华山松大小蠹2个甲羟戊酸路径基因的克隆与表达

香叶基二磷酸合酶/法尼基焦磷酸（G/FPPS）和异戊二烯焦磷酸异构酶（IDI）是单萜和倍半萜生物合成途径分支点的关键酶。通过克隆华山松大小蠹DaG/FPPS和DaIDI基因的全长序列,预测基因和编码蛋白的性质、结构和功能,并对序列特征和不同发育时期（幼虫、蛹、初羽化期成虫和扩散期成虫）以及不同组织（头、前中肠、后中肠、后肠和剩余躯体）DaG/FPPS和DaIDI表达的研究,旨在揭示DaG/FPPS和DaIDI在华山松大小蠹信息化学物质合成中的分子调控机制。采用RT-PCR和RACE克隆华山松大小蠹DaG/FPPS和DaIDI基因,DNAStar、Blast、ExpasyProtscale、SignalP 4.1、PSORT和TargetP等多种生物信息学方法对基因全长cDNA序列、基本理化性质、系统进化关系、信号肽和蛋白亚细胞定位等进行分析。用Real-time PCR检测DaG/FPPS和DaIDI在华山松大小蠹不同发育时期和不同组织中的表达。结果表明,克隆获得华山松大小蠹香叶基二磷酸合酶/法尼基焦磷酸DaG/FPPS和异戊二烯焦磷酸异构酶DaIDI全长cDNA序列,分别命名为DaG/FPPS和DaIDI,DaG/FPPS编码的氨基酸序列与山松大小蠹DpF/GPPS相似度最高达95%,氨基酸序列含有一个RALS 四肽基序、7 个异戊烯基转移酶保守区（Ⅰ-Ⅶ）和2个典型的DD**D的天冬氨酸富含区;DaIDI编码的氨基酸序列与山松大小蠹IDI相似度最高,达到92%。Expasy Protscale结果表明DaG/FPPS蛋白疏水性氨基酸明显多于亲水性氨基酸,推测其为疏水性蛋白,而DaIDI蛋白亲水性氨基酸数量大于疏水性氨基酸,故推测DaIDI为亲水性蛋白,有较好的水溶性。信号肽预测结果表明,DaG/FPPS和DaIDI均不含信号肽,TargetP结果表明,DaG/FPPS和DaIDI蛋白含线粒体靶向肽,结合PSORT结果推测DaG/FPPS和DaIDI均定位于线粒体。华山松大小蠹DaG/FPPS和DaIDI在不同发育时期和不同组织中均有表达,其中完全羽化期与扩散期成虫保持一致,该阶段表达量最高,不同组织中前中肠表达量最高。     

华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因DaGSTe1的克隆与表达

【目的】克隆华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因的全长序列,并对其序列特征及不同发育时期的表达规律进行研究,以揭示谷胱甘肽S-转移酶在华山松大小蠹克服寄主抗性及物质转运过程中的分子调控机制。【方法】采用RT-PCR和RACE克隆华山松大小蠹谷胱甘肽S-转酶基因全长cDNA序列,用实时荧光定量PCR检测该基因在华山松大小蠹幼虫、蛹和雌雄成虫中的表达情况。【结果】获得cDNA全长为973bp的华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因,并命名为DaGSTe1(GenBank登录号:KJ637332),其编码一个由218个氨基酸组成的多肽,分子质量约为23.567ku,理论等电点为7.90。华山松大小蠹DaGSTe1与山松大小蠹DpGSTe1氨基酸序列的相似度最高,达94%。根据对系统发育树的分析推测,DaGSTe1属于Epsilon类谷胱甘肽S-转移酶。DaGSTe1蛋白三维结构包括一个N端结构域和一个C端结构域,其中N端结构域包括典型的4个β片层和3个α螺旋(β1α1β2α2β3β4α3),C端结构域包括5个α螺旋(α4α5α6α7α8)。DaGSTe1基因在华山松大小蠹不同发育期均有表达,其中在雄性成虫中的表达量最大,为幼虫和蛹的8倍,雌性成虫的4倍。【结论】克隆得到了华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶家族基因DaGSTe1,推测该基因具有降解寄主毒素的作用,而且参与华山松大小蠹雄性特异性激素的转运过程。     

红脂大小蠹、华山松大小蠹和云杉大小蠹形态学比较

对陕西省渭南地区的红脂大小蠹(Dendroctonus valens)、秦巴林区的华山松大小蠹 (D. armandi)和祁连山林区的云杉大小蠹(D. micans)的形态学进行了比较研究,结果表明,3种大小蠹在形态特征、危害症状等方面有显著差异.     

华山松大小蠹的入侵对华山松挥发物成分的影响

采用气质联动技术对秦岭林区华山松健康木、枯萎木针叶、树脂和韧皮部组织内挥发性物质的组成、含量和生物活性进行了分析。结果表明:华山松针叶、树脂和韧皮部组织内的挥发性成分主要由单萜、倍半萜和二萜组成,其中以α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸-龙脑酯、β-石竹烯、α-石竹烯、α-杜松醇、异杜松醇、萜烯醇、杜松二烯为主;华山松针叶、树脂、韧皮部组织内挥发性物质在组成和含量上均有差异,其中以针叶中挥发性物质成分最丰富,其次是韧皮部组织,而树脂的成分则更纯;同时华山松健康木与枯萎木间挥发性物质的种类和含量也具有明显差异。     

华山松大小蠹危害动态的因子分析及预测模型

本文运用数量化理论Ｉ将定性因子定量化后，利用通径分析方法对影响华山松大小蠹虫情指数的１５个因子进行分析，结果表明对虫情指数直接影响作用最大是绝对湿度，间接影响最大的是海拔因子。详细地揭示了各影响因子的作用历程；建立了多元回归分析模型以达到危害程度的预测；用虫情指数能更合理地反映真实的危害规律。     

华山松大小蠹共生真菌新种Leptographium qinlingensis

报道了与危害中国秦岭华山松的华山松大小蠹相关的真菌新种,描述了其有性阶段和无性阶段的形态特征.研究标本保存于西北农林科技大学.     

华山松大小蠹的危害状况分析及预测

对华山松林分标准地的定性因子利用数量化理论定量化后，以１３个变量对６２块标准地进行Ｍａｃｑｕｅｅｎ动态聚类分析，分为五类。对五个类别采用虫情指数、平均虫口和平均个体群大小作为指标，对华山松大小蠹危害状况作了分析；并用Ｂａｙｅｓ准则建立每类的判别函数，回判正确率高达９８．３７％。     

华山松大小蠹和红脂大小蠹过氧化氢同工酶酶谱的比较

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对华山松大小蠹和红脂大小蠹的过氧化氢同工酶进行了分析.研究结果表明,华山松大小蠹和红脂大小蠹成虫的过氧化氢同工酶具有明显的差异,2种大小蠹过氧化氢同工酶种间差异主要表现在酶带带数、迁移率、酶带染色深浅、酶带宽窄等方面.而同种个体之间几乎没有差异.     

华山松大小蠹幼虫分布状态及最佳抽样模型

在陕西省留坝县的华山松(Pinus armandi)林区,对华山松大小蠹(Dendroctonus arman-di)种群密度、分布状态和抽样模型进行了研究.结果表明:华山松大小蠹幼虫密度在华山松树干1～10 m高度范围内各不相等;危害致死华山松成年树的华山松大小蠹种群密度为23.2～52.8头·dm-2,平均37.4头·dm-2;平均值与树干4 m高处样方虫数均值接近;华山松大小蠹幼虫在树干上集中分布于树干7～8 m高处.     

华山松大小蠹对华山松挥发性物质行为反应的研究

以11种华山松挥发物单体和2种不同受害状态的华山松树皮挥发油为材料,利用嗅觉仪测定华山松大小蠹对不同浓度的不同挥发物的行为反应。结果表明:华山松大小蠹雌、雄成虫对(S)-(—)-β-蒎烯表现出趋避反应,而对10种挥发物质单体和不同被害阶段华山松挥发油均表现出趋向反应;在低浓度刺激下,华山松大小蠹雌、雄成虫对α-菲兰烯表现出显著的趋向反应;随着浓度的升高,华山松大小蠹雌性成虫对(S)-(—)-α-蒎烯、(—)-莰烯和α-菲兰烯也表现出明显的趋向反应。而华山松大小蠹雄性成虫则对(R)-(+)-α-蒎烯和3-蒈烯表现出明显的趋向反应;雌虫对α-菲兰烯的趋向反应显著高于(R)-(+)-α-蒎烯、(S)-(—)-α-蒎烯、(—)-莰烯和3-蒈烯,而雄虫对α-菲兰烯和(R)-(+)-α-蒎烯的趋向反应显著大于对(S)-(—)-α-蒎烯、(—)-莰烯和3-蒈烯的反应。同时华山松大小蠹雌虫对(—)-莰烯、健康华山松韧皮部挥发油和被害华山松韧皮部挥发油的行为反应显著大于雄虫。华山松大小蠹对一些华山松挥发物的行为反应具有性别差异性,也对不同种类和浓度挥发物的行为反应存在差异。     

华山松大小蠹空间格局及最佳模型的研究

通过频次比较ｘ＾２检验法，对华山松大小蠹入侵成虫（凝脂数）分别进行Ｐｏｉｓｓｉｎ分布，负二项分布（矩法、零频率法）和Ｎｅｙｍａｎ分布（Ａ型、Ｃ型、Ｎ→∞型）检验，当虫株率小于４８％时，呈负二项分布。将１３种聚集度指标法及新的聚集度指标用于该虫的空间分布研究中，认为均是可行的。并将刀切估计法应用于１３种聚集度指标上；拟合出了７种空间最佳模型；总地来说，聚集度回归模型在研究昆虫空间分布格局中是最佳的方     

华山松大小蠹感受器的类型和分布

【目的】揭示华山松大小蠹感受器的超微结构和分布规律,为进一步探索华山松大小蠹对寄主树木的识别机制和行为调控提供理论依据。【方法】对华山松大小蠹雌雄成虫及幼虫全身的感受器进行扫描电镜和透射电镜观察。【结果】华山松大小蠹成虫头部是感受器分布集中的部位,成虫的前足、鞘翅和膜翅也有化学感受器的分布,主要有毛形感器、刺形感器、锥形感器、栓锥形感器、B?hm氏鬃毛、钟形感器和芽形感器7种类型;幼虫全身分布B?hm氏鬃毛、锥形感器、栓锥形感器。触角毛形感器是单层壁孔感器,孔状结构连接内腔神经;触角刺形感器是3～4层壁无孔感器;锯齿形毛状结构内部无神经等结构。【结论】位于触角的毛形感器是华山松大小蠹识别寄主树木的主要嗅觉感受器类型;刺形感器不是感受气体物质的嗅觉感受器;锯齿形毛状结构是防止虫体受到机械伤害的微毛,不具备感受器功能。     

华山松大小蠹和共生真菌过氧化物酶组织化学定位

通过石蜡和超薄切片对华山松大小蠹消化道和蓝变真菌Leptographium qinlingensis过氧化物酶的组织化学定位。结果表明:华山松大小蠹消化道内没有过氧化物酶,但在华山松韧皮部和木质部营养物质诱导下,幼虫消化道中肠和后肠分泌过氧化物酶。在被蓝变真菌侵染的不同阶段,华山松韧皮部和木质部组织内有强烈的过氧化物酶反应,且随被害阶段的发展过氧化物酶的反应逐渐增强。华山松大小蠹消化道和蓝变真菌分泌的过氧化物酶参与抵御寄主华山松生理生化抗性,蓝变真菌在克服寄主华山松树木抗性中起主要作用。     

华山松大小蠹不同龄期幼虫酯酶同工酶的比较研究

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对华山松大小蠹（Dendroctonus armandi)不同龄期幼虫的酯酶同工酶进行了分析测试。结果表明华山松大小蠹不同龄期幼虫的酯酶同工酶具有个体间的差异，其差异主要表现在酶带带数、迁移率、酶带染色深浅、酶带宽窄等方面。     

华山松大小蠹体内外和坑道内蓝变真菌研究

对华山松大小蠹体内外和坑道内真菌进行了分离,各真菌的室内外人工接种和蓝变试验结果表明,华山松大小蠹体内外和坑道内有11属13种真菌,其中Alternariahumicola、Fusariumoxysporum、Leptographiumqinlingensis、Trichodermavirid、Verticilliumsp.5种真菌能够引起华山松木质部边材组织变色,但只有Leptographiumqinlingensis能够造成华山松木边材组织的蓝变,并且也只有L.qinlingensis能够在健康华山松木质部和韧皮部组织内发育,且与自然状态下被害华山松组织内真菌的危害性和引起的蓝变完全一致。     

华山松大小蠹化学信息物质

在常温下(25℃)解剖华山松大小蠹(Dendroctonus armandi Tsai et Li)的雌、雄虫,以正己烷为溶剂提取华山松大小蠹的后肠和粪便挥发物,并进行GC-MS分析。结果表明:在室温状态下,雌虫后肠挥发物中含有23种物质,主要为萜酸类、萜烯类、雌雄甾类、醇类和醛类等;雄虫后肠中有25种,以有机酸(树脂型萜酸居多)、酯类化合物和萜烯类化合物为其主要成分;粪便中有33种,树脂型的萜酸最多。华山松大小蠹的化学活性物质以萜类化合物为主。     

佛坪国家级自然保护区华山松大小蠹危害程度调查评估

本文分别采用样线法、标准地法调查了佛坪国家级自然保护区内华山松大小蠹(Dendroctonus armandi)对华山松(Pinus armandi)的危害。调查结果表明,在4条样线上,华山松大小蠹感染率分别为4%、3%、3%和2%;标准地调查成灾率为12%;华山松大小蠹危害处于轻度以下。此外,提出了生物防治、预测预报等防治建议,以期为华山松大小蠹虫的防治提供参考。     

华山松大小蠹成虫复眼的外部形态及显微结构

【目的】对华山松大小蠹雌雄成虫复眼的外部形态和内部结构进行研究,为进一步探索华山松大小蠹感光和光选择机制提供理论基础。【方法】应用扫描电镜与透射电镜对华山松大小蠹复眼的形态结构进行观察。【结果】华山松大小蠹复眼呈长椭圆形,位于头部两侧;眼表面光滑平坦,小眼间隙被覆有感觉毛。华山松大小蠹雌、雄成虫复眼的小眼组成数目分别为238~250和187~202;雌性小眼间隙着生有角膜乳突;复眼中心区域小眼呈正六边形,边缘区域的小眼为不规则的四边形或六边形。华山松大小蠹成虫复眼具有典型的无晶锥并列像眼。华山松大小蠹成虫复眼由1个角膜、1个晶锥体、2个初级色素细胞、8个小网膜细胞和其特化的视杆、若干个次级色素细胞和基膜构成。视杆属于半集中型视杆。【结论】华山松大小蠹雌雄成虫复眼具有相同的内部结构,但雌性成虫复眼分辨能力和可见距离稍优于雄性成虫。     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533 bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5′-GenomeWalking和3′-RACE的方法,获得基因的5′-端DNA序列和3′-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5′-端DNA和3′-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1 754 bp,包括1 137 bp的开放读码框和617 bp的3′-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5’-Genome Walking和3’-RACE的方法,获得基因的5’-端DNA序列和3’-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5’-端DNA和3’-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1754bp,包括1137bp的开放读码框和617bp的3’-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列,并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。