琥珀蚕内参基因的克隆及表达稳定性检测

琥珀蚕(Antheraea assama)是一种重要的野蚕种质资源。为了开展琥珀蚕功能基因的研究,选择合适的内参基因非常必要。通过c DNA末端快速扩增技术获得琥珀蚕功能基因研究的3个常用内参基因β-actin、GAPDH和18S rRNA的c DNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析3个基因在蚕体不同组织中的转录水平,并利用标准化分析软件ge Norm和Norm Finder分析其表达的稳定性。结果显示,3个内参基因的表达稳定性依次为β-actin、GAPDH、18S rRNA。就组织表达而言,β-actin在幼虫的中肠、脂肪体、马氏管、气孔、丝腺和卵巢以及蛹的输卵管中表达相对稳定;就发育时期的表达而言,β-actin在蛾期的表达也相对稳定。此外,GAPDH在幼虫头部、表皮和血液中的表达相对稳定;18S rRNA在幼虫精巢中的表达相对稳定。对琥珀蚕功能基因表达进行qRT-PCR所需内参基因数量的分析表明,选用2个内参基因即可满足试验需求。     

家蚕热激蛋白HSP90的鉴定、进化与表达模式

热激蛋白90是一类广泛分布与各类生物体中、高度保守的分子伴侣。HSP90s具有帮助受损蛋白的转运、折叠,防止聚集并恢复其正常构象等功能。昆虫HSP90s与生长发育、滞育和杀虫剂抗性等均相关。本研究在全基因组水平对家蚕HSP90s进行了鉴定,共分析获得3个基因(BGIBMGA004612、BGIBMGA012753和BGIBMGA001241)。根据系统发生分析,对家蚕HSP90s分别命名为Bm HSP90A1、Bm HSP90B1和Bm Trap1,它们分属于3个亚家族。家蚕与黑腹果蝇HSP90s直系同源基因的蛋白序列一致性均在60%以上。与其他物种HSP90s一样,家蚕HSP90s含有N-端ATPase结构域,4个特征性序列。基于组织和发育时期芯片及表达序列标签,发现家蚕HSP90s基因均有表达。基于芯片数据,Bm HSP90A1在雌雄间具有非常相似的表达模式,而Bm Trap1在5龄幼虫精巢中的信号值高达16 082.5,暗示着该基因可能与精巢发育相关。HSP90s作为一类功能广泛的分子伴侣,本研究将为其功能研究奠定基础。     

家蚕热激蛋白HSP90的鉴定、进化与表达模式

热激蛋白90是一类广泛分布与各类生物体中、高度保守的分子伴侣。HSP90s具有帮助受损蛋白的转运、折叠,防止聚集并恢复其正常构象等功能。昆虫HSP90s与生长发育、滞育和杀虫剂抗性等均相关。本研究在全基因组水平对家蚕HSP90s进行了鉴定,共分析获得3个基因(BGIBMGA004612、BGIBMGA012753和BGIBMGA001241)。根据系统发生分析,对家蚕HSP90s分别命名为Bm HSP90A1、Bm HSP90B1和Bm Trap1,它们分属于3个亚家族。家蚕与黑腹果蝇HSP90s直系同源基因的蛋白序列一致性均在60%以上。与其他物种HSP90s一样,家蚕HSP90s含有N-端ATPase结构域,4个特征性序列。基于组织和发育时期芯片及表达序列标签,发现家蚕HSP90s基因均有表达。基于芯片数据,Bm HSP90A1在雌雄间具有非常相似的表达模式,而Bm Trap1在5龄幼虫精巢中的信号值高达16 082.5,暗示着该基因可能与精巢发育相关。HSP90s作为一类功能广泛的分子伴侣,本研究将为其功能研究奠定基础。     

家蚕DnaJ5基因的克隆与表达谱分析

DnaJ蛋白是一种调节蛋白。从构建的家蚕蛹cDNA文库中检索到一条编码DnaJ蛋白的EST,并克隆获得家蚕DnaJ5基因(Bm-DnaJ5,GenBank登录号为FJ592078)。该基因的开放阅读框长1 056 bp,编码351个氨基酸,分子质量为38.93 kD,等电点为9.25。利用实时定量PCR技术对Bm-DnaJ5基因在家蚕不同组织和发育时期的时空表达谱进行定量分析,结果显示:该基因在5龄幼虫时期的各组织中都有表达,在睾丸中的表达量最高,拷贝数达到1.16×108个/μg,其次在头部、中肠、前部丝腺和翅原基中的表达量也较高,在气管丛中的表达量最低,拷贝数仅为1.84×104个/μg;在蛹中期的几个组织中均有表达,其中在眼和睾丸中的表达量较高,拷贝数分别为8.79×107个/μg和1.78×107个/μg,而在卵巢中的表达量最低,拷贝数仅为1.94×105个/μg。     

紫花苜蓿MsHSP17.7基因的克隆及功能分析

热激蛋白是一类普遍参与抗逆的保护性蛋白,在植物生长发育及逆境调控中起重要作用。为了解紫花苜蓿(Medicago sativaL.)热激蛋白基因特性及功能,本研究通过同源克隆法获得热激蛋白基因MsHSP17.7,该基因包含477bp开放阅读框,编码158个氨基酸,蛋白分子量为17.67kDa。序列比对发现MsHSP17.7与截形苜蓿(Medicago truncatula)和豌豆(Pisum sativum)中的2个小分子热激蛋白同源性较高,相似度分别是93.38%,83.13%。组织差异性表达显示,MsHSP17.7在茎中表达最多,叶和花次之,在根中最少;实时定量PCR分析显示,MsHSP17.7受高温、高盐诱导表达,在过氧化诱导下表达量变化不明显。对T3代转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)实时定量PCR分析显示,该基因在高盐和过氧化胁迫下均能大量表达,结果表明MsHSP17.7基因可能参与了高盐与过氧化逆境下的胁迫应激调控。     

牦牛FHL2基因的克隆、组织表达与蛋白定位分析

旨在获得牦牛FHL2基因序列，阐明该基因序列、蛋白质结构与性质、mRNA的组织表达模式、在雌性生殖器官及颗粒细胞的蛋白表达特性。本研究以5头健康空怀成年母牦牛的心、肝、脾、肺、肾、卵巢、子宫、输卵管组织及5头妊娠2个月左右母牦牛的子宫、输卵管和卵巢为研究材料，利用逆转录PCR(RT-PCR)技术克隆FHL2基因，并使用在线分子生物学软件分析其生物信息学特性；利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析FHL2基因的组织表达特性；应用免疫组化(IHC)和免疫荧光(IF)技术检测FHL2蛋白在雌性生殖器官的分布和颗粒细胞上的亚细胞定位。结果发现，FHL2基因CDS区全长840 bp (ON456866),编码279个氨基酸，FHL2蛋白属于弱碱性亲水不稳定蛋白，没有跨膜结构。不同物种的FHL2氨基酸序列比对和进化树分析表明，FHL2基因编码区在物种进化中比较保守。RT-qPCR结果显示，FHL2基因在检测的组织都有表达，在心的表达量极显著高于其他检测组织(P<0.01);在肺、卵巢、输卵管和子宫中的表达量极显著高于肝、脾和肾(P<0.01)。FHL2基因在妊娠期子宫中的表达...     

结缕草ZjCCS基因的克隆与表达分析

为了解Cu/Zn超氧化物歧化酶分子伴侣基因(CCS)在结缕草逆境胁迫过程中的表达调控机制,以结缕草(Zoysia japonica)盐胁迫条件下的转录组数据为依据,结缕草cDNA为模板,通过RT-PCR法,克隆了924 bp长的结缕草ZjCCS基因的CDS序列。同源性分析显示该基因与谷子(Setaria italica)同源性最高,含有植物CCS蛋白所特有的3个保守结构域。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究该基因在非生物胁迫条件下在结缕草叶片中的表达情况,结果显示,在盐胁迫条件下,ZjCCS基因的表达量呈先上升后下降的趋势,4 h表达量最高,相对于盐胁迫,干旱和重金属胁迫对ZjCCS基因的表达量影响不大,推测ZjCCS基因可能在结缕草响应盐胁迫过程中发挥作用。     

热应激对猪睾丸Hsp60和Hsp90表达与定位的影响

建立了环境热应激和睾丸局部热处理猪动物模型,用RT-qPCR和Western blot法检测了热休克蛋白家族成员Hsp60和Hsp90 mRNA和蛋白表达水平的变化,用免疫组织化学方法检测Hsp60和Hsp90在猪睾丸的组织细胞学定位。RT-qPCR和Western blot结果显示,与对照组相比,环境热应激组和局部睾丸热应激组Hsp60和Hsp90 mRNA和蛋白的表达量均显著升高。免疫组织化学结果显示,对照组Hsp60主要表达在精母细胞和支持细胞的细胞质,环境热应激组和局部睾丸热应激组Hsp60免疫阳性从精母细胞的细胞质转移至精原细胞的细胞核。热处理前后Hsp90定位于精原细胞和长形精子细胞。环境高温热应激和局部睾丸热刺激导致Hsp60和Hsp90表达升高,提示Hsp60和Hsp90在热应激猪睾丸精子发生过程中发挥重要作用。     

柞蚕的热应激行为表现及2个热激蛋白家族基因的表达特征

野外放养柞蚕常受到高温环境胁迫,研究柞蚕对高温的应激反应和耐受性机制,有利于科学评价柞蚕种质资源对环境的适应能力。调查柞蚕5龄幼虫经39℃、42℃、45℃高温胁迫1~3 h后的热应激行为表现、恢复能力和转室温饲养48 h的死亡率,结果均表现出随温度的升高与胁迫时间的延长,蚕体热激反应加剧、恢复能力降低和死亡率升高的趋势。对3个高温胁迫试验组的柞蚕5龄幼虫,每隔0.5 h取脂肪体提取RNA并逆转录合成c DNA,经qRT-PCR检测热激蛋白基因Ap HSP70与Ap HSP90的表达变化,结果显示:高温胁迫后幼虫的Ap HSP70基因表达量显著高于对照组幼虫(53~777倍),39℃与42℃胁迫试验组幼虫在处理期间该基因的表达均逐步上调至峰值后再下降,其中42℃胁迫试验组幼虫在处理1.5 h时该基因的表达即达到最大值,基因表达量变化差异更为显著,45℃胁迫试验组幼虫在处理初期该基因的表达快速上调后再缓慢下降;高温胁迫后幼虫Ap HSP90基因的表达量也明显高于对照组幼虫(6~45倍),其中42℃胁迫试验组幼虫在处理2 h时该基因的表达达到最大值,之后迅速下降。研究结果初步揭示Ap HSP70与Ap HSP90基因可能在柞蚕幼虫对高温胁迫的适应性中起重要作用。     

不同柞蚕品种的热应激反应差异及2个热激蛋白基因的表达特征

野外放养柞蚕经常会受到高温环境胁迫,研究不同柞蚕品种对高温的应激反应和耐受性机制,有利于科学地评价柞蚕种质资源对环境的适应能力。调查5个柞蚕品种或品系5龄幼虫在42℃和45℃胁迫1～4 h后的热应激行为表现、高温胁迫后的恢复能力和胁迫处理后室温饲养48 h的死亡率,结果显示,方山黄和F的耐热性较好、恢复能力较强,高温胁迫后48 h抗大和F的死亡率较低。高温胁迫1 h后分别取2个胁迫试验组5个柞蚕品种5龄幼虫的脂肪体,qRT-PCR检测热激蛋白基因ApHSP70与ApHSP90的表达变化,结果显示:胁迫后不同品种ApHSP70基因的表达量均显著高于对照组(395～1 124倍),以方山黄的胁迫组和对照组表达量最高;42℃胁迫组抗大与9906、45℃胁迫组5204与9906的ApHSP70基因表达量无显著差异(P>0.05),其余均呈极显著差异(P<0.01)。高温胁迫后不同品种ApHSP90基因的表达量也明显高于对照组(26～460倍),仍以方山黄的胁迫组和对照组表达量最高;42℃对照组方山黄与其他品种ApHSP90的表达水平呈显著差异(P<0.05),而42℃方山黄对照组与抗大胁迫组无显著差异(P>0.05);42℃胁迫组5204与方山黄的ApHSP90基因表达水平呈显著差异(P<0.05),45℃胁迫试验组的抗大与F的ApHSP90基因表达水平不存在显著差异(P>0.05),其余均呈极显著差异(P<0.01)。研究结果可为柞蚕种质资源耐高温胁迫能力评价与柞蚕抗逆性新品种选育提供参考。     

胞内分枝杆菌热休克蛋白65基因的克隆和原核表达

本研究以胞内分枝杆菌ATCC13950株基因组DNA为模板,应用巢氏PCR方法扩增热休克蛋白65(HSP65)基因,PCR产物经纯化后与PMD18-T载体连接构建克隆质粒PMD18-T-HSP65,并转化大肠杆菌感受态细胞DH5,筛选阳性克隆并测序,NdeⅠ和BamHⅠ双酶切PMD18-T-HSP65和表达载体PET15b,用T4连接酶4℃过夜连接,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,筛选和构建了原核重组表达质粒PET15b-HSP65,双酶切鉴定正确后,以终浓度为1mmol/LIPTG诱导并进行SDS-PAGE分析。结果表明,获得约65KD大小的蛋白,与预期结果相符,为胞内分枝杆菌及HSP65基因功能的研究打下基础。     

柞蚕核糖体蛋白基因S3a的克隆及表达分析

核糖体蛋白在蛋白质的生物合成、细胞的代谢与凋亡、机体免疫、信号转导等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)核糖体蛋白基因S3a的开放阅读框(ORF),ORF序列长795bp,编码264个氨基酸。序列比对表明,柞蚕S3a蛋白与其它10个物种S3a蛋白的相似性介于72%～99%之间,其中与柳蚕(Actias selene)S3a蛋白的相似性最高。用RT-PCR方法分析该基因在柞蚕幼虫组织中的表达情况,结果显示柞蚕S3a基因在柞蚕幼虫的血液、中肠、丝腺和脂肪体组织中均有表达,且转录水平无显著差异。SDS-PAGE和Westernblotting检测显示柞蚕S3a基因在大肠杆菌中获得了正确表达。     

热休克蛋白在冷应激引起的炎症反应和氧化应激中的调节作用

冬季持续低温引起的冷应激是降低北方畜牧业经济效益和动物福利的重要因素,可诱导动物产生炎症反应和氧化应激危害机体健康。热休克蛋白作为体内重要的分子伴侣蛋白,在维持机体内环境稳态、帮助动物抵抗应激方面有重要作用,低温环境可激活热休克蛋白快速产生,以此在细胞内外对免疫和抗氧化系统发挥重要调节作用：在胞外,具有保护细胞、参与调节免疫细胞功能、激发免疫反应和提高抗氧化酶活性等作用;在胞内,可抑制NF-κB信号通路保护机体免受炎症损伤,上调Nrf2信号通路提高机体抗氧化功能,缓解冷应激对机体造成的负面影响。本文总结了国内外关于在冷应激状态下热休克蛋白对机体免疫和抗氧化功能的调节作用及其机制,并给出部分提高热休克蛋白表达水平的方法,以期为后续畜禽的冷应激理论研究提供参考。     

鸡IL-18 cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

运用RT—PCR方法，从经脂多糖(LPS)诱导的鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系MIDCC-MSBI总RNA中扩增得到了鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18，ChIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列测定表明，克隆得到的ChIL-18cDNA与国外报道的完全一致，包括终止密码子在内其编码区的长度为510bp，编码169个氨基酸残基的蛋白质。将ChIL-18成熟肽段编码区定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游，构建成原核表达质粒pGEX—ChIL18。该质粒的BL21(DE3)DysS转化菌在IPTG的诱导下可高效表达GST—ChIL18基因融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的32％。     

分子伴侣Jiv90基因的克隆及其在猪脐静脉血管内皮细胞中的表达

为研究分子伴侣Jiv90对猪瘟病毒复制的影响,克隆了分子伴侣Jiv90基因,构建了真核表达载体并在猪脐静脉血管内皮细胞中表达。根据牛的Jiv90基因序列和真核表达载体pEGFP-C1设计引物,经PCR扩增,成功克隆到猪Jiv90基因,回收后与pEGFP-C1载体连接,构建重组表达载体pEGFP-C1-Jiv90,提取质粒并采用脂质体法转染猪脐静脉血管内皮细胞。转染24 h后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,经G418抗性筛选得到阳性克隆。本研究成功构建了pEGFP-C1-Jiv90真核表达载体,得到稳定表达Jiv90的细胞株,为今后开展分子伴侣对猪瘟病毒复制影响的研究奠定了基础。     

柞蚕NPV多角体膜蛋白类似基因的克隆和序列分析

为探明柞蚕核型多角体病毒(Anthraea pernyi nucleopolyhedrovirus,ApNPV)基因组信息,从柞蚕尸体中分离纯化ApNPV,提取其基因组DNA,分别建立ApNPV DNA的HindⅢ和SalⅠ酶切片段文库。对插入片段进行测序,经过同源性分析发现,在2．9kb的SalⅠ片段上包含1个多角体膜蛋白类似基因,其读码框编码289个氨基酸,是一个晚期表达基因。氨基酸同源性比较的结果表明,ApNPV的多角体膜蛋白基因与云杉卷叶蛾(Choristioneure fumiferana)NPV的同源性较高,达91．7%,而与家蚕(Bombyx mori)NPV及苜蓿尺蠖(Autographa califorlica)MNPV的同源性较低,分别为65．1%和63．0%。该结果说明ApNPV与CfNPV在进化关系上较近,而与BmNPV和AcNPV在进化关系上较远。比较多种核型多角体病毒的多角体膜蛋白和多角体蛋白的氨基酸序列发现,这两种多角体结构蛋白的同源性具有相似的变化趋势。     

急性热应激对肉鸡肉品质及热休克蛋白108mRNA表达的影响

研究不同强度热应激对肉鸡感官性状、血液生化指标和热休克蛋白(Hsp)108mRNA表达的影响,将80只30日龄的AA肉鸡随机分为4组,每组20只,对照组环境温度为(25±1)℃,其他3组受试鸡的环境温度迅速上升至(33±1)℃、(37±1)℃、(41±1)℃,并分别持续4h的热应激处理。宰杀后测定鸡胸肉的pH值、滴水损失、肉色和剪切力,利用临床血液病理学和荧光定量PCR的方法,检测宰前不同强度热应激对肉鸡血液生化指标及肌肉、心脏和肝脏中hsp108mRNA表达水平的影响。结果显示,宰前热应激明显降低宰后肉鸡胸肉的pH30min、pH24h和a*值,明显提高宰后肉鸡滴水损失、L*值和剪切力;随热应激温度升高,血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)活性逐渐升高,碱性磷酸酶(AKP)活性逐渐降低;hsp108mRNA表达水平大部分呈现下降的趋势,除了心脏33℃组表达量明显增高,其他应激组表达量均有所降低。建立的荧光定量PCR体系特异性好,灵敏度高,符合检测热休克蛋白mRNA转录水平的要求,表明热休克蛋白可作为热应激的一个敏感指标。     

高温条件下柞蚕血淋巴过氧化氢酶活性的变化

为揭示高温逆境条件下柞蚕(Antheraea pernyi)血淋巴过氧化氢酶(catalase,CAT)活性的变化规律,采用40~46℃的高温冲击处理柞蚕幼虫,结果引起柞蚕血淋巴过氧化氢酶活性升高。在处理温度范围内,处理时间越长、温度越高,柞蚕血淋巴CAT活性上升幅度越大,其中不同性别、不同品种的上升幅度存在差异:雄性柞蚕的血淋巴CAT上升幅度高于雌性柞蚕;3个供试品种相比,抗病2号的升降速度最快,上升幅度高于青6号,明显高于三里丝,表明柞蚕血淋巴CAT活性与柞蚕品种的抗逆能力存在密切关系。停止高温处理后,柞蚕血淋巴CAT活性逐渐下降到正常水平。     

柞蚕胆绿素还原酶基因ApBVRB的克隆及表达分析

柞蚕(Antheraea pernyi)幼虫体壁颜色表现出高度多样性。胆绿素还原酶(biliverdin reductase B,BVRB)可催化血红素降解过程中产生的胆绿素还原成胆红素,参与昆虫体色形成。为明确BVRB在柞蚕幼虫体色形成中的作用,克隆柞蚕胆绿素还原酶基因ApBVRB,检测其mRNA表达水平,同时调查胆绿素还原酶的活性。ApBVRB编码205个氨基酸,预测蛋白质分子质量为50.67 kD,等电点为5.15。氨基酸序列比对表明,ApBVRB与家蚕的黄素还原酶(flavin reductase,FR)具有75%的序列相似度。qRT-PCR检测结果表明,ApBVRB在柞蚕幼虫的所有受试组织器官中均表达,除丝腺外,青、黄体色幼虫之间的相对表达量并没有显著差异。酶活性检测发现,胆绿素还原酶活性在青、黄蚕的血淋巴和丝腺中有极显著差异,推测可能由于血淋巴中该酶活性的差异而导致柞蚕幼虫表现为青、黄2种体色。