小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白抗原性与特异性的比较

为筛选建立小反刍兽疫病毒N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法的抗原原料,本研究通过优化大肠杆菌密码子、优化蛋白表达与纯化条件等方法,分别在pET-30a与pET-32a两个不同原核表达载体中成功获得了可溶性的小反刍兽疫核衣壳蛋白(N)。分别对重组大肠埃希氏菌pET-30a-(N)-BL21(DE3)株与pET-32a-(N)-BL21(DE3)株种子批的P7代与P20代进行蛋白诱导表达与抗原提取纯化,共获得6批小反刍兽疫病毒pET-30a-(N)蛋白与pET-32a-(N)蛋白,并对蛋白的浓度、纯度、抗原性和特异性进行检验。结果表明两个纯化后的重组抗原与羊小反刍兽疫病毒阳性血清有明显反应,具有较好的反应性,而与羊痘病毒阳性血清、羊口蹄疫病毒阳性血清、山羊关节炎/脑炎病毒阳性血清等特异性血清均无交叉反应,具有较好的特异性。本研究结果为今后以N蛋白为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法,竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA抗体检测方法打下了坚实的基础。     

小反刍兽疫病毒重组N蛋白抗原制备及间接ELISA检测方法的建立

将编码小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的基因全长克隆到pBacPAK9载体中,并在昆虫细胞中进行表达。对表达产物进行SDS-PAGE分析,并用PPRV阳性血清进行了Western blot鉴定。用Ni-IDA亲和柱对组氨酸融合表达的N蛋白进行了纯化,并对纯化产物进行了理化性质和抗原活性分析。最后以表达的N蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法,临床检测137份山羊血清并与IDvet公司的商品化PPRV抗体检测试剂盒进行比较。结果表明,制备的PPRV N蛋白抗原在溶液中以单体形式存在,具有非常好的抗原活性。用该蛋白建立的间接ELISA检测方法与IDvet试剂盒符合率为956%。本研究为小反刍兽疫病毒重组N蛋白抗原制备相关质量标准的建立奠定了基础,同时建立的ELISA抗体检测方法可以很好地用于小反刍兽疫的临床诊断。     

小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法的建立

通过优化大肠埃希菌密码子、优化表达条件等方法,在大肠埃希菌表达系统中成功获得了可溶性的N蛋白与NH融合蛋白。进一步基于纯化的可溶性N蛋白与NH融合蛋白建立了小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法。该方法敏感性高,特异性强,能够特异性的检测羊血清中的小反刍兽疫病毒抗体,与其他相关疫病病原无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。对292份临床血清样品进行检测,与法国IDVET竞争ELISA试剂盒比较,阳性样品符合率为92.47%,阴性样品符合率为97.26%,总的符合率为94.86%。该方法与传统的ELISA方法相比,具有敏感性、特异性相当,操作简单、快速,具有较高的推广应用价值。     

小反刍兽疫病毒特异性IgY抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

本研究制备了针对小反刍兽疫PPRV全病毒特异性卵黄抗体,利用PPRV N蛋白特异性单克隆抗体和PPRV IgY为主要材料,建立了PPRV双夹心ELISA检测方法检测小反刍兽疫病毒。用该ELISA方法分别检测小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血病病毒、水泡性口炎病毒、赤羽病病毒、口蹄疫病毒,结果表明该ELISA方法可以特异性检出PPRV而与其他病毒间无交叉。用该ELISA和RT-PCR同时检测162份临床样品,结果表明ELISA的特异性和敏感性分别为99.2%和93.7%,两种方法的符合率为98.1%。该方法的建立为小反刍兽疫病毒的初筛检测及小反刍兽疫流行病学调查提供了经济、快速、有效的方法,适用于设备条件不足的基层实验室。     

小反刍兽疫病毒N蛋白抗体与H蛋白抗体在羊体内代谢消长规律的研究

为研究小反刍兽疫病毒N蛋白抗体与H蛋白抗体在羊体内的代谢消长规律,试验通过建立小反刍兽疫N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法、H蛋白阻断ELISA抗体检测方法与血清中和抗体试验方法,分别检测了羊免疫疫苗后体内N蛋白抗体与H蛋白抗体在每个免疫阶段的代谢消长变化。结果表明:羊免疫小反刍兽疫疫苗后,血清内的N蛋白抗体与H蛋白抗体在6~8周时血清抗体效价较高,对应的羊体内中和抗体效价为1∶512,且效价至少可以持续到10周以上,2种抗体具有一定消长代谢规律的相关性。该研究结果也为以N抗原与H抗原为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法、竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA检测方法奠定了一定的理论依据。     

小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达与间接ELISA检测方法的建立

小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白是病毒粒子的主要结构蛋白,也是诊断小反刍兽疫的主要靶蛋白。为获得高效表达的可溶性N蛋白,并建立基于N蛋白的小反刍兽疫的间接ELISA检测方法,通过优化密码子、优化表达条件等条件探索,在大肠埃希菌表达系统中获得了高效表达的可溶性N蛋白,进一步基于N蛋白建立了间接ELISA检测方法,该方法对其他相关的羊类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数均低于9%,具有良好的重复性。对480份临床血清样品进行检测,同时用法国IDVET竞争ELISA试剂盒进行比较,符合率达到98.33%。本研究为进一步开发成熟的小反刍兽疫抗体检测试剂盒奠定了基础。     

小反刍兽疫07株H蛋白在昆虫细胞中的表达及其抗原性鉴定

应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小反刍兽疫病毒西藏分离株Tibet 07的血凝素蛋白,并对其抗原性进行鉴定。扩增小反刍兽疫病毒Tibet 07株H基因,克隆至p Fast Bac/CT-TOPO载体中,构建重组穿梭质粒p Fast Bac-PPRV-H,转化感受态大肠杆菌DH10BacTM,构建重组杆状病毒Bacmid-PPRV-H,转染sf9细胞,通过异源基因重组获得杆状病毒,通过病毒蚀斑试验检测扩增后病毒滴度。将P3代病毒以0.05MOI感染sf9细胞,通过SDS-PAGE鉴定H蛋白的表达,利用Western blot和间接免疫荧光鉴定H蛋白的抗原性。经过PCR、测序等证明重组杆状病毒Bacmid-PPRV-H构建正确。P2代重组杆状病毒的病毒滴度为1×107。表达的H蛋白在相对分子量约68 k Da处可见特异蛋白条带。感染的sf9细胞可与小反刍兽疫病毒H蛋白的单克隆抗体发生特异性反应。表明Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了小反刍兽疫病毒西藏分离株Tibet 07的血凝素蛋白,为进一步研究其生物学功能及构建检测ELISA试剂盒奠定了试验基础。     

小反刍兽疫病毒N蛋白B细胞表位预测、合成及间接ELISA方法的建立

基于氨基酸序列和采用Gamier-Robson和Chou-Fasman等多种方法分析的α-螺旋、β-折叠和转角等二级结构结果,预测小反刍兽疫病毒N蛋白的B细胞抗原表位。设计4段多肽并进行人工合成,作为包被抗原建立小反刍兽疫血清抗体间接ELISA检测方法,用于检测小反刍兽疫山羊临床血清样品,以对预测的B细胞抗原表位进行验证。结果显示,研制的间接ELISA敏感性为96.0%,特异性为96.25%,与进口标准竞争ELISA试剂盒的符合率为96.15%。结果表明,研制的间接ELISA方法适用于小反刍兽疫临床血清抗体的检测。     

小反刍兽疫病毒N蛋白阻断ELISA方法的建立

小反刍兽疫(PPR)是一种跨国传播的重大烈性传染病,主要发生于山羊和绵羊等小反刍动物,具有高发病率和死亡率。小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白是抗体检测的主要靶蛋白,本研究将PPRV Nigeria 75/1毒株的N蛋白进行原核表达,重组蛋白经鉴定和纯化后免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选针对PPRV N蛋白的阳性单克隆细胞株,获得了具有阻断效果的单克隆抗体1B11株。经免疫荧光方法鉴定该单克隆抗体与PPRV Nigeria 75/1毒株发生特异性反应。用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记1B11抗体作为阻断抗体,建立了检测PPRV抗体的阻断ELISA方法。经优化反应条件,抗原的最佳包被浓度为2.5μg/mL,阻断抗体的最佳浓度为1μg/mL,待检血清1∶2稀释反应1 h,底物反应时间为10 min,阴阳性检测临界值为阻断率为58.5%。特异性试验证明该方法与山羊副流感病毒3型(CPIV3)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)等阳性血清不发生交叉反应。通过对234份血清样品进行检测,该方法与商品化试剂盒符合率为91%(213/234)。由此表明,建立的阻断ELISA方法可用于PPRV临床样品的抗体水平检测,为PPRV疫苗免疫效果检验及PPRV根除提供了基础。     

小反刍兽疫病毒N基因在昆虫细胞中的表达

为了研发小反刍兽疫病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原物质,参照GenBank公布的小反刍兽疫疫苗株Nigeria75/1的全基因组序列(GenBank登录号:X74443),人工合成表达核蛋白的N基因开放阅读框序列,通过PCR扩增、经引物设计引入的EcoRⅠ和KpnⅠ特异性酶切位点,将N基因克隆于昆虫杆状病毒表...     

内蒙古和西藏自治区野生反刍动物小反刍兽疫监测

为了解小反刍兽疫疫情在野生反刍动物中的流行情况,在风险较高且野生动物集中分布的内蒙古自治区赤峰市、呼伦贝尔市和兴安盟以及西藏自治区日喀则地区、山南地区、阿里地区和那曲地区,平行采集棉拭子样品和血清样品各78份。通过RT-PCR检测小反刍兽疫病毒核酸,同时用竞争ELISA检测反刍野生动物血清中的小反刍兽疫病毒特异性抗体。结果检测样品中未发现阳性样品。说明该批次样品中没有发现野生动物感染小反刍兽疫病毒。研究结果可为小反刍兽疫防控工作提供依据。     

小反刍兽疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

针对小反刍兽疫病毒核蛋白制备特异性的单克隆抗体,并对其进行生物学特性鉴定和初步应用。以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的致敏脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合,获得单克隆抗体,并通过染色体技术等方法研究其生物学特性,将其作为竞争单抗,Bacmid-PPRV-N重组蛋白作为检测抗原建立竞争ELISA检测方法。结果表明:经克隆和间接ELISA筛选,获得了2株能稳定分泌抗小反刍兽疫病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5B11和3H10-3B8。生物学特性鉴定试验表明:5B11和3H10-3B8抗体类型和亚类均为IgG2b;5B11单抗腹水的效价达1∶819 200,3H10-3B8达1∶12 800;血清学试验证明2株单抗均能与Bacmid-PPRV-N重组蛋白抗原结合,具有高度的特异性;相加ELISA试验结果显示,5B11和3H10-3B8 2株单克隆抗体分别识别N蛋白上不同的抗原位点;2株杂交瘤细胞的染色体均为99～104。应用建立的c-ELISA检测方法对222份血清样品进行PPRV抗体的检测,与参考试剂盒比较得到98.20%的符合率。本研究获得了2株能稳定分泌抗PPRV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以单抗5B11作为竞争抗体建立了PPRV的c-ELISA检测方法。     

小反刍兽疫磁微粒化学发光抗体检测方法的建立

小反刍兽疫（Peste des petits ruminants,PPR）是由副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus,PPRV）引起的一种山羊和绵羊的急性、烈性、致死性、高度接触性传染病。目前小反刍兽疫抗体检测方法主要有胶体金试纸条、酶联免疫ELISA、板式化学发光。本试验利用小反刍兽疫病毒N蛋白和单克隆抗体,建立了小反刍兽疫磁微粒化学发光抗体检测方法,将整个反应过程缩短至15 min。为大批量临床检测小反刍兽疫病毒抗体提供了一种高效便捷的方法。     

新疆小反刍兽疫疫情诊断

2013年12月新疆伊犁州霍城县发生不明山羊疫情,根据临床症状和剖检变化怀疑为小反刍兽疫感染。对3只病死山羊病料、8只患病山羊分泌物棉拭子样品和6只患病山羊血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用竞争ELISA试剂盒对6份血清样本进行抗体检测,结果全部为阳性。利用抗原捕获ELISA试剂盒,在11只病羊样品中都检测到小反刍兽疫抗原。利用能特异性检测小反刍兽疫病毒的荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊样品中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用特异引物进行PPRV N基因片段RT-PCR反应,从11只病羊样品中检测到PPRV核酸。针对2号样本病原核酸N基因和F基因片段进行序列同源性比较,结果该毒株与西藏流行株序列片段相似性分别为96.5%和97.5%。遗传进化分析,该病原属于谱系4,与巴基斯坦等国流行毒株遗传关系最近。     

双抗体夹心ELISA检测小反刍兽疫病毒抗原方法的建立及病原流行病学调查

应用表达纯化的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)N蛋白制备的多克隆抗体,建立了检测PPRV抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对吉林省和内蒙古地区羊群感染PPRV进行了调查。方阵法确定了抗PPRV兔源IgG作为捕获抗体的包被量为0.2μg,酶标抗体的最佳稀释度为1∶1 000。对大量小反刍兽疫阴性粪便样品进行检测及统计学处理,确定了双抗体夹心ELISA检测PPRV的判定标准,即被检粪便样品D490≥0.221,判定为阳性。特异性、敏感性等试验结果表明,建立的检测PPRV抗原方法具有特异、敏感和快速等优点。与RT-PCR方法相比,该方法省时省力、简单快速。应用建立的检测PPRV抗原的双抗体夹心ELISA对吉林省和内蒙古不同地区的羊粪样进行检测,发现羊群均存在程度不同的PPRV隐性感染。本研究在国内首次揭示出临床健康羊群携带PPRV,为今后小反刍兽疫的诊断与防控提供了新的流行病学理论依据。     

小反刍兽疫病毒N基因重组杆状病毒的构建及间接ELISA抗体检测方法的建立

本研究旨在建立基于真核表达的小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的诊断小反刍兽疫的间接ELISA方法。利用Bac-to-Bac杆状病毒-昆虫表达系统,构建含有PPRV N基因的重组供体质粒pFastBacHTA-N,转化E.coliDH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒pBacmid-PPRV-V,转染昆虫细胞Sf21,获得含有PPRV N基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出60ku左右的表达蛋白,Western blot检测该蛋白具有很好的反应原性。以重组Bacmid-PPRV-N蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。临床检测来自西藏疫区的37份山羊血清和来自青海省非疫区的92份山羊血清,与法国蒙彼利埃农学发展研究国际合作中心(CIRAD-EMVT)提供的竞争ELISA试剂盒相比较,特异性为96.2%,敏感性为100%,二者的符合率达到96.9%。结果表明本研究建立的间接ELISA方法可以很好地用于小反刍兽疫的临床诊断。     

小反刍兽疫病毒N基因的克隆及原核表达

根据小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria75/1的全基因序列,通过PCR方法,将N基因亚克隆入pBAD/TOPO表达载体,构建了原核表达质粒pBAD-PPRN。该重组质粒转化至大肠埃希菌TOP10中,经L-Arabinose诱导,SDS-PAGE和Western blot检测,表达的重组N蛋白分子质量与预期的73.6ku一致,为以小反刍兽疫N蛋白为抗原的诊断试剂盒研制奠定了基础。     

小反刍兽疫H蛋白主要抗原表位的原核表达

目的表达小反刍兽疫病毒H蛋白的主要抗原位点用于检测与预防。方法用DNAStar分析小反刍兽疫病毒H基因的主要抗原位点,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从病羊组织中扩增PPRV的H基因的主要抗原位点并克隆到原核表达载体PET-28b中,最后用PCR、酶切和测序分析对重组质粒进行鉴定;将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,经不同浓度的IPTG诱导表达PPRVH基因的主要抗原位点;用SDS-PAGE和Western-blotting分析所有蛋白的表达。结果将RT-PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段;对重组质粒PET-28b-H66-249和PET-28b-H281-550酶切后,均出现预期相符的片段;DNA测序表明插入片段的序列与小反刍兽疫H蛋白基因完全一致,其大小分别为569bp和831bp;将重组表达的蛋白经SDS-PAGE和Western-blotting检测,证明所有的蛋白均得到表达。结论成功表达了PPRVH基因的主要抗原蛋白,为日后的检测与预防工作奠定了基础。     

羊肠道病毒与小反刍兽疫病毒混合感染及流行病学调查

本实验室2014年从吉林省某地暴发严重腹泻的病羊群分离出肠道病毒(CEV-JL14)和小反刍兽疫病毒,表明这2种病毒在该次疫病的暴发中可能发挥重要作用。为进一步了解羊群中小反刍兽疫病毒与羊肠道病毒混合感染情况,本研究应用建立的检测小反刍兽疫病毒抗原的夹心ELISA试剂盒和检测羊肠道病毒抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒,对采自吉林省和内蒙古地区的共计1 167份羊粪便分别进行检测,发现被检羊群存在较为严重的小反刍兽疫病毒与羊肠道病毒混合感染。羊群混合感染小反刍兽疫病毒和羊肠道病毒在国内外属首次报道,该发现为今后上述病毒引起的疫病的诊断、防治提供流行病学理论依据。     

小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的表达与ELISA检测方法的建立

通过对下载的16株小反刍兽疫病毒（PPRV）N基因片段进行序列分析,合成了PPRV N基因。用NP1和NP2引物扩增。纯化的PPRV N基因在T4DNA连接酶的作用下,和PET32-a载体进行连接反应构建重组质粒pET-a-PPRV-N。经诱导表达和纯化后,得到了大量的PPRV N蛋白。用PPRV N蛋白制备免疫血清,经国际标准血清标化后作为参考阳性血清,同时以PPRV N蛋白为抗原建立间接ELISA（I-ELISA）方法。对山东省的467份羊血清检测,使用S/P（样品值/阳性值）平均值加3倍标准差的方法,计算出其临界点为0.28。应用间接ELISA和针对H蛋白的单抗为基础的C-ELISA检测来自于疫区的69份血清,结果两者的符合率为79.7%。