牛分枝杆菌PE_PGRS62基因克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

为构建表达牛分枝杆菌(M.bovis)PE_PGRS62蛋白的重组耻垢分枝杆菌,本研究以M.bovis基因组DNA为模板PCR扩增PE_PGRS62基因,获得大小约为1 515 bp的目的片段,并克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261中,将重组pMV-PE_PGRS62穿梭表达载体电转化到耻垢分枝杆菌内,42℃热诱导重组耻垢分枝杆菌,通过SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并鉴定其生物学活性。经SDS-PAGE分析,表达的PE_PGRS62蛋白分子量约为60 ku,免疫印迹结果表明,表达的PE_PGRS62蛋白与兔抗M.bovis阳性血清反应形成一条特异性蛋白条带。本实验为进一步研究M.bovis致病机理奠定了基础。     

新疆牛分枝杆菌MIRU-VNTR基因分型的初步研究

为了解牛分枝杆菌的基因型特点,初步建立适合新疆地区的MIRU-VNTR基因分型方法,本研究利用24个MIRU-VNTR位点,对30株牛分枝杆菌新疆分离株进行基因分型研究。结果显示,在24个MIRU-VNTR位点中,有9个位点(ETR-A、B、D、E;MIRU24;QUB11a、11b、1895、26)具有多态性,可将30株菌分为7个基因型,分型指数为0.611。而国际通用的5个ETRs位点(ETR-A～E)可将该30株菌分为4个基因型,分型指数为0.712。多态性位点中多态性指数较高的5个位点(ETR-B、ETR-D、MIRU24、QUB11a、QUB26)具有与9个位点相似的分型能力,分型指数为0.715。研究表明,新疆地区与其他地区或国家的牛分枝杆菌在基因分型方面存在差异。5个多态性较高的位点均具有良好的分型能力,表明MIRU-VNTR基因分型方法可以作为新疆地区牛分枝杆菌分子流行病学研究的辅助方法。     

表达牛分枝杆菌MPB83基因重组腺病毒的构建

以牛分枝杆茵Vallee III株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得MPB83基因,克隆后.亚克隆至腺病毒穿梭栽体pShuttle-CMV中,构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-MPB83经Pme I酶切,转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-I的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-MPB83.Pac I酶切线性化该质粒,转染AD-293细胞进行病毒包装,转染细胞10 d后出现细胞病变(CPE).PCR、RT-PCR、western blot检测到重组病毒含MPB83基因并成功表达.     

结核变态反应阳性牛的非典型性分枝杆菌的分离与鉴定

本试验从６９头结核变态反应阳性牛中采取病料２０２份进行分枝杆菌，特别是非典型分枝杆菌的分离与鉴定，共获２６株分枝杆菌，除５株分枝杆菌外，其它全是非典型分枝杆菌。在这些非典型分杆杆菌中，５株偶发分枝杆菌，６株瘰疠分枝杆菌，５株鸟－胞内分枝杆菌，２株副结核分枝杆菌和１株ＲｕｎｙｏｎⅡ群。从病料看，有病变的分离率为４１．２％，无病变的为７．１％。在三种淋巴结病料中，以肠系膜淋巴结的分离率为最高，颌下淋巴     

牛分枝杆菌融合基因hsp65-esat6的原核表达及产物的纯化

以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板扩增hsp65和esat6基因。采用重叠延伸剪接技术（SOE）获得了融合基因hsp65-esat6，将hsp65-esat6连接到原核表达载体pET32a（＋）上，构建重组质粒pET65-E6，将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，以IPTG诱导（终浓度为1mmol／L），表达产物进行SDS—PAGE分析。以Ni^2＋亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western—blot分析该融合蛋白的免疫活性。结果表明：Hsp65-ESAT6融合蛋白以包涵体形式表达。表达的融合蛋白裂解为两部分，即58ku和30ku，二者相加与预测大小88ku相符。纯化的融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。     

牛分枝杆菌融合基因ESAT6-MPB63-HSP65的原核表达及鉴定

以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板,PCR扩增ESAT6、MPB63和HSP65基因,将其依次定向克隆入原核表达载体pET-32a (+),构建重组质粒pET-E6-M63-H65,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞,1 mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,以Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting 分析。结果表明,rESAT6-MPB63-HSP65融合蛋白为可溶性表达,且大小与理论值相符,纯化的融合蛋白能够与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应,为进一步的诊断学研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌与牛分枝杆菌全基因组比较分析

本研究旨在揭示结核分枝杆菌与牛分枝杆菌全基因组的遗传差异,为结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的鉴别诊断提供新的分子标志。利用结核分枝杆菌H37Rv和牛分枝杆菌AF2122/97的全基因组测序结果,通过在线比对,完成了两者的全基因组比对分析。结果显示AF2122/97相对H37Rv存在14处大片段缺失,大小范围为0.8～12.7kb,其中RD18、RD19及RD20等3处缺失为首次报道。此外,AF2122/97还存在6处基因内部小片段的缺失,大小范围为12～714bp,其中Mb1319及Mb3293c基因内部缺失为首次报道。H37Rv相对AF2122/97存在6处大片段缺失,大小范围为1.3～5.4kb。此外,H37Rv还存在5处基因内部小片段的缺失,大小范围为10～48bp,这些基因的内部缺失都为首次报道。通过结核分枝杆菌H37Rv和牛分枝杆菌AF2122/97的全基因组序列比对,揭示了这2种菌株间的遗传差异,阐述影响表型特征、寄主偏好性及毒力差异的关键性遗传基础。这些新的认识将有助于开发新的药物、诊断试剂和疫苗。     

牛分枝杆菌Mb1761C蛋白的表达及其免疫原性初步研究

根据GenBank提供的M.bovis Mb1761c基因序列设计引物。以牛分枝杆菌DNA为模板,通过PCR方法扩增出牛分枝杆菌MB1761c基因片段,以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切PCR产物和pET28a（＋）后将纯化的Mb1761c基因克隆至pET28a（＋）中,构建出原核表达质粒,再转化到E．coli BL21（DE3）表达菌株中,IPTG诱导后,收集菌体进行SDS-PAGE,分析可见约29ku特异性蛋白条带,Western blot分析发现,该融合蛋白具有较强的免疫原性,从而为进一步研究其亚单位疫苗及DNA疫苗奠定了基础。     

牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat6融合基因的分子克隆及表达

以牛分枝杆菌valleeⅢ株基因组DNA为模板,PCR扩增mpb64、ag85b和esat6 3个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术（SOE）和基因重组技术获得融合基因mpb64-ag85b,将mpb64-ag85b和esat6串联到同一原核表达载体pET32a（＋）中获得重组质粒pET64-85b-e6。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,以IPTG（终浓度1 mmol/L）进行诱导,SDS-PAGE电泳分析表达情况,以Ni^2＋亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western blot分析融合蛋白的免疫活性。结果表明：表达的融合蛋白大约为76 Ku,与预测大小相符,以Ni^2＋亲和层析柱纯化的融合蛋白能与牛结核病阳性血清发生反应。     

牛分枝杆菌Ag85A基因在大肠埃希氏菌中的表达

以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切已构建的pGEM-T-85A和pET28a（＋），并将纯化的Ag85A基因亚克隆至pET28a（＋）中，构建出原核表达质粒pET28a-85A。将pET28a-85A转化至感受态E．coli BL21（DE3）中，经IPTG诱导和SDS-PAGE分析，可见约32ku的外源蛋白带。Western-blotting分析表明，该蛋白具有牛分枝杆菌的抗原性。     

牛分枝杆菌MPB70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

本研究以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB70成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约500bp的DNA片段.通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆载体pGEM-T-70.以BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pGEM-T-70和pET28a( ),并将纯化的MPB70基因亚克隆至pET28a( )中,构建出原核表达载体pET28a-70.将pET28a-70转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约25Ku外源蛋白带.Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB70的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础.     

吉林省鹿源牛分枝杆菌MIRU分型研究

为了解鹿源牛分枝杆菌(M.bovis)基因多态性,初步建立适合吉林省鹿源M.bovis的基因分型方法,本研究利用12个分枝杆菌散在重复单位(MIRU)位点,对96株鹿源M.bovis吉林分离株进行MIRU基因分型研究.结果显示,12个位点中有8个位点(MIRU2、4、16、23、27、31、39及40)具有多态性,可以将96株菌株分为1 1个基因型,分辨力指数(H)为0.893,其中6个中度多态性位点的分辨力为0.877.其余4个位点(MIRU 10、20、24及26)未显示多态性.研究结果表明,鹿源M.bovis与其他宿主来源的M.bovis在基因分型上存在差异.MIRU位点对鹿源M.bovis具有良好的分辨力,该分型方法可以作为鹿结核病分子流行病学研究的有效方法.     

牛分枝杆菌mpb64和Ag85B融合基因在大肠埃希氏菌中的原核表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得mpb64和Ag85B两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术（SOE）剪接mpb64和Ag85B,得到融合基因mpb64-Ag85B;将融合基因片段先克隆于pMD 18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a（＋）中,得到重组质粒pET64-85.该重组质粒经核苷酸序列测定,显示其中的外源片段与期望的序列一致;其BL21（DE3）转化菌经IPTG诱导表达带有6个组氨酸标签的融合蛋白;用Ni2＋螯合层析方法纯化融合蛋白,Western-blotting分析结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应.     

牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其生物学活性鉴定

试验旨在构建牛分枝杆菌eis基因的穿梭表达载体,鉴定其在重组耻垢分枝杆菌中的生物学活性。采用PCR技术扩增并克隆牛分枝杆菌eis基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261-Mbeis,经双酶切和测序鉴定其正确性,利用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc²155中,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达,质谱鉴定目的蛋白氨基酸序列。研究结果表明,成功构建了牛分枝杆菌eis基因穿梭表达载体pMV261-Mbeis;生长曲线表明负载重组质粒不会影响耻垢分枝杆菌的体外生长;SDS-PAGE和Western blotting检测证实了牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中可表达出分子质量约44 ku的eis蛋白;质谱检测证明了该蛋白即为牛分枝杆菌eis蛋白。本研究构建的牛分枝杆菌eis基因穿梭表达质粒pMV261-Mbeis在耻垢分枝杆菌中具有生物学活性,为下一步研究表达产物eis蛋白的功能奠定了基础。     

牛结核分枝杆菌基因文库的构建

以国际标准牛型结核分枝杆菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＴＭＣ４１０为材料,制备其总ＤＮＡ,经过限制性内切酶Ｓａｕ３Ａ部分消化后,纯化回收９～２５Ｋｂ片段,并将其用Ｔ４ＤＮＡ连接酶与经ＢａｍＨＩ酶切为粘性末端的ＬａｍｂｄａＥＭＢＬ３左右臂连接。用噬菌体包装蛋白包装,再进行连续稀释,然后将不同稀释度的噬菌体转移到宿主菌ＬＥ３９２。所获重组子为６×１０４,因为牛结核杆菌基因组大小约为４×１０６Ｋｂ则以９９％概率筛到任一基因,要求的重组子数为１．０８×１０３,故该基因文库已达到要求