西藏绒山羊KAP7.1和KAP8.2基因多态性及其对部分生产性状的影响

为分析西藏绒山羊角蛋白关联蛋白(KAP)7.1基因和8.2基因与生产性状的关系,采用PCR-SSCP和DNA测序技术对340只西藏绒山羊KAP7.1基因和KAP8.2基因编码区序列进行多态性分析,并与体长、体高、胸围、产绒量、羊绒长度、羊毛长度等生产性状进行关联分析。结果显示:PCR-SSCP检测发现KAP7.1基因只有1种带型,KAP8.2基因有6种带型;KAP7.1基因扩增产物序列中未发现碱基变化;KAP8.2基因扩增产物序列中存在5个SNPs位点,分别为C115T、A207G、A214G、G216A和A278T,除了A278T外都位于编码区;对KAP8.2基因的基因型1、基因型2和基因型3与生产性能进行关联分析发现,基因型1个体的胸深和产绒量显著高于基因型3个体(P<0.05)。结果表明:KAP8.2基因可作为影响西藏绒山羊胸深和产绒量的分子辅助选择标记。     

新吉细毛羊KAP24.1基因多态性及羊毛性状的相关性分析

为了解角蛋白关联蛋白(KAP)24.1基因在新吉细毛羊群体中的多态性与其毛用性状的关联性,试验采用DNA测序法对新吉细毛羊基因组编码区进行测序,找出基因突变位点,然后采用PCRSSCP技术对497只新吉细毛羊KAP24.1基因编码区序列进行多态性分析,并利用最小二乘模型对其多态性与产毛量、纤维直径、拉伸长度进行关联性分析。结果表明:在编码区有两处突变点,一处在348 bp处发生C→T的突变,脯氨酸突变为亮氨酸;另一处在414 bp处发生T→C的突变,丝氨酸突变为脯氨酸,均属于错义突变,KAP24.1基因的AA、AB、BB和CC基因型与纤维直径不相关(P0.05),BB基因型的产毛量和拉伸长度显著大于AB基因型、CC基因型(P0.05)。说明KAP24.1基因可以作为新吉细毛羊产毛量和拉伸长度主要候选基因之一,BB基因型可以作为分子标记用于预测绵羊产毛量和拉伸长度。     

新吉细毛羊KAP13.1基因多态性及其对部分经济性状的影响

本试验采用DNA测序和PCR-SSCP技术,对176只新吉细毛羊KAP13.1基因编码区序列进行多态性分析,并利用最小二乘模型对其多态性与其产毛量、细度、拉伸长度、体质量的关联性进行系统分析。测序表明KAP13.1基因在291bp处发生T→C的突变,在469、528bp处发生C→T的突变,均属同义突变,在T291C位点,CC基因型拉伸长度显著高于TT基因型(P<0.05),而与CT型无显著差异。在C469、528T位点NN基因型的产毛量和拉伸长度显著高于MM型(P<0.05),而与MN基因型无显著差异,其他性状在2个位点的不同基因型间差异不显著。结果表明KAP13.1基因可作为影响新吉细毛羊产毛量和拉伸长度性状的分子标记。     

Ⅰ型IF、KAP1.3和KAP8.1基因多态性及合并基因型与中国美利奴羊羊毛性状的关联分析

采用PCR-RFLP和PCR-SSCP方法对中国美利奴羊和德国美利奴羊Ⅰ型IF、KAP1.3和KAP8.1基因的多态性进行了检测,并分析了多态位点不同基因型及合并基因型与中国美利奴羊羊毛性状的关联性。结果表明:KAP8.1基因CDS区存在g.1026TC和g.1130CT突变。关联分析表明,在中国美利奴羊群体中,Ⅰ型IF基因BB基因型个体羊毛细度和羊毛伸直长度均明显低于AA和AB基因型个体,但3者之间差异不显著(P0.05);KAP1.3不同基因型个体羊毛细度、自然长度和伸直长度差异显著(P0.05),AA基因型羊毛细度最细,为(22.72±0.30)μm;KAP8.1基因不同基因型个体羊毛细度差异显著(P0.05),BC基因型羊毛细度最细,为(21.64±0.43)μm;而羊毛自然长度和伸直长度差异不显著(P0.05);KAP1.3-KAP8.1有利基因型聚合体BC-AA个体羊毛细度显著低于其它合并基因型个体(P0.05)。结果提示:绵羊Ⅰ型IF、KAP1.3和KAP8.1基因单核苷酸多态性及合并基因型对中国美利奴羊羊毛性状有一定的影响,可以作为进行绵羊羊毛性状分子标记辅助选择的候选基因。     

绵羊角蛋白关联蛋白2基因的克隆表达与生物信息学分析

本研究旨在克隆新吉细毛羊和小尾寒羊的角蛋白关联蛋白2(keratin-associated protein 2,KAP2)基因并对其进行生物信息学分析,并初步探讨KAP2基因与羊毛毛用性状分子的关系。分别提取新吉细毛羊和小尾寒羊皮肤组织中总RNA,用RT-PCR方法扩增KAP2基因,将PCR产物克隆于pMD19-T载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-KAP2并进行PCR扩增、双酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果表明,试验成功克隆了大小为463bp的KAP2基因,开放阅读框架(ORF)长414bp,编码137个氨基酸。测序结果比对发现,与小尾寒羊KAP2基因相比,新吉细毛羊的KAP2基因中存在1个由G→A的碱基突变,编码氨基酸由精氨酸(Arg)变为谷氨酰胺(Gln),属于错义突变。新吉细毛羊和小尾寒羊的KAP2蛋白的分子质量分别为14.81和14.84ku,等电点分别是9.67与9.82,两种绵羊KAP蛋白的基本理化性质无明显差异,同属于碱性疏水性、跨膜蛋白;预测到蛋白二级结构均由α螺旋、延伸链、无规则卷曲等构成,新吉细毛羊和小尾寒羊KAP2蛋白三级结构中存在一个由α螺旋引起的空间结构的差异位点。综合以上结果推测KAP2基因可能是影响羊毛性状的差异基因,本试验结果可为探讨两种绵羊毛用性状表型差异的分子遗传奠定理论基础。     

新疆细毛羊pEGFP-C2-KAP6.1真核表达质粒的构建与鉴定

试验采集新疆细毛羊皮肤组织,提取RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出KAP6.1基因,并通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-C2真核表达载体上,构建pEGFP-C2-KAP6.1重组质粒,并进行PCR、酶切鉴定。结果表明,本试验成功构建了新疆细毛羊的pEGFP-C2-KAP6.1真核表达重组质粒,为进一步研究该基因所编码的蛋白与毛品质的关系,以及培育超细羊毛等经济性生物学性状相互关系提供理论依据。     

新疆细毛羊KAP6.1基因的克隆及序列分析

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP)6.1(登录号为AY483218.1)基因序列设计合成2个特异性引物,以新疆细毛羊为研究对象,从采集的皮肤组织中提取RNA进行RT-PCR反应,扩增出长度为320 bp的特异性片段,回收目的片段并连接至pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,检测阳性克隆、测序并进行分析。结果表明:试验成功克隆了新疆细毛羊KAP6.1基因,得到的长度为320 bp序列中包含252 bp的编码区序列。新疆细毛羊与绵羊亲缘关系最近,同源性为99.2%,与山羊同源性为94.8%,有13处核苷酸差异与人和兔的同源性分别为80.8%、75.1%。     

小尾寒羊KAP6.4基因PCR-SSCP分析

KAP6.4是角蛋白关联蛋白KAP基因家族中的一员。为探究小尾寒羊中KAP6.4基因是否存在多态性,试验通过提取小尾寒羊血液样品DNA,利用PCR-SSCP技术检测KAP6.4基因的SNP多态。试验检测到2种基因型,其中AA(基因型频率为0.778)为优势基因型,A(等位基因频率为0.889)为优势等位基因。测序结果显示,AA型基因和Gen Bank登陆序列相一致,AB型基因在编码区发生了7处碱基突变和增添36 bp片段。分析表明,AB型变异造成了3个氨基酸残基的变化。以上结果表明,KAP6.4基因在小尾寒羊群体中存在多态性,这为进一步在小尾寒羊群体中开展绒毛性状与KAP6.4基因多态性的关联分析提供依据。     

绵羊角蛋白关联蛋白8.2基因克隆与表达分析

本研究旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8.2(keratin-associated protein,KAP8.2)基因mRNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。首先提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR方法克隆KAP8.2基因并进行两个品种间的比较分析,实时荧光定量PCR方法分析两个品种间KAP8.2基因的表达谱差异。结果表明已成功克隆出绵羊KAP8.2基因mRNA,该片段长574bp,其中ORF区192bp,编码63个氨基酸,甘氨酸(Gly)和酪氨酸(Tyr)含量依次为23.8%和20.6%,属于典型的HGT-KAP家族。多态性分析显示新吉细毛羊与小尾寒羊KAP8.2基因间存在丰富的多态性,多态位点多位于CDS区两侧,其中小尾寒羊KAP8.2基因3′UTR区c192+19-39出现一个疑似fru-let-7j的作用靶位。不同组织表达谱分析显示该基因为多组织表达基因,但两个品种羊不同组织表达谱存在较大差异,表现为小尾寒羊在脾脏、肝脏和皮肤中高表达,而新吉细毛羊则在皮肤和心脏中高表达。本研究提示小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8.2基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因与毛表型性状相关。     

绵羊KAP8-1基因克隆与表达分析

本文旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8-1(KAP8-1)基因c DNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR法克隆KAP8-1基因,定量RT-PCR方法分析2个品种间KAP8-1基因的表达谱差异。结果表明:已成功克隆出绵羊KAP8-1基因,该基因片段长225 bp,其中ORF区189 bp,编码62个氨基酸,分析显示该KAP8-1基因属于典型的HGT KAP家族,甘氨酸和酪氨酸含量分别为22.6%和17.7%;小尾寒羊与新吉细毛羊间存在丰富的多态性,且多态位点均引起关键性氨基酸的突变;组织表达谱检测表明KAP8-1基因为多组织表达基因,小尾寒羊与新吉细毛羊中不同组织表达谱丰度存在显著差异,表现为小尾寒羊脾脏、肝脏中高表达,而新吉细毛羊则皮肤、心脏中高表达。结果显示,小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8-1基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因可能与毛表型性状密切相关。     

高原型藏绵羊KAP基因单核苷酸多态性分析

试验旨在寻找角蛋白辅助蛋白(keratin-associated proteins,KAP)基因与产毛性状相关的多态位点,为藏绵羊产毛性状的分子标记提供理论依据。采用PCR-SSCP技术对高原型藏绵羊角蛋白辅助蛋白基因家族中KAP3.2、KAP7基因部分序列和KAP8基因外显子进行多态性分析。结果表明,3个基因座都存在多态性,均检测到AA、AB和BB 3种基因型。KAP3.2基因以A等位基因为优势等位基因,AA基因型为优势等位基因型;KAP7和KAP8基因均以B等位基因为优势等位基因,BB基因型为优势等位基因型。高原型藏绵羊在KAP3.2和KAP8基因座达中度多态,而在KAP7基因座为低度多态,在KAP3.2和KAP8位点上基因型频率处于Hardy-Weinberg非平衡状态。测序分析结果表明,KAP3.2和KAP8基因上分别存在1个C→T(271 bp)和1个T→C(1122 bp)的突变,均属于同义突变,KAP7基因5′调控区存在1个T→C(102 bp)的突变。     

绵羊角蛋白关联蛋白2基因的克隆表达与生物信息学分析

本研究旨在克隆新吉细毛羊和小尾寒羊的角蛋白关联蛋白2（keratin-associated protein 2,KAP2）基因并对其进行生物信息学分析,并初步探讨KAP2基因与羊毛毛用性状分子的关系。分别提取新吉细毛羊和小尾寒羊皮肤组织中总RNA,用RT-PCR方法扩增KAP2基因,将PCR产物克隆于pMD19-T载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-KAP2并进行PCR扩增、双酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果表明,试验成功克隆了大小为463 bp的KAP2基因,开放阅读框架（ORF）长414 bp,编码137个氨基酸。测序结果比对发现,与小尾寒羊KAP2基因相比,新吉细毛羊的KAP2基因中存在1个由G→A的碱基突变,编码氨基酸由精氨酸（Arg）变为谷氨酰胺（Gln）,属于错义突变。新吉细毛羊和小尾寒羊的KAP2蛋白的分子质量分别为14.81和14.84 ku,等电点分别是9.67与9.82,两种绵羊KAP蛋白的基本理化性质无明显差异,同属于碱性疏水性、跨膜蛋白;预测到蛋白二级结构均由α螺旋、延伸链、无规则卷曲等构成,新吉细毛羊和小尾寒羊KAP2蛋白三级结构中存在一个由α螺旋引起的空间结构的差异位点。综合以上结果推测KAP2基因可能是影响羊毛性状的差异基因,本试验结果可为探讨两种绵羊毛用性状表型差异的分子遗传奠定理论基础。     

不同绵羊群体KAP2基因多态性分析

为了探究KAP2基因在不同绵羊群体的多态性,本次试验利用PCR-SSCP的方法,分析新吉细毛羊、道赛特羊和小尾寒羊的基因型和突变位点,并对KAP2基因编码区序列进行多态性分析。结果:新吉细毛羊基因序列第292位点处发生T→C的突变,绵羊群体基因型可分为AA、AB、BB基因型;A基因频率中新吉细毛羊、道赛特羊、小尾寒羊分别为0.3261、0.3696、0.5217,B基因频率中新吉细毛羊、道赛特羊、小尾寒羊分别为0.6739、0.6304、0.4783,AA基因型频率新吉细毛羊、道赛特羊、小尾寒羊分别为0.2609、0.3043、0.3913,AB基因型频率新吉细毛羊、道赛特羊、小尾寒羊分别为0.1304、0.2174、0.2609,BB基因型频率新吉细毛羊、道赛特羊、小尾寒羊分别为0.6087、0.4783、0.3478。结论:绵羊群体分为AA、AB、BB基因型,BB基因型为优势基因型。     

六个半细毛羊品种遗传关系的研究

应用微卫星技术对云南半细毛羊、凉山半细毛羊、贵州半细毛羊、彭波半细毛羊、罗姆尼羊和考力代羊基因组DNA进行了17个微卫星位点多态性分析,以期为半细毛羊品种的遗传关系做出评价,同时为这些品种的合理开发利用提供理论依据。研究结果表明:6个研究群体PIC值均大于0.5,表明遗传多样性都极为丰富;遗传分化关系的研究表明,6个群体Nm值均在1以上,Fst值均在0.6以下,说明群体间可能存在一定的基因迁移或者有较近的亲缘关系,其中贵州半细毛羊和考力代羊间存在最大的基因流(Nm=12.065)、最小的变异系数(Fst=0.020 3)、最高的遗传一致度(0.862)及最小的遗传距离(0.148),显示出两个群体较近的亲缘关系;UPGMA聚类图显示6个群体聚为两个大支,贵州半细毛羊、考力代羊、彭波半细毛羊聚为一支,云南半细毛羊、罗姆尼羊及凉山半细毛羊聚为另一支。     

细毛羊KRT26基因多态性及其与羊毛细度的关联性分析

本研究旨在揭示影响绵羊重要经济性状的功能基因的分子遗传特征及其与细毛羊群体的遗传关系,为高效选育绵羊品种经济性状及其种质资源的保护与利用提供分子遗传学依据。试验利用PCR-SSCP、DNA测序和生物信息学对289个细毛羊的KRT26基因进行遗传变异分析及其与细毛羊羊毛细度的关联性分析。结果表明,KRT26基因在该细毛羊群体中存在AA、AB、BB 3种基因型,其基因型频率分别为0.221、0.426和0.353,A、B等位基因频率分别为0.434、0.566,细毛羊群体的多态信息含量为0.371,呈中度多态水平,且处于Hardy-Weinberg非平衡状态(P0.05)。经过BioEdit软件比对序列和Chromas软件分析测序结果显示,KRT26基因发现5处碱基突变:83bp(G/C)、86bp(T/C)、112bp(C/T)、140bp(G/A)和247bp(C/T),并通过氨基酸序列的比对结果表明,2处发生了氨基酸的替代,即Val/Ile和Asn/Lys。KRT26基因在细毛羊群体中AA基因型个体极显著高于AB和BB基因型(P0.01)。因此,KRT26基因可能作为羊毛细度性状的一个新的分子标记。     

鄂尔多斯细毛羊KAP15-1和KAP27-1基因多态性及其与羊毛性状的关联分析

本研究旨在鉴定细毛羊主要经济性状相关的分子标记,以462只1岁鄂尔多斯细毛羊母羊为实验动物,联合DNA混池测序和Snapshot技术,检测KAP15-1基因和KAP27-1基因多态性。采用SAS 9.2对非同义突变位点和鄂尔多斯细毛羊羊毛性状进行相关性分析,利用DNASTAR软件预测蛋白质二级结构。结果显示：KAP15-1基因的SNP1突变位点对羊毛纤维直径标准差和纤维直径变异系数有显著影响;SNP1突变位点对蛋白质二级结构的影响集中在60～80号氨基酸之间。KAP27-1基因的SNP3突变位点对羊毛平均纤维直径有显著影响,对纤维直径标准差和剪毛前体重影响极显著;SNP3突变导致的蛋白质二级结构变化分布在整个氨基酸序列上,但是集中在Beta、Turn、Coil Regions和Antigenic Index部分。综上,KAP15-1基因的SNP1突变和KAP27-1基因的SNP3突变影响鄂尔多斯细毛羊羊毛纤维直径,在实际育种中可作为该性状的潜在分子标记。     

高原型藏绵羊KAP 基因单核苷酸多态性分析

试验旨在寻找角蛋白辅助蛋白(keratin-associated proteins,KAP)基因与产毛性状相关的多态位点,为藏绵羊产毛性状的分子标记提供理论依据。采用PCR-SSCP技术对高原型藏绵羊角蛋白辅助蛋白基因家族中KAP 3.2、KAP 7基因部分序列和KAP 8基因外显子进行多态性分析。结果表明,3个基因座都存在多态性,均检测到AA、AB和BB 3种基因型。KAP 3.2基因以A等位基因为优势等位基因,AA基因型为优势等位基因型;KAP 7和KAP 8基因均以B等位基因为优势等位基因,BB基因型为优势等位基因型。高原型藏绵羊在KAP 3.2和KAP 8基因座达中度多态,而在KAP 7基因座为低度多态,在KAP 3.2和KAP 8位点上基因型频率处于Hardy-Weinberg非平衡状态。测序分析结果表明,KAP 3.2和KAP 8基因上分别存在1个C→T（271 bp）和1个T→C(1122 bp）的突变,均属于同义突变,KAP 7基因5′调控区存在1个T→C（102 bp）的突变。     

绵羊FGF5基因Exon 3多态性对毛用性状的影响

为探寻不同细毛羊品种FGF5基因多态性及其对毛用性状的影响,采用PCR-SSCP方法对苏博美利奴羊和东北细毛羊两个群体的FGF5基因Exon 3区进行了多态性分析,并在苏博美利奴羊群体中对不同基因型个体与其毛用性状进行了差异显著性分析。结果表明:苏博美利奴羊群体FGF5基因Exon 3区存在5种基因型,分别是DD、EE、FF、DE和EF,而东北细毛羊群体只存在DD、EE和DE三种基因型;苏博美利奴羊F等位基因由CDs区c.618和c.733多态位点构成,其中c.733位点C-G突变导致E等位基因型个体氨基酸L-V变异。苏博美利奴羊群体只有FF基因型个体在产毛量指标上显著高于DD基因型个体(P0.05)。不同毛用绵羊品种FGF5基因多态性及其与毛用性状相关性的研究可为利用FGF5基因进行毛用性状选育奠定基础。     

藏系绵羊KAP3.2基因多态性及其对部分经济性状的影响

采用PCR-SSCP和DNA测序技术,对高原型、欧拉型和乔科型3个类型共254只藏绵羊KAP3.2基因的部分序列进行多态性分析,并利用最小二乘线性模型研究了其多态性与体质量、毛长和产毛量性状的关联性。结果,3个群体藏绵羊在KAP3.2基因座上均检测到AA、AB和BB 3种基因型,高原型以A等位基因为主,欧拉型和乔科型以B等位基因为主。3个群体基因型频率均处于Hardy-Weinberg非平衡状态,高原型和欧拉型达中度多态,乔科型为低度多态。测序表明KAP3.2基因271 bp处存在1个C→T的突变,属同义突变。体质量性状上,3类藏绵羊各基因型间均差异不显著;毛长性状上,3类藏绵羊AA基因型均显著高于BB型(P<0.05或P<0.01),而与AB型间无显著差异;产毛量性状上,3类藏绵羊AA基因型均显著高于BB和AB型(P<0.05)。结果表明,KAP3.2基因可作为影响藏系绵羊毛长和产毛量性状的分子标记。     

不同品种藏系绵羊羊毛油汗及脂肪酸含量比较

为了研究不同品种藏系绵羊羊毛油汗及脂肪酸含量的差异,试验采用超临界CO2萃取技术对彭波半细毛羊、浪卡子绵羊、当雄绵羊羊毛油汗进行得率计算及脂肪酸含量的测定。结果表明:彭波半细毛羊的羊毛油汗得率最高(7. 90%),其羊毛油汗平均含量为93. 70%,显著高于当雄绵羊(P0. 05);三个不同品种藏系绵羊羊毛油汗的脂肪酸含量存在差异,其中浪卡子绵羊羊毛油汗总脂肪酸含量显著高于当雄绵羊(P0. 05),彭波半细毛羊羊毛油汗饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸含量显著高于浪卡子绵羊和当雄绵羊(P0. 05),且彭波半细毛羊羊毛油汗油酸含量显著高于浪卡子绵羊(P0. 05),棕榈油酸、二十碳五烯酸含量显著高于当雄绵羊(P 0. 05)。说明不同品种藏系绵羊对营养物质消化与吸收的能力不同。