皂角苷对大菱鲆血细胞的溶血作用

通过显微观察初步测定了不同浓度皂角苷(2.5、5、12.5、25、50、125 mg/L)融解大菱鲆红细胞的时间及其对白细胞的裂解作用;比较了4℃与20℃条件下,不同浓度皂角苷(2.5、5、12.5、25、50 mg/L)在体外对大菱鲆血细胞的溶血活性;用不同浓度的皂角苷溶液浸浴大菱鲆,得出皂角苷对大菱鲆的半致死浓度;同时分析了不同浓度皂角苷(0、5、25、45 mg/L)浸泡大菱鲆后血液中乳酸脱氢酶(LDH)活力变化。结果显示,显微观察实验中红细胞溶血时间与皂角苷浓度呈对数负相关(R2=0.982 5),皂角苷对大菱鲆白细胞也具有细胞裂解作用;50mg/L的皂角苷在20℃条件下5 min即可导致血细胞100%溶血,而4℃时处理相同时间仅为42.2%;皂角苷对大菱鲆的24 h半致死浓度(24h LC50)为64.85 mg/L。本研究的结果从细胞水平上初步评价了皂角苷的溶血毒性,为其安全使用提供了理论支持。     

A3α肽聚糖对彭泽鲫生长及非特异免疫机能的影响

为探讨肽聚糖对彭泽鲫非特异免疫功能的影响及促长作用,将不同剂量的A3α肽聚糖添加于饵料中投喂彭泽鲫,测定鲫鱼体重、白细胞吞噬活性、血清和体表粘液溶菌酶活性,以及活菌攻毒后的免疫保护率。结果表明,添加250~550 mg/kg肽聚糖可显著提高彭泽鲫鱼白细胞吞噬活性、体表粘液及血清溶菌酶活性,但对鲫鱼生长均无明显促长效果;鲫鱼口服肽聚糖药饵后抗病能力增强,感染后的死亡率明显降低;在饵料中肽聚糖适宜添加量为250~450 mg/kg。     

氨氮对凡纳对虾免疫指标的影响

以凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,研究氨氮对其免疫指标的影响。实验氨氮质量浓度梯度设置为0.05(对照)、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg／L,各氨氮梯度用4g／L的氯化铵溶液来调节。将暂养在自然海水(对照)中的凡纳对虾分别放入各实验梯度中,对虾体长为(8.5±0.5)cm。结果表明,氨氮对凡纳对虾血细胞数量、血清中的酚氧化酶活力、溶菌和抗菌活力的影响显著(F>F0.05),且随着氨氮质量浓度的升高,血细胞数量和溶菌、抗菌活力降低,酚氧化酶活力升高;在0-24 h实验时间内,各处理组(对照组除外)对虾血细胞数量和溶菌、抗菌活力呈下降趋势,酚氧化酶活力呈上升趋势,24 h后稳定在较低水平上。实验说明,随着氨氮水平升高,凡纳对虾免疫力明显下降,对病原菌的易感性提高,因此在养殖过程中,环境氨氮变化幅度不应超过0.5 mg／L,或长时间维持在较高氨氮水平(>0.5 mg／L)。     

溶藻胶弧菌脂多糖对大菱鲆白细胞吞噬活性的影响

针对溶藻胶弧菌脂多糖在增强大菱鲆非特异性免疫功能、提高机体抗病能力方面的作用机理,开展了研究工作。实验中以浓度为2．4mg／ml 溶藻胶弧菌脂多糖,通过口服和注射的方式接种平均体重47．2g 大菱鲆幼鱼,接种后第7、15、 30天,分别采血根据血细胞吞噬作用检测结果计算吞噬百分比和吞噬指数。结果显示,溶藻胶弧菌脂多糖对白细胞吞噬活性有明显促进作用,在增强白细胞的吞噬能力方面作用不显著。     

恩诺沙星对红笛鲷血清中碱性磷酸酶活力、抗体IgM含量、溶菌酶含量及其抗菌能力的影响

以间隔200mg／kg的恩诺沙星设置8个浓度梯度腹腔注射红笛鲷进行急性毒性实验,测得其安全浓度为67．56mg／kg,参考安全浓度及日常生产给药量取0、20、40、80mg／kg鱼体重恩诺沙星,以腹腔注射及拌料投喂两种不同给药方式,研究恩诺沙星在该浓度范围内对红笛鲷血清中一些免疫指标及其感染细菌后死亡率的影响。实验结果表明恩诺沙星在40m非g浓度组中提高AKP活力、IgM含量、溶菌酶含量的同时可提高红笛鲷抵抗外界细菌感染的能力（P〈0．05）。当用药浓度不足（20mg/kg组）或浓度过高（80mg／kg组）,虽然对AKP活力和IgM含量也有影响,但在投喂组中,红笛鲷体内的IgM含量受抑制显著,经腹腔注射2．3×10^7 CFU／mL溶藻弧菌 （ Vibrio alginolyticus ）攻毒后,注射组中相对生理盐水组的死亡率55％;20、40、80mg／kg浓度组红笛鲷的死亡率分别为45％、30％、50％;投喂组中,0、20、40、80mg,kg浓度组红笛鲷的死亡率分别为55％、40％、30％、60％;40mg／kg浓度组中抗菌能力增强;20、80mg／kg浓度组中红笛鲷抗菌能力不受影响或有负面影响。     

黄芪多糖佐剂对大菱鲆五联疫苗免疫增效作用

用福尔马林灭活哈维氏弧菌、鳗弧菌、迟钝爱德华氏菌、大菱鲆弧菌和溶藻胶弧菌制备成五联灭活疫苗,添加黄芪多糖作为佐剂。分别用添加黄芪多糖佐剂组和无佐剂组对大菱鲆进行腹腔注射,在第7、14、21、28、35、42、56天采取血样并检测抗体效价、溶菌酶活力和SOD活力,第56天进行人工攻毒实验,测定免疫保护力。结果表明,黄芪多糖佐剂组(免疫组2)和无佐剂组(免疫组1)两组的溶菌酶活力和SOD活力都在第28天达到最高值,且黄芪多糖佐剂组显著高于无佐剂组(P<0.05)。两个免疫组抗体效价也都在第28天达到最大值,但黄芪多糖佐剂组要显著高于无佐剂组(P<0.05),其中免疫组2的哈维氏弧菌、鳗弧菌、迟钝爱德华氏菌、大菱鲆弧菌和溶藻胶弧菌的抗体效价分别为27.25、26.75、28.5、28.75、26.25,免疫组1分别为26、25.75、26.75、27.5、25。用上述5种细菌分别进行人工攻毒实验,结果表明,免疫组2的免疫保护力依次为50.0%、50.0%、71.4%、62.5%、44.4%;免疫组1的免疫保护力依次为37.5%、30.0%、42.9%、50.0%、33.3%。实验结果证明,五联疫苗对大菱鲆具有免疫作用,而且添加黄芪多糖佐剂组的免疫效果显著好于无佐剂组。     

环境胁迫对大菱鲆C-型凝集素功能的影响

大菱鲆C-型凝集素(SmLec1)是一种重要的免疫因子,本实验通过分析其活性特点以及环境胁迫对其表达调控的影响,探讨其在大菱鲆先天免疫应答过程中的潜在功能以及养殖环境中的应用。实验利用原核表达系统进行重组表达,并通过纯化获得19 ku重组目的蛋白;活性分析结果显示,SmLec1对所选6种细菌的凝集作用存在差异,其中对鳗弧菌和爱德华氏菌具有明显的凝集作用;在选取的8种糖类中,木糖、果糖、蔗糖、乳糖和甘露糖能够抑制SmLec1的凝集活性;在理化因子(pH、温度)中,pH7和温度37°C时对SmLec1的凝集活性产生抑制;鳗弧菌感染实验显示,感染6 h时肝组织的SmLec1表达量明显上升,在12 h时达到最高值,随后有所下降;温度胁迫时肝组织的SmLec1 m RNA表达量受到温度的影响显著,在19°C开始升高,22~27°C呈降低趋势,其他组织变化不显著。盐度胁迫对SmLec1在各盐度的表达量变化不显著。研究表明,SmLec1能够抑制鳗弧菌的感染,其表达受到温度的影响,本研究为进一步明确SmLec1蛋白的抗菌机理和探索对大菱鲆疾病的免疫学防治途径提供科学依据。     

低盐胁迫对刺参非特异性免疫酶活性及抗菌活力的影响

以养殖刺参为研究对象,测定了不同强度盐度胁迫对刺参生存、生长及体腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶（LZM）活性及抗菌活力的影响。结果表明,1）盐度16实验组刺参存活率最低,为66.7%,与其他各实验组及对照组差异显著（P<0.05）;盐度18、20实验组存活率分别为88.9%、92.6%,无显著差异（P＞0.05）;盐度≥22时,刺参能够全部存活,实验组刺参生长与对照组相比差异显著（P<0.05）。盐度≤20时,刺参生长表现为负增长。2）刺参体腔液中SOD、LZM活性及抗菌活力随时间变化呈现总体降低的趋势。实验开始时,各实验组SOD、LZM活性及抗菌活力均为最高值,30 d时,各实验组SOD、LZM活性及抗菌活力降至最低。低盐胁迫会显著影响刺参正常生存、生长,并导致刺参免疫力降低,增加对病原菌的易感性,从而诱导疾病发生并造成死亡。     

人工感染溶藻弧菌对大黄鱼免疫功能的影响

为了解大黄鱼在抗溶藻弧菌感染时免疫功能的变化规律,将160尾健康大黄鱼分为感染组和对照组,通过腹腔分别注射0.2 mL浓度为2×107 CFU·mL-1的溶藻弧菌和灭菌生理盐水,在注射0,1,3,7,11,15,19 d后从两组各取6尾大黄鱼,尾静脉取血,进行外周血的血相、NBT阳性细胞数、血清抗菌活力、抗体效价等免疫学指标的测定。结果显示：在人工感染的初期,感染组大黄鱼外周血的红细胞、白细胞、淋巴细胞和NBT阳性细胞的数量及血清抗菌活力等指标均较对照组有显著提高;在注射后1 d外周血粒细胞的数量显著低于对照组;抗体效价在7 d开始增加,15 d达到峰值,且用间接ELISA和试管凝集两种方法所得结果具有非常高的同步性。结果表明：在感染溶藻弧菌后,大黄鱼能通过红细胞和白细胞增殖、释放抗菌物质、产生特异性抗体等方式提高其对溶藻弧菌的免疫力;在感染的早期阶段非特异性免疫因子起主要作用,在感染后期阶段特异性免疫因子起重要作用;NBT阳性细胞数可以作为细菌感染的指标。图2表1参24     

三疣梭子蟹血淋巴免疫功能的初步研究

利用API ZYM试剂盒和酶活力测试盒检测了三疣梭子蟹血细胞及血清中的19种酶类及血清中溶菌酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和过氧化物酶的活性。试验结果表明,在雄蟹血清和血细胞中均检测到19种酶,在雌蟹血清和血细胞中分别检测到18种和16种。碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性很低。在此基础上,研究了三疣梭子蟹血清和血细胞溶解物(HLS)对溶藻弧菌的抗菌活力,结果显示血清样品对溶藻弧菌的抗菌活力较强,但其体外作用的持续时间较短;而血细胞溶菌酶对溶藻弧菌的抗菌活力较弱。     

饲料Vc对大菱鲆非特异性免疫力的影响

X用维生素C（Vc）含量为0～2500mg／kg的配合饲料连续投喂大菱鲆70d后，测定大菱鲆血液白细胞的总数、吞噬活性、血清溶菌酶活性和总补体活性。结果表明，饲料中Vc含量增加到250mg／kg，白细胞总数明显增加，进一步提高Vc含量，白细胞总数没有显著变化；血清溶菌酶活性在Vc含量为250mg／kg时最高，其他各组无显著性差异；添加Vc的各试验组的总补体活性明显地高于对照组，但是添加Vc的各组之间的总补体活性没有显著性差别；Vc含量对白细胞的吞噬活性没有影响。     

大菱鲆选育家系雌、雄群体的生长发育差异

采用全长/体长、体高/体长、全长/体高和体质量为评价指标,分别对9~33月龄大菱鲆雌、雄群体在生长发育过程中体型的动态变化及生长性能差异进行了比较。大菱鲆雌、雄群体形态比较结果显示,雌、雄群体的全长/体长、体高/体长、全长/体高在不同发育阶段呈现特有的变化,但在雌、雄群体间,除33月龄的体高/体长和全长/体高差异达到显著水平外,3项指标在不同阶段没有差异或差异不显著,即可以认为,对于统计初始体质量相同或相近的大菱鲆雌、雄群体,全长/体长、体高/体长和全长/体高3个形态比例指标是随发育时间序列同步变化。基于Logistic模型对大菱鲆雌、雄群体生长性能的比较结果显示,雌性群体的拐点月龄、拐点体质量和最大月增重均大于雄性群体;对于雌性和雄性群体的瞬时增长率,除在9~13月龄雌性群体稍低于雄性群体外,13~33月龄的雌性群体均高于雄性群体,且随着生长发育和体质量差异的增大,雌、雄瞬时增长率的差异也呈增大趋势;雄性群体进入快速生长期的始速点和进入缓慢生长期的终速点均比雌性群体提前,雄性群体的快速生长期时间区间长度小于雌性群体,其对应的体质量区间长度也小于雌性群体,雌性群体在快速生长期的月增重显著高于雄性群体。研究表明,大菱鲆雌、雄群体在生长发育过程中存在着显著的生长差异,而形态差异不显著。     

大菱鲆体表粘液细胞组化研究及高温胁迫对其类型和分布的影响

以体重(150±10)g,体长(18±2)cm的大菱鲆为研究对象,利用阿利新蓝-过碘酸希夫氏试剂(AB-PAS,AB染液pH2.5,pH1.0)染色方法,研究高温23和(27±0.5)℃胁迫对大菱鲆体表黏液细胞分布与类型的影响。结果显示,在温度不断升高的外界刺激下,体表皮肤不同部位粘液细胞的分布与数目发生着显著的变化,与对照组[常温(16±0.5)℃]相比,Ⅱ型粘液细胞增幅最大,Ⅳ型次之,Ⅰ型变化不显著,而Ⅲ型增幅呈现出无规律性。研究认为,体表粘液中含丰富的溶菌酶、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)等水解酶类,其酸性环境可以溶解寄生物从而保护机体,但是,随着水温不断增加,病原微生物活力提高,对鱼体构成威胁,而Ⅱ型和Ⅳ型粘液细胞均为使AB呈阳性的酸性粘多糖,随温度的升高其分泌的酸性粘液成分而显著增加,可有效地防止病原菌侵入,为体表粘液的免疫防御功能提供证据。     

二氟沙星在大菱鲆(Scophthalmus maximus)体内的药代动力学特征

为给大菱鲆临床安全用药提供依据,对二氟沙星在健康大菱鲆体内的药代动力学特征进行了研究。在水温为14–17℃条件下,以20 mg/kg体重剂量静脉注射和口服二氟沙星,分别于给药后的15、30 min和1、2、4、6、8、12、16、24、36、48、72、96 h采血及各组织,利用高效液相色谱测定各组织和血浆中的二氟沙星含量,采用DAS 2.0自动药动学软件分析药代动力学参数。结果显示,静注给药后,血浆中二氟沙星的药-时曲线符合零级吸收二室开放模型,消除半衰期(t1/2β)和药时曲线下面积(AUC0-t)分别为30.02 h和440.37 h·μg/ml;口服给药后,血浆中二氟沙星的药-时曲线符合一级吸收二室开放模型,4 h时血药浓度达到最大值(Cmax)6.32μg/ml,t1/2β和AUC0-t分别为94.72 h和246.66 h·μg/ml,生物利用度(F)为56.01%,肾脏和肌肉内的药物浓度较高,而肝脏内相对较低。拟合的最佳口服给药方案为:按鱼体重每次给药11.94 mg/kg,每日1次。     

大菱鲆工厂化养殖试验

2001年4月22日－2002年4月22日的实验结果表明，大菱鲆工厂化养殖应选择水温为7－24℃的水源，最好控制在13－18℃之间，PH值大于7，盐度高于15，水循环量6－8个，在上述条件下，其生长速度为1龄期间1mm/d左右，养殖12个月后体重平均可达700g左右，密度15－20尾／m^2，成活率93．7％，湿性颗粒饵料系数1．83，随着个体长大，雌、雄个体出现明显差异，水温13－18℃时，摄食量变化不明显；9－13℃时，摄食量随水温降低而减少，投饵量视鱼体大小和摄食状况而定。     

大菱鲆AFLP分析体系的建立

本研究构建了大菱鲆扩增片段长度多态性(AFLP)分析体系,对DNA提取、双酶切反应、连接反应、预扩增反应、选择性扩增反应和银染等步骤进行了分析。结果表明,用EcoRI/MseI双酶切、核心序列加3个选择性碱基的选择性扩增引物、1∶6(w∶w)的EcoRI端与MseI端选择性扩增引物比和20μl选择性扩增体积,可得到十分稳定的结果。所得产物经电泳和银染后可获得条带清晰、背景干扰小的图像。该体系的构建为AFLP技术在大菱鲆相关研究中的应用奠定了基础。     

Growth and gonadal development in diploid and triploid turbot (Scophthalmus maximus)

This study determined the effect of triploidy on the survival, growth and gonadal development of turbot from 6 to 48 months of age. From 6 to 24 months of age (first sexual maturity), survival was similar in both ploidies (P > 0.05). From 24 to 48 months of age, after the first sexual maturity, survival was 91.9% in diploids and 100% in triploids, which did not exhibit the post-spawning-associated mortality. Growth was similar for both ploidies during the first year of life. After that, triploids grew significantly (P < 0.05) more that diploids, with more marked differences after each spawning season. From 24 to 48 months, the average weight difference between both ploidies was 11.4 ± 1.9%, ranging from 4.3 to 23.0%. At 47 months of age, the biomass of triploids was 10.3% greater in total weight and 14.3% greater in eviscerated weight. Gonads of triploid males were similar to that of diploids, whereas in triploid females, they were significantly smaller and rudimentary. A histological analysis carried out at 47 months of age showed complete sterility of triploids in both sexes. Sex ratio was 1 male (M):0.6 female (F), for diploids, significantly (P < 0.05) different from 1:1, and 1 M:3.3 F for triploids, significantly (P < 0.05) different from 1:1 and from the diploids. Since females grow more than males, culture of triploids benefited from the high female ratio, which helped to reduce size dispersion. In addition, their sterility allowed better performance by avoiding the reduction in growth that takes place during the spawning periods. Together, these observations indicate that triploidy induction can be an interesting option for turbot aquaculture, especially for the production of large-size fish of more than 2 years of age.     

饲料中添加叔丁基氢醌对大菱鲆生长、血液生化指标、非特异性免疫及肠道组织结构的影响

为研究饲料中添加不同含量叔丁基氢醌(TBHQ)对大菱鲆幼鱼生长、血液生化指标、非特异性免疫及肠道组织结构的影响,在饲料中分别添加0、150、450和750 mg/kg的叔丁基氢醌,配制成4种等氮等脂实验饲料,选择初始体质量(8.31±0.04)g大菱鲆幼鱼,随机分成4组,每组6个重复,每个重复30尾,采用饱饲投喂方式,每天投喂2次,饲养周期为12 W。结果显示,与对照组相比,450和750 mg/kg TBHQ添加组大菱鲆的增重率、特定生长率均显著降低;450 mg/kg TBHQ添加组实验鱼血清碱性磷酸酶活力显著高于150 mg/kg TBHQ添加组;150 mg/kg TBHQ添加组实验鱼血清白蛋白和高密度脂蛋白含量显著低于对照组和450 mg/kg添加组;450 mg/kg TBHQ添加组鱼的血清肌酐含量显著高于对照组;150 mg/kg TBHQ添加组鱼的血清总蛋白含量显著低于对照组;饲料中添加高剂量的TBHQ能够显著升高血清中CAT、溶菌酶活力(450和750 mg/kg)及头肾吞噬细胞呼吸爆发活力(750 mg/kg);饲料中TBHQ添加量为750 mg/kg时,血清SOD活力显著降低;与对照组相比,饲料中添加450和750 mg/kg TBHQ能够显著降低中肠肠道绒毛长度与肠道直径比,而添加750 mg/kg TBHQ时中肠肠道做绒毛长度与肠道直径的比值显著降低。研究表明,饲料中TBHQ的添加量为150 mg/kg时,对大菱鲆幼鱼生长及生理生化指标无显著影响,而饲料中添加450 mg/kg以上的TBHQ则会对大菱鲆幼鱼的生长及生理状况产生一定负面作用。     

Induction of triploidy in the turbot (Scophthalmus maximus): II. Effects of cold shock timing and induction of triploidy in a large volume of eggs

Triploidy was induced in the turbot (Scophthalmus maximus, L.) by applying cold shocks shortly after fertilization. The combined effects of the timing of cold shock commencement after fertilization, cold shock duration and cold shock temperature were investigated. Ploidy was assessed by counting the number of nucleoli per nucleus (NOR) in larvae and also by measuring erythrocyte size in juveniles. A clear peak in triploidy induction was obtained when shocks were started between 6 and 7 min after fertilization at a pre-shock temperature of 13–14°C. With this timing, shocks of 20-min duration at 0°C gave >90% triploidy, with survival about 80% of the untreated controls. In order to ensure both high triploidy rates and high survival, it was necessary to carefully maintain the water temperature just below 0°C. Experiments with small and large volumes of eggs were performed in order to determine how changes in the relative volumes of eggs and chilled water could affect survival and triploidy induction. The best combination to induce triploidy in the turbot was as follows: shock commencement 6.5 min after fertilization, shock duration 25 min, and shock temperature between 0 and −1°C. With this combination, 100% triploidy could consistently be induced with survival 60% of the untreated control. This was successfully applied to a large volume of eggs (300 ml; 1 ml 800 eggs) in order to mass-produce triploid turbot. Triploids had lower survival rate than diploids at hatching but similar thereafter, with the ability to complete the different stages of larval rearing, indicating the viability to produce triploid turbot under farming conditions.