲶出现与自然发病相似症状,表明菌株1403是引起革胡子鲶发生暴发性死亡的主要致病病原。药敏试验表明,庆大霉素、四环素、阿奇霉素、氟哌酸、先锋霉素等9种抗生素对分离菌株有较强的抑制作用,但分离菌株对复方新诺明、克林霉素、罗红霉素等4种药物表现出耐药性。     

The role and mechanism of icmF in Aeromonas hydrophila survival in fish macrophages

Survival in host macrophages is an effective strategy for pathogenic bacteria to spread. Aeromonas hydrophila has been found to survive in fish macrophages, but the mechanisms remain unknown. In this paper, the roles and possible mechanisms of IcmF in bacterial survival in fish macrophages were investigated. First, a stable silencing strain icmF‐RNAi was constructed by shRNA and RT‐qPCR confirmed the expression of icmF was down‐regulated by 94.42%. The expression of Hcp, DotU and VgrG was also decreased in icmF‐RNAi. The intracellular survival rate of the wild‐type strain was 92.3%, while the survival rate of icmF‐RNAi was only 20.58%. The escape rate of the wild‐type strain was 20%, while that of the icmF‐RNAi was only 7.5%. Further studies indicated that the expression of icmF can significantly affect the adhesion, biofilm formation, motility and acid resistance of A. hydrophila, but has no significant effect on the growth of A. hydrophila even under the stress of H₂O₂. The results indicated that IcmF of A. hydrophila not only acts as a structural protein which participates in virulence‐related characteristics such as bacterial motility, adhesion and biofilm formation, but also acts as a key functional protein which participates in the interaction between bacteria and host macrophages.     

日本鳗鲡腐皮病病原菌的分离及鉴定

从患腐皮病的日本鳗鲡(Anguilla japonica)体表溃烂处分离到1株病原菌(322A),对其进行了人工感染实验和生理生化分析,测定了该菌株的16S rRNA基因序列和促旋酶(gyrase)B亚单位gyrB基因序列,并分别构建系统发育树。结果显示:感染实验证实菌株322A具有致病性;生理生化分析鉴定该菌株属于气单胞菌属(Aero-monassp.);16S rRNA基因分析显示,该菌株与气单胞菌属细菌的同源性均在99%~100%,构建的系统树显示,菌株322A与嗜水气单胞菌(A.hydrophila(FJ462702))亲缘关系最近;gyrB基因分析表明,该菌株与A.hydrophila种内序列的相似性为96%~98%,种间序列的相似性为94%~95%,构建的系统树结果显示,该菌株与A.hydrophila(FJ608553、FJ608552、AF208259)聚为一个分支。综合上述实验结果,菌株322A可鉴定为嗜水气单胞菌(A.hydrophila)。