金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554 bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1 650 bp,含一个462 bp的内含子;其cDNA编码区全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470.该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点.     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列。序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1650bp,含一个462bp的内含子;其cDNA编码区全长1188bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470。该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点。     

白三叶化感作用相关基因CHS的克隆及生物信息学分析

白三叶(Trifolum repens)化感物质中含有多种化学成份,主要含有酚类与萜类及黄酮类物质,而查尔酮合成酶(CHS)是类黄酮途径的第一限速步骤,对于黄酮类物质的合成至关重要。本试验从白三叶中克隆了CHS基因cDNA序列,并对白三叶CHS基因进行了生物信息学分析。结果表明克隆到的CHS基因全长cDNA序列1473bp,其中包含了1170bp的开放阅读框(ORF),起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,103bp的5′UTR和200bp 3′UTR编码389氨基酸。且白三叶的CHS基因与同属于豆科的苜蓿CHS、大豆CHS、鹰嘴豆CHS和豌豆CHS亲缘关系最近,处于同一分支,这与植物分类相一致。     

荧光素酶基因在转化烟草中的表达

来源于萤火虫的荧光素酶结构基因与花椰菜花叶病毒35SRNA启动子以及胭脂碱合成酶DNA3’末端结构相拼接,构成一融合基因.通过叶盘感染法将该融合基因引入烟草叶盘,把选择诱导培养基上形成的愈伤组织转到选择分化培养基后能很快分化出芽点,继而长成完整的再生植株.对再生植株提取物发光试验表明,外源基因已整合到烟草细胞的核基因组上,并能在烟草中表达.带有这种融合基因的重组质粒pBC341具有KpnI、SstI等单一的酶切位点,因而也可作为常规的基因载体.     

象草PpCCR基因正、反义表达载体的 构建及对烟草的转化

象草(Pennisetum purpureum)是一种广泛种植于热带和亚热带地区的多年生资源植物,但其木质素含量过高,影响了对其的开发与利用。为探讨肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA Reductase,CCR)基因对木质素合成的影响,本研究以华南象草为材料,构建了CCR基因正反义表达载体,并利用农杆菌侵染法转化烟草。通过Wiesner和Maule染色法对转基因植株进行木质素的组织化学染色。结果发现,转基因植株的木质素单体组成并没有明显改变;但PpCCR过表达烟草,转基因株系木质化细胞增多;PpCCR反义表达烟草,转基因株系木质化细胞排列相对松散。同时反义表达CCR,在木质素含量下降最明显的植株中茎秆呈红褐色。上述结果表明,CCR对木质素的合成起重要作用,这为进一步对象草进行遗传改良奠定了基础。     

紫花苜蓿MsZFN基因超表达载体的构建及对烟草的转化

对紫花苜蓿一种新的CCCH类型锌指蛋白基因进行克隆及转化到烟草中,为研究该基因的功能提供依据。将紫花苜蓿锌指蛋白MsZFN基因(EU624138)连接到载体pBI121上,构建成植物表达载体pBI-ZFN。将表达载体转化到感受态农杆菌株LBA4404中,利用农杆菌介导的方法,以烟草无菌苗叶片为外植体,转化烟草,经卡那霉素筛选获得十几个烟草再生植株。对其中四个再生植株进行PCR和Southern检测,证明目的基因已经整合到烟草基因组中,通过RT-PCR检测,初步证明目的基因在烟草中可以表达。     

紫花苜蓿MsFPS基因超表达载体的构建及烟草转化

采用RT-PCR技术获得紫花苜蓿的法呢基焦磷酸合成酶基因,并连接到含有35S启动子和GUS基因的载体pBI121上,成功构建植物表达载体pBI-FPS.用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中,共获得7株卡那霉素抗性苗,对其中的4株进行PCR检测,证明目的基因已经整合到烟草基因组中.进一步对这4株进行RT- PCR和组织化学染色法检测,初步证实目的基因在烟草中可以表达,说明已成功获得能够表达MsFPS基因的转基因烟草.     

白三叶HD-Zip类转录因子TrATHB-12的克隆及表达分析

HD-Zip转录因子是高等植物中特有的一类转录因子,在高等植物的生长发育以及生物和非生物胁迫等逆境应答中起着重要的调控作用。本试验以白三叶品种‘拉丁诺’（Trifolium repens ‘Ladino’）为试验材料,通过同源获取和cDNA末端快速扩增技术（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）得到白三叶HD-Zip类转录因子TrATHB-12全长序列,并利用相关软件分析其生物信息学特性,使用荧光定量的方法研究其对非生物胁迫、信号分子和激素的响应,从而为后续构建载体转染白三叶以研究其在各种胁迫下的响应提供一定的基础。试验结果表明,TrATHB-12全长cDNA为1 175 bp,开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）包括744个核苷酸序列,编码248个氨基酸,有2个保守结构域,仅包含HD和LZ,属于HD-Zip I类转录因子。同源分析和进化树结果显示,TrATHB-12基因核苷酸和蛋白质序列与其他豆科植物相似度较高,是较为保守的基因。生物信息学分析发现TrATHB-12编码的蛋白理论分子量为28 738,等电点为5.18,无信号肽和跨膜结构,是不稳定亲水蛋白。表达模式结果显示,TrATHB-12基因在根系和叶片中的表达量有所差异。其中,干旱可以显著诱导叶片中TrATHB-12基因的表达,盐胁迫则可以显著诱导根系中TrATHB-12基因的表达,TrATHB-12对其他逆境均有不同程度的响应;脱落酸（Abscisic acid,ABA）和吲哚乙酸（Indole acetic acid,IAA）处理下叶片中TrATHB-12的表达量显著上升;TrATHB-12对于H₂O₂和NO信号分子有较明显的响应。综上,本试验可为继续深入研究TrATHB-12基因,从而提高白三叶抗逆性奠定一定的基础。     

过表达FaSAMDC基因提高黑麦草属植物的抗旱性和耐热性

主要探讨了在黑麦草属植物中导入高羊茅S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(FaSAMDC)对转基因植株抗旱耐热性的提高效果,为培育黑麦草抗旱耐热新品种提供种质新材料。选择黑麦草成熟种子为外植体,采用贵州省草业研究所分子生物学实验室构建的过表达载体以及黑麦草胚性愈伤组织高频植株再生和农杆菌介导的遗传转化体系,将克隆自高羊茅的FaSAMDC基因转入贵州地区主栽品种多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季的基因组内,经抗性筛选、PCR检测和Southern杂交分析验证,获得45株特高与44株四季的转基因植株,转化频率分别为2.93%和2.28%。抗旱耐热试验表明,在30 ℃高温和中度干旱胁迫条件下,特高转基因株系的根冠比比对照组培苗高出7.08%,叶片相对含水量(RWC)比对照高出13.12%,RWC降低幅度比对照少5.49个百分点;四季转基因株系的根冠比比对照组培苗高出6.54%,RWC比对照高出12.54%,RWC降低幅度比对照少6.50个百分点,差异均达到显著水平(P<0.05),证明转入FaSAMDC基因的黑麦草阳性株系的抗旱耐热能力得到了明显提高。形态与生长特征观测结果显示,与非转基因组培苗相比,转基因株系的叶长、株高、主茎节数减小,叶宽、单株分蘖数增加,叶色变深,植株形状趋向于叶片丛生的紧凑型,推测导入的FaSAMDC基因参与了基因表达、细胞分裂等生理功能的调节。     

紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及烟草转化

根据已经克隆得到的MsZIP基因(GenBank序列号:HQ911778),合成编码区cDNA,构建植物超表达载体PBI-MsZIP。将MsZIP基因插入到含有启动子35S和终止子nos的载体PBI121中, 酶切鉴定表明,目的基因已经正确的插入到载体中,超表达载体构建成功。采用CaCl₂冻融法将其转入农杆菌中,然后采用农杆菌介导的方法转化烟草(Nicotiana tobacum),共得到12株抗性烟草苗,选取其中长势良好的3株进行分析。结果表明:转基因烟草的PCR, RT-PCR和Southern-blot检测均得到了与目的条带大小一致的片段,说明已经成功获得了能够表达MsZIP基因的转基因烟草;进一步对转基因烟草进行组织化学染色分析,该基因在根、茎、叶中都可以表达。本试验为MsZIP基因功能的研究提供了理论依据和试验材料。     

镉胁迫对白三叶和马蹄金种子萌发的影响

采用不同浓度的镉处理白三叶和马蹄金种子,研究两者萌发阶段对镉胁迫的反应。结果表明:镉浓度低于5mg/L时促进了白三叶和马蹄金种子的萌发。镉浓度为10mg/L时,白三叶发芽率和活力指数开始下降,而马蹄金依然高于对照。随镉处理浓度的继续增高,两者种子发芽率和活力指数逐渐下降。两个草种相比较,在相同镉胁迫作用下,马蹄金比白三叶表现出了较强的耐镉性。     

新疆白三叶的形态特征及坪用性状

新疆野生白三叶(Trifolium repens)资源丰富且抗逆性强,试验通过分析白三叶的分枝数、叶片特征、花序数等形态指标及坪用性指标,对白三叶的利用价值进行分析研究。结果表明,供试的材料具有抗性强,开花早,花色鲜艳,花期、绿期持续时间长和观赏性强等特点。其中,呼图壁的材料均具有返青早、草层低矮(17.1～21.3 cm)、花期(150～154 d)和绿期(221～225 d)较长等优点,适宜作为观赏性草坪草;天池的材料E(24.30 cm)和昌吉的材料F(26.10 cm)草层较高,适宜作为饲用牧草;特克斯的材料H叶量大(0.335个·cm-2)且花(0.216个·cm-2)多,适宜作为蜜源植物。     

扁穗牛鞭草对白三叶的化感作用初探

采用生物检测的方法研究了扁穗牛鞭草根、茎、叶等水浸液的化感作用。结果表明,不同器官的水浸液对白三叶种子萌发有不同程度的抑制作用,其中根的水浸液抑制作用最强。当提取液浓度达到0.1g/mLDM时,不同器官的水浸液对幼苗的生长也有较强的抑制作用,幼苗的形态也发生不同程度的改变。由此说明牛鞭草对白三叶种子萌发和苗期生长化感作用明显。建议用这2种牧草建立混播草地时,白三叶不宜采用种子繁殖。     

新疆野生白三叶表型性状变异研究

以新疆13份白三叶(Trifolium repens)为材料,通过观测其株高、叶形、叶色、花色、茎长、茎节间长和千粒重等特征,研究新疆野生白三叶表型性状差异。结果表明:白三叶的各个指标在群体间存在显著差异,具有丰富的遗传多样性。通过聚类分析可将13个群体分为3类,呼图壁M单独聚为1类;呼图壁J、呼图壁K、呼图壁L、乌市南山D和昌吉F聚为1类;其余7个聚为1类。本研究结果能够为开展野生白三叶的生物学特性和遗传育种研究提供基础数据。     

川东地区白三叶引种适应性试验研究

从2003年开始.在四川达州试验点连续5年对拉丁诺和胡依阿两品种白三叶(Trifolium repens)生长发育、根系生长情况、茎叶比、草产量以及种子产量进行观察测定.结果表明,两品种较为适应川东地区的夏季高温伏早天气,能完成整个生育周期,全年生长,无明显枯黄期,青绿期320 d以上.越夏率100%.抗病力强;具有较...     

白三叶人工草地数量化管理指数的研究

在综合分析影响白三叶人工草地生长发育的管理因子基础上,选择了4个管理因子,进行封闭型管理因子梯度试验设计,模拟草地管理过程。并采用数量化理论I方法,以白三叶单株产草量为因变量,以管理因子为自变量,建立管理指数的回归模型,通过逐步回归筛选出主导因子,以主导因子建立预测方程,编制出了白三叶人工草地数量化管理指数表。该管理指数表经检验符合精度要求,可以对白三叶人工草地进行管理效率的统一评价。     

几种除草剂防治白花三叶草苗期杂草试验

通过几种除草剂对白花三叶草(Trifolium repens L.)苗期杂草防除试验,证明15%精稳杀得乳油900ml/hm2、5%精禾草克乳油750 ml/hm2、6.9%骠马水剂900 ml/hm2、20%氯嘧磺隆可湿性粉刺60g/hm2 4种除草剂不仅除草效果好,而且对白花三叶草安全;75%百阔净胺盐水剂1 200ml/hm2、20%使它隆乳油900ml/hm2、75%星干燥乳剂21g/hm2药害严重,不宜采用.     

间作建立白三叶种子田试验

在白三叶与鸭茅、多年生黑麦草、大麦3种植物间作的试验中，得出结果为：大麦在苗期及冬春季节对杂草的控制效果较好，以后就失去了对杂草的控制作用；鸭茅能较好地控制杂草，但抑制白三叶的生长；多年生黑麦草与白三叶共生性较好，能长期控制杂草，同时白三叶可获得较理想的种子产量，是白三叶种子生产理想的间作物种。白三叶与多年生黑麦草间作，种子产量511．33kg／hm^2，显著高于白三叶与鸭茅及大麦的间作（P〈0．05）。     

转胡杨PeDREB2b 基因白三叶表型变异及抗旱性评价

选取W1-2、W1-3、W4-2、W13-4、W17-1、W28-2、W33-3这7个转胡杨(Populus euphratica)PeDREB2b基因白三叶(Trifolium repens)株系为试材,以非转基因白三叶海发为对照,测定了植株的形态特征和永久萎蔫率,以及在不同时间、不同浓度PEG模拟干旱胁迫下的叶片相对含水量、相对电导率和丙二醛含量的变化,旨在评价转基因白三叶株系的抗旱能力。结果表明:1)部分转基因白三叶株系的叶形、叶色、叶片斑纹及叶片大小发生了较明显的变化;2)转基因株系W1-3、W28-2永久萎蔫率明显低于对照,且能维持较长时间的正常生长,表现出一定的抗旱性;3)随着模拟干旱胁迫程度的增加及时间的延长,参试材料的叶片相对含水量呈不同程度下降的趋势,叶片相对电导率、丙二醛含量均有不同程度升高。但转基因株系W1-3、W28-2的叶片相对含水量始终保持较高水平,未出现较大波动,且株系W1-3的相对电导率、丙二醛含量始终保持较低水平,变化较小。综合分析表明,7个转基因白三叶株系的抗旱性强弱依次为W1-3W33-3W28-2W1-2W13-4W17-1W4-2,均优于对照白三叶海发品种。     

遮荫环境对白三叶草气孔和光合特性的影响

为弄清遮荫环境影响白三叶草Trifolium repens生长的机理,对不同光照条件下生长的白三叶草的气孔特性和光合特性进行了比较研究.较强生境光照条件下,白三叶草的气孔密度较大;中叶与侧叶气孔密度差异不显著,不同生境光照条件对气孔分布无显著影响.较强生境光照条件下,白三叶草的光合、气孔导度和胞间CO2浓度较高,而蒸腾却较小.不同生境光照条件下白三叶草对CO2和光的响应趋势类似,但较强生境光照条件下CO2补偿点、羧化效率和光合能力均较其他两区低,而表观量子效率和暗呼吸速率最高.结果表明,较强生境光照增加了白三叶草的气孔密度,提高了光合速率,但却降低了其光合能力.