根癌农杆菌介导绿色荧光蛋白基因转化印度酸桔的研究

 通过根癌农杆菌介导将绿色荧光蛋白基因转入印度酸桔的胚性愈伤组织中, 经潮霉素筛选,获得抗性愈伤组织, 并再生植株。对这些植株进行GUS 染色、PCR 分析、绿色荧光检测和Sourthern 杂交验证, 结果表明绿色荧光蛋白已经在转基因植株中表达。     

影响洋葱愈伤组织及胚性愈伤组织诱导的因素研究

以洋葱雄性不育系种子(10-8F)为外植体,研究了蔗糖浓度、暗处理及取材时间对洋葱愈伤组织及胚性愈伤组织诱导的影响,以期优化胚性愈伤组织的形成条件,为转基因提供良好受体并为建立高频再生体系奠定基础.结果表明:40 g/L蔗糖及光培养最适合愈伤组织的诱导;50 g/L蔗糖及暗培养最适合胚性愈伤组织的诱导,最适宜的取材时间为45 d.     

橄榄胚性愈伤组织的诱导初探

橄榄 (ＣａｎａｒｉｕｍａｌｂｕｍＲａｅｕｓｃｈ )属于橄榄科橄榄属 ,为福建的特产名果。可鲜食 ,也可加工制成各种风味佳美的蜜饯 ,而且还有药用价值。由于橄榄树体高大 ,童期长 ,且缺乏遗传背景研究资料 ,常规育种遇到很大困难。本文报道诱导橄榄胚性愈伤组织的有效途径 ,以期为利用现代生物技术改良橄榄品种及快速繁殖苗木打下基础。1　材料与方法花后 40～ 5 0ｄ的橄榄幼果采自闽侯村下橄榄园 ,供试品种为福建省的主栽品种惠圆 ,树龄为 2 0年左右。橄榄幼果先用 75 %的酒精浸泡 1ｍｉｎ ,再用 0 1 %的升汞浸泡消毒 1 0ｍｉｎ ,无菌水…     

根癌农杆菌介导马齿苋愈伤组织遗传转化研究

利用马齿苋的叶片诱导出愈伤组织,再以愈伤组织为受体建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系。结果表明:利用该转化体系得到抗性愈伤组织后,对其进行GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定,证实为转化子,表明根癌农杆菌介导外源基因转化马齿苋的愈伤组织是完全可行的,为今后通过基因工程手段进行马齿苋的改良奠定了基础。     

朱顶红幼嫩花梗胚性愈伤组织诱导和高效植株再生

为建立高效的朱顶红植株再生和种苗繁育技术体系,以幼嫩花梗为外植体开展胚性愈伤组织诱导和植株再生研究。对2,4-D和噻苯隆（TDZ）浓度、外植体发育时期及大小进行了筛选,结果表明：将切片厚度为1 mm的幼嫩花梗外植体置于添加0.5 mg ? L-1 TDZ 和2.0 mg ? L-1 2,4-D的MS固体培养基上培养8周,胚性愈伤组织诱导率最高,达85.3%。将胚性愈伤组织转移至相同的培养基上,每月继代1次,平均每月增殖10.6倍。在不含任何生长调节剂的MS培养基上,胚性愈伤组织的植株再生率达98.0%,平均每块愈伤组织可再生出12.3个小植株。经过36次（3年）继代培养后,胚性愈伤组织的增殖和植株再生效率没有显著变化。幼苗移栽至温室驯化,成活率达97.5%。再生植株移栽到田间,没有发现明显的表型变异。对随机选择的再生植株和母株进行简单序列重复区间（ISSR）扩增分析,证实再生植株没有发生DNA水平变异。     

长寿花胚性愈伤组织的诱导及胚状体再生

 研究了长寿花胚性愈伤组织的筛选，胚状体的诱导发生、发育过程及植株再生。经过对外观及细胞学观察，看出外观质地疏松、颗粒状的淡黄色愈伤组织细胞圆形且形状规则，是胚性愈伤组织。诱导胚性愈伤组织的最适培养基为：MS+2，4-D 2 mg·L^-1 +BA 0.2 mg·L^-1；胚状体的诱导培养基为MS+BA 2 mg·L^-1 +NAA 0.2 mg·L^-1 +活性炭4 g·L^-1+蔗糖30 g·L^-1，胚状体诱导率可达185个胚状体；胚状体的再生培养基为MS+蔗糖30 g·L^-1。利用石蜡切片对胚状体的发生过程进行了观察。     

麝香百合胚性愈伤组织状态的调整与植株再生

采用麝香百合假鳞茎诱导出的胚性愈伤组织,从氯化钴、ABA、蔗糖浓度以及光照条件等4个方面对胚性愈伤组织的状态进行调整,并利用活性炭进行了再生实验。结果表明：0.05 μmol·L^-1的氯化钴有利于提高体细胞胚的比例和愈伤组织的颗粒性,0.02 μmol·L^-1和0.01 μmol·L-1的氯化钴有利于愈伤体积增大和增殖系数提高;ABA随着其浓度提高,对胚性愈伤的长势、干湿程度、增殖体积和增殖系数的抑制效果逐渐明显,但对胚性愈伤比例和颗粒性的抑制效果不显著;光培养条件下,90 g·L^-1和60 g·L^-1蔗糖对麝香百合胚性愈伤的比例和颗粒性都有较好的影响,但在暗培养条件下,仅仅60 g·L^-1蔗糖的效果较好;光培养和暗培养对胚性愈伤的干湿程度和颗粒性都没有显著的影响;1 g·L-1的活性炭和基本培养基对愈伤的再生具有显著性的影响。综合结果,麝香百合胚性愈伤的最佳增殖方式和再生方式分别为：为采用光培养,培养基为MS + NAA 5.4 μmol·L^-1 + TDZ 0.4 μmol·L^-1 + CoC1₂ 0.05 μmol·L^-1 + 蔗糖60 g·L^-1和MS+活性炭(1g/L) +蔗糖30 g·L^-1 。     

本地早胚性愈伤组织耐盐性研究

柑桔是对盐分极度敏感的植物,盐分可导致柑桔焦叶、枯枝,生长抑制和品质变劣等,砧木对盐分也十分敏感,土壤中可溶性盐分的存在与增加,往往成为柑桔栽培的限制因子,因此,研究柑桔的耐盐性及选择耐盐品种类型,对柑桔栽培具有十分重要的意义。     

白姜花胚性愈伤组织的诱导与植株再生体系的建立

将白姜花（Hedychium coronarium）未成熟花丝接种在MS + 4 mg ? L^-1 2,4-D + 4 mg ? L^-1 NAA + 1 mg ? L^-1 6-BA的培养基上,经过180 d的培养,诱导出3种愈伤组织：Ⅰ,浅黄色松散易碎;Ⅱ,白色疏松半透明水渍状;Ⅲ,黄色致密颗粒状。对愈伤组织继代培养基中的2,4-D、NAA和6-BA浓度进行优化,结果表明培养基中含有1 mg ? L^-1 2,4-D、0.25 mg ? L^-1 NAA、0.25 mg ? L^-1 6-BA时可获得胚性状态良好的愈伤组织。胚性愈伤组织在MS无机盐 + 0.25 mg ? L^-1 NAA + 0.5 mg ? L^-1 TDZ + 维生素B₅ + 100 mg ? L^-1谷氨酰胺 + 230 mg ? L^-1脯氨酸 + 100 mg ? L^-1麦芽提取物 + 45 g ? L^-1蔗糖的体胚诱导培养基中培养20 d后,转移到MS基本培养基上培养30 d,1 g胚性愈伤组织可获得50 ~ 60个体胚。成熟体胚在MS + 0.2 mg ? L^-1 IAA + 0. 5 mg ? L^-1 6-BA的萌发培养基上培养20 d时,体胚萌发率为85%。萌发的体胚转移到1/2 MS + 1 g ? L^-1活性炭的成苗培养基中可发育成正常植株,植株室外栽培成活率达90%。对100株再生植株的染色体数进行分析,发现3株三倍体（2n = 3x = 51）、6株四倍体（2n = 4x = 68）和2株六倍体（2n = 6x = 102）。     

基于绿色荧光蛋白观察的花粉介导转化泡桐初探

以泡桐花粉为受体,在超声波的作用下将含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒与花粉共处理,利用荧光显微镜对GFP基因在花粉粒及花粉管中的表达进行了示踪观察。结果表明:100g/L的蔗糖溶液是泡桐花粉较适宜的体外培养液;花粉粒有较强烈的自发荧光,因此不能根据花粉粒荧光来确定GFP基因是否表达;处理组花粉管较对照呈现强烈的绿色荧光,表明GFP基因在花粉管中表达。该试验首次利用泡桐花粉对GFP基因的表达观察,初步证明了这一转基因方法对泡桐花粉转化的可行性。     

利用未成熟种子建立野生阿宽蕉胚性细胞悬浮系和植株再生的研究

以纵切的野生阿宽蕉60d龄未成熟种子为外植体,在MI1愈伤组织诱导培养基(MS大量和微量元素及铁盐+MorelandWetmore维生素+0.1mmol/LKH2PO4+87mmol/L蔗糖+4.5μmol/L2,4-D+1g/LGelrite)中培养60d后开始出现浅黄色松散的胚性愈伤组织,150d后愈伤组织诱导率为(15.11±1.95)%。该类愈伤组织被转移到含18μmol/L2,4-D的MI2培养基中继代60d后,可获得状态均一的理想的胚性愈伤组织。胚性愈伤组织悬浮培养后,通过2个月的筛选和继代培养,可得到均质的胚性细胞悬浮系。理想的胚性愈伤组织在体细胞胚诱导培养基中培养10d后可见到白色半透明体细胞胚的发生,体细胞胚诱导率为7.70×105个/gFW。成熟体细胞胚的萌发率为(33.33±3.37)%,植株再生率为(20.83±1.68)%。     

砂糖橘上碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对广东砂糖橘碎叶病毒的外壳蛋白(CTLV-CP)基因进行了克隆和测序分析。DNA序列分析表明,砂糖橘CTLV-CP基因的cDNA序列全长为786bp,编码262个氨基酸。BLAST分析结果显示,所得序列与苹果、梨茎沟病毒(ASGV)外壳蛋白基因及其它柑橘CTLV-CP基因的同源性在87%～91%,证明所克隆的片段为CTLV-CP基因。     

8种柑橘类植物对柑橘碎叶病毒分子组成的影响

探究不同柑橘类型对柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)变异的影响,为研究寄主-CTLV的互作关系提供基础。将CTLV分离株HH和XLB分别嫁接接种于8种柑橘类植物,对CTLV分离株和获得的亚分离株样品进行CP基因的限制性长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)分析,以及序列比较。结果表明HH和XLB与其各自在不同柑橘植株上的亚分离株的CP/Hinf I RFLP酶切图谱无明显差异;混合侵染的CTLV分离株HH和其亚分离株之间的SSCP谱型存在差异,株系构成单一的CTLV分离株XLB与其亚分离株间的SSCP谱型差异不明显。通过序列分析进一步证实CTLV在不同寄主上其CP基因有几个核苷酸位点发生了变异。CTLV可能受寄主植物的影响发生了变异。     

Biological characteristics of mesenchymal stem cells from different resources in green fluorescent protein transgenic mice

AIM：To compare the biological characteristics, surface markers and multi-differentiation potential of the mesenchymal stem cells (MSCs) derived from the umbilical cord and bone marrow in the green fluorescent protein (GFP) transgenic mice. METHODS：Umbilical cord MSCs (UCMSCs) were isolated by collagen type II enzymatic digestion and bone marrow MSCs (BMSCs) were isolated by density gradient centrifugation. The growth of the 2 types of MSCs was observed under inverted microscope. The cell proliferation was detected by determining the growth curve and MTT assay. The Trypan blue method was performed to analyze the cell viability rate. The cell cycle and cell surface markers were measured by flow cytometry. The differentiation potentials of the 2 types of MSCs were tested by the differentiation kits toward adipocytes and osteoblasts. RESULTS：The UCMSCs attached to the culture surface 1 d after the isolation, and the cells showed spiral shape with notable growth and proliferation after 2 d of culture. After 3 d, the cell arrived sub-confluent and was ready for passage. BMSCs still showed circular shape and started to attach to the surface 4 d after culture. They formed the small colony shape only after 5 d with obvious proliferative potential. The cells became confluent 7 d after the culture. The original generation of cultivating UCMSCs growth curve was shown typically an “S” shape. But the BMSCs growth was slower than the UCMSCs. The cell proliferation was obvious for UC-MSCs in 3~5 d. BMSCs proliferated significantly only after 7 d. The viability rate arrived more than 96% for both types of MSCs. The cell cycle of both MSCs did not show significant difference (G0/G1 phases were above 85%, P>0.05). Both MSCs positively expressed CD44, CD90 and CD105 (60.7%±2.3%) but the expression of CD45, CD19, CD14 and CD79 was negative (less than 25.6%±4.8%, P>0.05). More than 90% of the MSCs from the umbilical cord and bone marrow differentiated towards the adipocytes and osteoblasts without significant difference (P<0.05). CONCLUSION：UCMSCs have stronger ability of proliferation and multi-directional differentiation potentials. UCMSCs in GFP transgenic mice as a high-quality tracer can serve for tracking the stem cells in vivo.     

Optimization of Agrobacterium-mediated transformation parameters for Melastomataceae spp. using green fluorescent protein (GFP) as a reporter

Agrobacterium-mediated transformation for both Melastoma malabathricum and Tibouchina semidecandra were optimized using green fluorescent protein (GFP) as a reporter. The binary vector pCAMBIA1304 harboring the modified green fluorescent protein (mgfp) gene driven by the CaMV 35S promoter was used. Parameters optimized were bacterial strain, bacterial concentration, pre-culture period, co-cultivation period, immersion time, acetosyringone concentration and wounding type. Results obtained were based on the percentage of GFP expression which was observed 3 days post-transformation. Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 and EHA105 at concentration 1 × 10⁷ cfu ml⁻¹ (OD_600nm 0.8) showed the highest virulence on M. malabathricum and T. semidecandra, respectively. Four days of pre-culture and 2 days of co-cultivation were optimum for M. malabathricum transformation, while 3 days of pre-culture and co-cultivation for T. semidecandra. Result also showed that 60 min of immersion and addition of 200 μM acetosyringone gave the highest percentage of positive transformants for both M. malabathricum and T. semidecandra. Mild wounding also significantly increased the efficiency of M. malabathricum transformation.     

在继代培养中贡蕉胚性悬浮细胞的分化能力和染色体数目的变化

将贡蕉[Musa acuminata cv.Mas(AA)]胚性悬浮细胞通过不同时间的培养后,对其体胚发生能力和染色体数目进行了分析。结果表明,随着培养时间的延长,贡蕉胚性悬浮细胞的体胚发生能力下降,继代培养1.5a的悬浮细胞体胚发生能力为1.76×104个/mLPCV(packed cell volume,细胞密实体积)胚性悬浮细胞,继代培养3a后下降到0.85×104个/mL PCV胚性悬浮细胞。整个胚性细胞悬浮系为混倍体,细胞的染色体数目变化从3个到70个不等,既有含染色体数目为整倍体的细胞,也含有大量染色体数目为非整倍体的细胞;继代培养1.5a时,含正常二倍体染色体数目的细胞比例为15.8%,继代培养3.0a时下降到9.7%。     

金属硫蛋白基因转化黄瓜的研究

以黄瓜无菌苗子叶切段为外植体,通过叶盘转化法与根瘤农杆菌进行共培养建立了黄瓜的遗传转化体系.比较了不同苗龄,不同侵染时间对黄瓜离体再生的影响,并做了潮霉素敏感性测试.结果表明:苗龄3～4 d的子叶,侵染时间为15min,潮霉素浓度为25 mg/L最适分化出抗性小苗.最终获得3株抗性植株,经过PCR和PT-PCR检测,初步确定均为阳性转化植株.     

韧皮部特异启动子驱动密码子优化的抗菌肽D基因的植物表达载体构建

根据177个GenBank中登录的柑橘编码蛋白密码子用法的分析结果,优化并重新设计和合成了含柑橘偏爱密码子、对柑橘黄龙病有杀灭作用的柞蚕抗菌肽D基因(命名为CAPD),克隆入pUC19克隆载体并经测序验证后,获得了含新抗病基因的重组质粒pUC19-CAPD。用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切pUC19-CAPD克隆载体和pBI121植物表达载体的质粒DNA,回收pUC19-CAPD克隆载体中的CAPD基因小片段和pBI121植物表达载体中去掉GUS报告基因的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由CaMV35S组成型启动子(35SP)驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ05);用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切含笋瓜韧皮部特异启动子(PSP)的pUCm-PSP克隆载体和pHZ05植物表达载体的质粒DNA,分别回收pUCm-PSP克隆载体中的PSP小片段和pHZ05植物表达载体中去掉CAPD目的基因上游35SP的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ06)。利用细胞感受态法直接将2个由不同启动子驱动的含CAPD目的基因的新重组植物表达载体分别导入根癌农杆菌LBA4404、GV3101、EHA105和发根农杆菌Ri15834等4个农杆菌菌株中,为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育抵抗由韧皮部传导的毁灭性和检疫性病害柑橘黄龙病的新种质奠定了基础。     

核果类果树根癌病菌寄主范围及抗性研究初报

2000年11月从山东泰安、临朐、诸城等地采集冠瘿瘤标本,经分离纯化及在指示植物向日葵上的致病性测定,共分离到致病性病原菌8株.经对26种供试植株的接菌试验,发现有20种植株得病.基于同一砧木或品种类型对不同菌株的抗性程度往往幅度很大,应采用多种菌株进行侵染试验.对8种樱桃砧木的抗性研究发现,不同砧木对不同致病菌的抗性不同.