联合环介导等温扩增和横向流动试纸条可视化检测副猪嗜血杆菌

为快速鉴定临床上的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)感染,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术结合横向流动试纸条(LFD)测定法进行核酸扩增和结果的可视化判定。选择副猪嗜血杆菌inf B基因中保守序列设计5组环介导等温扩增引物,筛选最适引物组;用生物素和6-FAM标记内引物用于LAMP扩增反应,结合LFD建立了副猪嗜血杆菌LAMP-LFD快速检测方法,并测试该方法的特异性、灵敏度、重复性和临床应用效果。结果表明：1)优化后的LAMP在66℃下运行30 min, LFD可以在5 min内特异性、直观地检测到副猪嗜血杆菌;2)特异性强,与其他5种细菌无交叉反应;3)敏感度高,其最低检测浓度为1.285×10^-12 ng/μL,较普通PCR方法灵敏度显著提高;4)采用该方法对52份临床样品进行检测,副猪嗜血杆菌阳性率为19.2%(10/52),与LAMP检测结果的符合率为100%。综上,本研究建立的LAMP-LFD方法可特异、灵敏、准确地应用于副猪嗜血杆菌的可视化检测,而且操作简单、仪器设备要求及检测成本低、耗时短,适用于基层养殖场副猪...     

对虾桃拉综合征病毒环介导逆转录等温扩增快速检测方法的建立

根据对虾桃拉综合征病毒（TSV）结构蛋白基因保守序列,利用Primer Explorer 40软件设计了4条引物,建立桃拉综合征病毒环介导逆转录等温扩增快速（RT LAMP）检测方法,对反应温度和反应时间等参数进行了优化;同时将建立的RT LAMP检测方法与RT PCR进行比较分析,RT LAMP的检测灵敏度比RT PCR高10倍。结果表明,RT LAMP最适反应在60 ℃恒温条件60 min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色的阳性结果明显区别于橙色阴性结果;RT LAMP对感染TSV的对虾检测呈阳性,而对对虾其他常见病原检测均为阴性,具有高的特异性。     

减蛋综合征病毒环介导等温扩增检测方法的建立

根据GenBank登录的减蛋综合征病毒(EDSV)六邻体基因的保守区,设计了3对环介导等温基因扩增(LAMP)引物,优化反应体系,并对其灵敏性、特异性进行验证.结果表明:LAMP优化后的反应体系为外引物浓度0.1μm01·L-1,内引物浓度0.8 μmol·L-1,环引物浓度0.4μmol·L-1,Mg2+浓度8.0 ...     

检测鹅细小病毒环介导等温扩增方法的建立及结果判定方法改进

利用新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的体外环介导等温扩增检测方法.针对鹅细小病毒VP3基因的8个位点设计了6条特异性引物,建立了一种快速检测鹅细小病毒的LAMP方法.试验结果表明LAMP方法在恒温65℃水浴下50 min内即可完成GPV的检测,且其检测灵敏度达150 pg·μL-1;与其他常见的病毒无交叉反应.以钙黄绿素和Mn2+作为荧光指示剂,可快速、直观判定反应结果,可见该方法为适合基层及现场快速检测、实用灵敏的分子生物学方法.     

淋巴囊肿病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

根据淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守序列,利用Primer Explorer 3软件设计了5条引物,对LAMP反应温度和反应时间等参数进行了优化.与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒等其它虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都没有交叉反应.将LAMP检测方法与常规PCR进行灵敏度的比较分析,结果显示LAMP的检测灵敏度约为15fg,比常规PCR灵敏度高一个数量级.该方法检测时间短,在1 h内即可完成检测.用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明12尾外观有淋巴囊肿病症状的牙鲆样品中都含有淋巴囊肿病毒,而10尾外观正常牙鲆鱼苗则没有检测到淋巴囊肿病毒(与预期结果一致),说明LAMP方法比较适合淋巴囊肿病毒的早期及现场诊断.     

大蒜X病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

采用逆转录环介导等温扩增技术（RT\|LAMP）,建立一种便捷、灵敏的大蒜X病毒（Garlic virus X, GarVX）的快速检测方法。根据GarVX ORF4序列的保守区设计6条特异性引物,分别识别该保守区的8个位点,在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行扩增反应。通过条件优化,在65℃恒温条件下温浴60 min可成功检测GarVX。特异性检测结果表明,该方法可特异性检出GarVX,对大蒜A病毒（Garlic virus A, GarVA）、大蒜D病毒（Garlic virus D, GarVD）、大蒜E病毒（Garlic virus E, GarVE）等的检测均为阴性,且检测灵敏度高,最低检出限为5 pg·μL-1,是RT\|PCR方法的10倍。试验结果表明,RT\|LAMP检测方法可快速、特异、灵敏地检测GarVX,并适合现场快速检测。     

草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为更加快速、灵敏地检测草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV),建立环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。根据GenBank中GCRV HZ08等毒株VP6蛋白基因序列设计引物,以GCRV弱毒疫苗株(GCHV-892)总RNA为模板建立RT-LAMP反应,对扩增产物用限制性内切酶PvuⅡ进行酶切鉴定,所得酶切产物大小符合预期值。随后对LAMP反应体系包括Mg2+、dNTPs、甜菜碱(betaine)和内外引物浓度比进行了优化,并以含VP6蛋白基因的重组质粒(pEASY-VP6)为模板考量了该方法的敏感性,结果显示最低检测限为10copies.μL-1,比RT-PCR检测方法敏感10倍。特异性试验表明与白斑综合征病毒(WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、病毒性神经坏死病毒(VNNV)无交叉反应。应用RT-LAMP方法检测16份疑似出血病草鱼,6份病料获得了阳性扩增,与RT-PCR检测结果一致。     

猪细环病毒1型环介导等温扩增方法的建立

猪细环病毒(Torque teno sus virus,TTSu V)是一种无囊膜,单链的DNA病毒,存在猪细环病毒1型和猪细环病毒2型2个亚型。为建立一种新型快速的TTSu V1检测方法。针对TTSu V1保守的非编码区域(untranslated regions,UTR)设计2对LAMP引物,并对反应体系和反应条件进行了优化调整,建立了TTSu V1 LAMP检测方法。结果表明该方法最佳反应条件为62℃1 h,病毒最低检出限可达9.2 copies/μL,特异性良好。LAMP反应是一种集特异性强,灵敏度高,反应速度快于一体的的基因检测方法,有望成为快速检测TTSu V1的手段之一。     

猪瘟病毒RT-LAMP-LFD检测方法的建立与应用

【目的】建立一种新型的、能在基层场地进行实时便捷诊断的猪瘟病毒检测方法。【方法】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)相结合,针对猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)NS5B基因设计一套特异性引物及生物素标记探针,结合异硫氰酸荧光素标记的扩增产物,建立RT-LAMP-LFD检测方法。【结果】所建立的方法能够特异地检测出CSFV的存在,检测PRRSV、JEV、PCV-2等其他病毒均为阴性;所建立的CSFV-RT-LAMP方法对RNA的最低检测限为50 pg;反应快速,整个扩增反应可在1 h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察。【结论】应用RTLAMP-LFD检测CSFV特异性强、灵敏度高,并且操作安全、简便、快捷,可以满足基层检疫的需要。     

菜豆晕疫病菌环介导等温核酸扩增检测方法的建立

为了建立菜豆晕疫病菌的环介导等温扩增方法,本试验利用菜豆晕疫病菌arg K特异性序列设计环介导等温核酸扩增(LAMP)引物,进行反应条件和反应体系的优化,并进行特异性和灵敏度验证。特异性检测结果显示,5株菜豆晕疫病菌的LAMP产物呈阳性结果,而参试的其他病原菌不产生扩增反应。LAMP检测基因组DNA和菌悬液时,其灵敏度分别达到0.632×10-4ng/μl和7.3×102CFU/ml,该方法比常规PCR灵敏度高100倍。表明本研究所建立的LAMP检测方法简便、快速、准确、灵敏,可有效应用于口岸菜豆晕疫病菌的检测。     

禽流感病毒LAMP快速诊断方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)基质蛋白(M)基因设计了两对引物,特异性识别其6个不同位点,建立了基于颜色判定的环介导等温扩增反应(LAMP)方法。试验对不同禽源病毒进行了测试,结果发现该方法仅特异性地检出禽流感病毒(H9和H5亚型)核酸,对AIV病毒的检测极限为10 EID50。人工感染病料检测结果与鸡胚病毒分离法的符合率为967%。数据表明,建立的LAMP方法特异、敏感、简便,在禽流感的诊断中具有很大的临床应用潜力。     

利用LAMP法快速检测致病性哈维氏弧菌

从浙江宁波的发病鲈鱼(Lateolabrax japonicus)分离到1株致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) LY-1。从该菌的DNA样本中成功扩增出大小为873 bp的ToxR基因片段。DNA序列分析表明:该序列与已登录哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) ToxR基因同源性为96.57%,与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、鳗弧菌(V.anguilarum)、创伤弧菌(V.vulnificus)、费氏弧菌(V.fisheri)、溶藻胶弧菌(V.alginolyticus)、霍利斯弧菌(V.hollisae)、拟态弧菌(V.mimicus)、河弧菌(V.fluvialis)的ToxR基因相似性为27.62%~72.49%。选择哈维氏弧菌ToxR基因种内保守区段,设计1套环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的特异引物,对扩增条件进行优化实验,在65℃孵育45 min的条件下即可完成哈维氏弧菌特异性扩增,成功建立了海水致病菌-哈维氏弧菌的LAMP快速检测方法。结果分析表明:该方法对哈维氏弧菌DNA的最小检出量为1 fg,比PCR法灵敏度高3个数量级。利用LAMP方法快速检测哈维氏弧菌,目前在国内外还未见报道。     

家蚕核型多角体病毒LAMP可视化检测技术的建立

[目的]建立针对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的环介导等温扩增(LAMP)可视化检测技术,为生产现场进行家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持.[方法]以BmNPV多角体蛋白基因po如为扩增靶标,分别设计5组内/外引物和5条环引物,根据扩增效率筛选最佳引物组合;优化LAMP反应条件,并进行LAMP检测的特异性、敏感性及临床样本检测试验;使用羟基萘酚蓝(HNB)染色对结果进行比色观察,对简化样品处理的条件进行摸索.[结果]使用环引物后LAMP对BmNPV基因组DNA的最低检测浓度为7fg/μL,检测灵敏度得到有效提高,且反应时间缩短.建立的LAMP检测方法对靶标DNA扩增具有特异性,对样本的检出率高于常规PCR,其最低检测限是常规PCR的100倍.在反应前加入HNB,结果易判断且能减少交叉污染.感染家蚕血淋巴进行100℃煮沸处理后即可直接用于LAMP反应,既简化了操作步骤,又降低了检测成本.[结论]针对BmNPV建立的LAMP可视化检测技术具有灵敏、快捷、可靠的特点,适合用于生产现场的BmNPV感染早期诊断.     

一种基于LAMP技术快速检测小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性方法的建立及应用

[目的]传统的植物病原菌抗药性检测方法存在检测周期长、操作繁琐、效率低等诸多缺点,建立一种小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)对多菌灵抗药性快速检测的方法尤为重要。[方法]基于环介导等温扩增技术(LAMP),以小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性基因型F167Y的β2微管蛋白基因为靶标,经过人工错配,设计并筛选LAMP特异引物,对检测体系各组分浓度配比进行优化,并通过人工接种试验验证该检测技术的可靠性。[结果]建立了一种小麦赤霉病菌对多菌灵抗性的快速、高通量的分子检测技术,该检测技术能特异性鉴定小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性菌株;证实了该检测技术在生产中可靠、稳定、可操作性强,具有广阔的应用前景。[结论]该检测方法是LAMP技术在小麦赤霉病菌抗药性监测中的首次应用,可用于抗药性群体的动态监测与抗性风险评估,为小麦赤霉病的抗药性治理提供用药指导。     

转基因玉米NK603品系成分LAMP快速PCR检测方法的建立

根据转基因玉米品系NK603外源插入片段与玉米基因组序列设计品系特异性引物,建立转基因玉米品系NK603的品系特异性环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行灵敏度、特异性测试。试验表明该方法能够快速检测出转基因玉米NK603品系成分,检测灵敏度为0.1%,并具有较高的特异性和较好的稳定性。     

检测禽多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增(LAMP)方法的建立

以禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)C48-1为研究对象,利用LAMP方法对Pm进行快速检测.结果表明:LAMP方法在恒温65℃下,1 h内就可以检测到Pm;LAMP方法最低可检测100 pg.μL-1Pm基因组DNA.该方法不需要精密的温度循环装置,有恒温加热设备就可以满足检测条件,适合基层临床应用.