禾本科植物内生真菌研究10——内生真菌共生体的苗期生物学特性

有些禾本科植物内生真菌能为宿主植物带来抗病虫害、抗旱、促进苗期生长和分蘖等性能。研究利用种子中Neotyphodium属内生真菌含菌率不同的苇状羊茅Festuca arundinacea、多年生黑麦草Lolium perenne和野生鹅观草Roegneria kamoji进行了室内发芽试验、室外和人工气候箱内的盆栽试验以及室内外蚜虫接种试验,调查了内生真菌对其宿主苗期生物学特性的影响。发现种子含菌率比较高的苇状羊茅和多年生黑麦草分蘖多,幼苗抗虫性明显提高;种子含菌率比较高的鹅观草发芽率高,出苗整齐,生长快,分蘖多,但幼苗无明显的抗虫性。研究结果进一步说明了禾本科植物内生真菌在农业上具有广阔的利用前景。     

中国西北地区披碱草属植物所带内生真菌的培养特征

内生真菌与植物所形成的共生体普遍存在于冷季禾草中,共生体有利于提高宿主植物的生物和非生物抗性。虽然目前研究者们已对禾草内生真菌做了大量的研究,但是尚未发现对分布于中国西北地区披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌培养特征的研究。本研究从中国西北地区分离出15株来自不同地理种群披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌。通过分离培养,测定了这15株无性世代Neotyphodium内生真菌的菌落生长速度,结果显示,这15株无性世代Neotyphodium内生真菌菌落的平均生长速度为(0.41~0.85) mm/d,且生长速度与海拔具有相关性。分布在海拔低于3000 m的无性世代Neotyphodium内生真菌的菌落生长速度比生长于海拔高于3000 m菌落的生长速度快。观察菌落发现,分布在海拔高于3000 m的菌落正面特征较为一致,而分布在海拔低于3000 m的菌落正面特征出现不同。另外,通过多基因联合建树发现,分布在海拔高于3000 m的无性世代Neotyphodium内生真菌聚在一个分支,而分布在海拔低于3000 m的无性世代Neotyphodium内生真菌呈现星状分布。由于目前尚未对中国西北地区披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌命名。因此,希望本研究结果能为该菌的命名提供理论依据。     

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调查了中国西北和东部地区不同生境的拂子茅属Calamagrostis植物中Neotyphodium属内生真菌的分布。采样范围包括新疆、青海、甘肃、江苏、安徽、浙江、上海7省（市、区）,共采集拂子茅属植物样品426株。调查发现西北3省（区）所有276个拂子茅属植物样品中都不含有内生真菌;而采集自东部的样品中,南京的无性系拂子茅属植物和黄山的拂子茅C. epigeios含菌率为100%。但是,采自南京抽穗的拂子茅却完全不含内生菌。通过研究分离菌株的形态学特征,发现南京与黄山的菌株都具有Neotyphodium属内生真菌的典型特征,而它们之间在菌落形态、生长速度、孢子大小等方面又存在较明显差异。以上结果说明我国拂子茅属植物及其中的禾本科植物内生真菌具有一定的生物多样性,拂子茅属植物中的内生真菌含量受地理环境以及宿主植物种类的影响十分明显。     

醉马草致草食家畜中毒研究进展

醉马草[Achnatherum inebrians (Hance) Keng]是我国北方地区常见的多年生禾本科植物,感染Neotyphodium属内生真菌后成为醉马草内生真菌共生体,共生体植株能产生麦角类生物碱,草食家畜过量采食引起中毒。中毒牲畜出现共济失调、神情呆滞或烦躁不安等神经症状,中毒严重者可致死。由于醉马草内生真菌共生体具有较强的抗阻逆特性,因此针对其抗性机理的研究已成为国际上禾草-内生真菌共生体研究领域的重要内容。文章主要概述了醉马草危害及防控、产毒机制和开发应用研究进展。     

黑麦草内生真菌对植物病原真菌生长的影响

摘要：为确定黑麦草内生真菌及其发酵产物对病原真菌生长的影响,从不同品种的多年生黑麦草(Lolium perenne)(爱神特、美达丽、顶峰和球道)中分离出N A1、N M2、N P2和N F1共4株Neotyphodium属的内生真菌菌株,分别采用平板对峙培养、菌落生长及孢子萌发等方法对细交链孢(Alternaria alternata)、小麦根腐离蠕孢(Bipolaris sorokiniana)、新月弯孢霉(Curvularia lunata)和德氏霉(Drechslera sp.)等病原真菌进行室内生物测定。结果表明,在平板对峙培养中,不同内生真菌对同一种病原菌的抑制作用不同,不同病原菌对同一内生真菌的敏感程度表现出差异,4株内生真菌对各病原菌的抑制率范围依次为42.51%~46.25%、31.45%~43.97%、34.51%~46.55%和40.19%~46.62%。在对病原菌的生物测定中,4株内生真菌的发酵产物均可抑制病原菌的生长,N F1菌株的抑菌效果显著高于其他3株内生真菌(P＜0.05),对小麦根腐离蠕孢的菌落生长和孢子萌发表现出较强的抑制作用,抑制率分别达到57.20%和86.60%。     

桑椹果腐病的病原菌鉴定

为探究桑椹果腐病的发病原因,采用常规组织分离法,从桑椹果腐病病果中分离得到一株真菌菌株,在PDA培养基上菌落呈圆形,可产生白色气生菌丝和紫色色素。根据显微观察结果,大型分生孢子较少,呈纺锤型或镰刀型,稍弯曲,向两端逐渐变尖,具有2～5个隔膜,大小(154～407)μm×(14～31)μm;小型分生孢子较多,一端尖细、一端钝圆,大小(33～95)μm×(20～38)μm,无隔膜或有1个隔膜。通过菌落形态和分生孢子形态观察,初步认为其为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)。利用真菌EF-1α基因和rDNA ITS通用引物进行PCR扩增,对扩增产物进行测序分析,进一步确认桑椹果腐病的病原菌是层出镰刀菌。根据柯赫氏法则鉴定病原菌,发现层出镰刀菌对桑椹具有较强的感染能力。     

应用RAPD分子标记探讨拟鹅观草属的种间关系

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,分析了拟鹅观草属(Pseudoroegneria)8种1亚种和鹅观草属(Roegneria)7种植物.35个引物产生的344条DNA扩增片段中,328条(95.35%)具有多态性,利用344个RAPD标记,在NTSYS软件中,计算Jaccard遗传相似系数,建立UPGMA聚类图.结果表明:1)物种间遗传差异明显,具有丰富的遗传多样性;2)R. elytrigioides、 R. alashanica和R. magnicaespes与拟鹅观草属的物种聚类在一起,表明它们与拟鹅观草属的亲缘关系较近,而与鹅观草属的亲缘关系较远;3)RAPD分子标记可以将拟鹅观草属的物种分开,而且形态相似,地理分布相同或相近的物种聚类在一起;4)RAPD结果与形态学和细胞学的分析结果一致,表明RAPD技术能为拟鹅观草属植物的系统学研究提供DNA水平上丰富的资料.     

鸭茅香柱菌形态学、生理学及系统发育研究

本文对新疆鸭茅进行采样调查,发现在鸭茅的分蘖上长有真菌子座,子座圆柱状,成熟期为黄色,表面粗糙,子座长45~55 mm;在PDA培养基上25℃培养2周后,菌落直径45~54 mm,菌落正面白色,棉质,质地紧密,中央隆起或稍有皱褶,背面白色至黄色;菌丝体细长,分枝,分隔,不易产生分生孢子。在受到胁迫时产生孢子,孢子梗长13~33 μm,基部宽2.7~4.1 μm,顶端变尖小于1 μm;分生孢子无色透明,椭圆形或肾形,单个顶生,(4.1±0.5) μm×(2.2±0.5) μm;为典型的Epichloё属真菌。利用碳源能力由强到弱依次为:蔗糖>果糖>葡萄糖>淀粉。利用硝酸铵的能力最强,之后依次为蛋白胨和硝酸钾,具有分解酪蛋白淀粉能力。选择菌株Ed0907,利用rDNA-ITS序列分析构建了系统发育树,结果表明分离菌株(Ed0907)与Epichloё typhina聚为一枝,相似率为100%。根据以上结果,确定分离菌株为Epichloё真菌。     

桑卷叶枯病病原菌的形态特征与分离培养条件

桑卷叶枯病是桑树的主要真菌病害之一。采用常规的微生物学试验方法观察病原菌桑单胞枝霉菌(Hormodendrummori Yendo)的形态并研究病原菌的分离培养条件。结果表明,病原菌在PDA培养基上生长良好,形成白色圆形凸状菌落,并能产生大量的暗蓝褐色分生孢子梗和淡灰色分生孢子;菌丝的生长温度为8～40℃,产生分生孢子的温度为10～38℃,分生孢子的致死温度为50～55℃,菌丝生长和分生孢子产生的最适温度为25～30℃;适合菌丝生长的pH为4.5～11.0,最适pH为6～7;相对湿度大有利于菌丝生长和分生孢子的产生与萌发;连续光照可促进产孢。以上结果信息可供研究桑卷叶枯病病原菌的危害特点和建立病害的有效防治方法参考。     

青海高原禾草内生真菌资源的调查和分离

青海高原的高寒特性决定其生境内禾草植物的多样性和特异性,然而有关青海高原地区禾草内生真菌的研究报道较少,本研究对青海高原地区48个样点内禾草植物内生真菌带菌率和内生真菌分离进行了研究.结果表明,14种禾本科植物内生真菌平均感染率低于50％,而12种植物内生真菌平均感染率大于50％.其中,缘毛鹅观草(Roegneria pendulina)、紫花针茅(Stipa purpurea)、醉马草(Achnatherum inebrians)、中华羊茅(Festuca sinensis)、硬质早熟禾(Poa sphondylodes)、微药羊茅(F.nitidula)、毛稃羊茅(F.kiritowii)和紫羊茅(F.rubra) 的平均带菌率均超过80％.同时,同属禾草植物内生真菌带菌率存在差异.禾草内生真菌分离率较低,其中紫花针茅、麦宾草(El ymus tangutorum)、光稃早熟禾(P.psiolepis)和异针茅(S.aliena)内生真菌在菌落和分生孢子形态上存在差异.可见,青海高原禾草内生真菌带菌率较高,同时不同禾草内生真菌可能存在多样性.     

高寒草甸优势禾草-异针茅内生真菌的分离与鉴定

异针茅作为青藏高原地区重要的乡土草种之一,是高寒草甸草原主要的建群禾草种类。迄今为止,有关异针茅所感染内生真菌的种类和分类地位的研究尚未见报道。基于此,以青海高原地区两个地理种群的异针茅为研究对象,采用常规分离培养形态观测和管家基因扩增目的片段基因并与已公布的内生真菌序列构建系统发育树的方法,确定异针茅感染内生真菌的种类和分类地位。结果表明:异针茅分离出的内生真菌菌落形态、生长速度和分生孢子形态等均与Epichloё属内生真菌的形态特征相似。编码蛋白tub和肌动蛋白actin序列构建的系统发育树表明,异针茅感染的内生真菌种类分别为Epichloёgansuensis和Epichloёsylvatica,而转录延长因子tef序列构建的系统发育树发现异针茅感染的内生真菌种类分别为Epichloёinebrians和E.sylvatica。由此可见,异针茅感染的内生真菌分别为甘肃内生真菌E.gansuensis、醉马草内生真菌E.inebrians和欧洲短柄草内生真菌E.sylvatica;进一步揭示异针茅感染的内生真菌表现出多样性,异针茅与其感染的内生真菌间未形成严格的宿主特异性。     

低温处理下外源水杨酸和脱落酸与内生真菌互作对醉马草共生体的影响

醉马草是我国西北地区的一种天然烈性毒草,其所携带的内生真菌(Epichloё)能促进共生体的生长和提高共生体的生物与非生物抗性。以5 ℃下正常生长一个月的带内生真菌(E⁺)醉马草幼苗和不带内生真菌(E^-)醉马草幼苗为实验材料,测定了外源SA和ABA处理下醉马草幼苗生理生化指标。结果表明,与对照比较,SA和ABA处理增加了叶绿素含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性,降低了丙二醛含量;SA处理下,在胁迫第4天时,内生真菌显著(P<0.05)提高了脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性,分别提高了51.8%和62.1%。胁迫第6天时,叶绿素含量、丙二醛含量、可溶性糖含量和过氧化物酶活性均达到显著(P<0.05)水平,且SA⁺比SA^-分别显著(P<0.05)提高了23.0%,25.4%,23.7%,18.0%;ABA处理下,内生真菌能显著(P<0.05)提高叶绿素含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性,但在胁迫第6和8天时,内生真菌却显著(P<0.05)降低了丙二醛含量,ABA⁺比ABA^-分别显著(P<0.05)降低了21.1%和34.3%。表明一定浓度的SA或ABA与内生真菌互作能缓解低温胁迫对醉马草幼苗的伤害。     

禾本科植物内生真菌研究9——Epichloё yangzii的种传特性及其在宿主体内的分布

Epichloё yangzii是共生于鹅观草属Roegneria植物的产子座有性型内生真菌。2004-2008年,分别在南京的不同地区采集产子座的鹅观草植株,研究E. yangzii在宿主植物体内的分布特征和种传能力。结果显示,E. yangzii在宿主的地上部分有系统的分布,并进入种子,可以进行垂直传播。同时发现种传的Epichloё属真菌在宿主植物体上也同样具有形成子座的能力,但子座不一定每年都能形成。在须根中没有发现E. yangzii的存在。菌丝体随在植株体内分布部位的不同,其形态特征有一定的差异。     

中华羊茅 Epichloё内生真菌的actin 序列分析

Epichloё内生真菌与禾本科植物很常见。现已有大量关于禾草Epichloё内生真菌系统演化研究的报道,但是尚未发现中华羊茅所带Epichloё内生真菌系统演化方面的研究。本研究经过检测采自青海、甘肃、四川等地中华羊茅8个种群的Epichloё内生真菌带菌率发现8个种群的Epichloё内生真菌均带有Epichloё内生真菌,带菌率为100%。该结果为研究中华羊茅所带Epichloё内生真菌系统演化的研究提供了优良的材料。因此,本研究通过克隆actin(act)序列,并与已报道Epichloё内生真菌act序列构建系统进化树。结果表明,供试菌act序列在进化树上成单支分布,表明该菌属于同一种Epichloё内生真菌,且可能是一个新种。此外,遗传距离分析也证明了供试菌为同一菌种。进化关系同时发现分布在相同或相近地理位置的Epichloё内生真菌聚集在同一个分支,表明它们之间的亲缘关系较近,表明Epichloё内生真菌亲缘关系与宿主采集地密切相关。     

禾草-内生真菌人工接种技术研究进展

内生真菌侵染禾草既可提高宿主植物在群落中的竞争力，又可引起家畜中毒， 因其特殊的双重特性而受到国内外学术界的广泛关注。由于禾草内生真菌具有宿主特异性使其资源的利用开发受到限制。随着分子生物学和基因组学的发展与应用，越来越多优良的内生真菌被发现，禾草组织培养再生体系也已逐步建立，对禾草内生真菌人工接种技术的传统方法有一定程度的改进。筛选具有优良特性的内生真菌菌株，通过人工接种的方法建立既对家畜无毒又能提高宿主品质及抗性的共生体是当前和今后研究的方向与热点。对现有的禾草内生真菌人工接种技术进行了综述，发现目前主要的接种方法有：无菌苗接种法、注射接种法、愈伤组织接种法、种子接种法和成株接种法。其中无菌苗接种法技术趋于成熟而应用广泛，但该方法与注射接种法均对植物有所伤害，增加了幼苗死亡率；愈伤组织接种法潜在成功率较高，但目前成熟的组织培养再生体系建立不完全而应用较少；种子切口接种法是新的接种方法的尝试，该方法操作简便，但目前并无成功接入的范例；种子浸菌接种法对植物组织造成的物理伤害小，幼苗存活率高，能够有效提高接种成功率。通过对现有人工接种技术的研究与探讨，以期借鉴开发其他微生物人工接种方法，同时探索新的接种成功率更高、相容性更好的接种手段，拓展内生真菌在禾草的共生范围，获得更多具有优良性状的共生体。     

内生真菌对醉马草根际土壤线虫群落的影响

为明确内生真菌对醉马草根际土壤线虫群落特征的影响,于2014年6,8和10月,对带内生真菌和不带内生真菌醉马草根际土壤进行采样,利用淘洗-过筛-蔗糖离心法分离线虫,根据线虫形态学特征进行鉴定,结果表明,本研究共捕获土壤线虫11889条,分别隶属于线虫动物门2纲6目22科37属,带内生真菌醉马草根际土壤线虫个体密度高于不带内生真菌醉马草,而类群数、多样性指数(H')、均匀度指数(J)和丰富度指数(SR)均低于不带内生真菌醉马草,但处理间差异不显著,表明尽管内生真菌使醉马草根际土壤线虫个体密度有所增加,使类群数有所降低,但是内生真菌的存在对醉马草土壤线虫多样性没有影响;与不带内生真菌醉马草相比,带内生真菌醉马草根际土壤线虫MI指数显著升高,而PPI指数和PPI/MI值显著降低,表明内生真菌在一定程度上确实改变了土壤线虫功能类群组成,其中主要影响植物寄生线虫。     

内生真菌和水引发对NaCl胁迫条件下中华羊茅种子萌发的影响

本试验以带Epichloё内生真菌(E+)及不带内生真菌(E-)中华羊茅种子为研究材料,研究其水引发后,在NaCl胁迫条件下的萌发情况。结果表明,NaCl胁迫显著降低中华羊茅种子发芽率、发芽势、发芽指数、胚芽长、胚根长和干重。除对照处理外,相对于不带内生真菌的中华羊茅种子,内生真菌能显著提高不同NaCl浓度胁迫条件下中华羊茅种子的萌发力及幼苗生长。水引发与内生真菌可产生互作,在引发时间为20 min时与内生真菌的互作效果最为明显,在不同NaCl浓度胁迫下中华羊茅种子各萌发指标及幼苗生长情况均显著高于其他处理。在对各指标的相关性分析显示,中华羊茅种子的发芽率、发芽势、发芽指数、胚芽长、胚根长和干重相互之间均呈极显著正相关。     

禾草内生真菌的多样性及意义

禾草内生真菌是一个多样性十分丰富的微生物类群,因其具有重要的生理和生态作用而成为当前国内外研究的热点。禾草内生真菌的多样性主要有种的多样性、宿主多样性、生境多样性、形态多样性以及遗传多样性。主要是感染冷季型禾草的香烛菌属(Epichloё)及其无性态Neotyphodium属。全球生态环境复杂、宿主植物多样性丰富,导致内生真菌的多样性更加丰富,从而会发现更多新的真菌分类单元,这在菌种收集和保藏方面独具优势。内生真菌可使禾草提高抗逆性并适应逆境甚至极端环境条件,这对于深入探讨内生真菌-宿主之间的相互作用,有目的性和科学性地构建新的禾草内生真菌共生体及植物微生态系统的研究都具有十分重要的意义。