HPLC-MS/MS同时检测乌龙茶中草铵膦、草甘膦和氨甲基膦酸残留

建立了基于HPLC-MS/MS同时检测乌龙茶中草铵膦、草甘膦和氨甲基膦酸的分析方法,3种农药的检出限均为0.1ng/mL,定量限为0.2~0.3 ng/mL,回收率在91%~102%之间,能够满足国家标准对乌龙茶中草铵膦和草甘膦(含氨甲基膦酸)限量的检测要求,并利用所建立的分析方法,对福建市场上的140个茶叶产品的上述农残进行检测,均未超过国家标准限量。     

气相色谱-质谱法测定绿茶中草甘膦和氨甲基膦酸残留量

采用气相色谱-质谱联用建立了一种检测绿茶中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸残留量的测定方法。绿茶样品用水提取,经二氯甲烷液液分配和阳离子交换/反相吸附复合固相萃取柱净化,与三氟乙酸酐和七氟丁醇进行衍生化反应后,由气相色谱-质谱联用仪进行检测。该方法草甘膦定量限为0.05 mg·kg^-1,在2~100 ng·mL^-1浓度范围内呈现良好线性（R²=0.999 3）,氨甲基膦酸的定量限为0.02 mg·kg^-1,在1~100 ng·mL^-1浓度范围内呈现良好线性（R²=0.999 2）。绿茶样品草甘膦添加浓度为0.25 mg·kg^-1和0.50 mg·kg^-1时,其平均回收率分别为90.8%和93.2%,相对标准偏差分别为4.93%和6.74%,氨甲基膦酸添加浓度为0.10 mg·kg^-1和0.20 mg·kg^-1时,其平均回收率分别为85.8%和95.4%,相对标准偏差分别为10.5%和5.16%。该方法净化效果好,杂质干扰小,回收率高,可满足绿茶中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的残留检测要求。     

改良QuEChERS方法与UPLC-MS/MS联用测定茶叶中草甘膦、草铵膦及氨甲基膦酸

建立了改良QuEChERS-超高液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)快速检测红茶和绿茶中草甘膦、草铵膦及氨甲基膦酸残留的分析方法。样品经纯净水提取2次，提取液采用MWCNT、C₁₈、PVPP和CNT-OH吸附剂分散固相萃取净化，质谱以多反应监测模式(MRM)进行测定，外标法定量。结果表明，红茶和绿茶基质中，草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸在一定浓度范围内线性良好，相关系数(R²)为0.999 3～1.000 0，方法的检出限(LOD)分别为0.005 0、0.030、0.030 mg·kg^-1，定量限(LOQ)分别为0.050、0.10、0.10 mg·kg^-1，平均加标回收率在81.6%～120.0%，相对标准偏差(RSD)在0.6%～13.6%。该方法前处理简单、成本低、重复性好、灵敏度高，适用于红茶和绿茶中草甘膦、草铵膦及氨甲基膦酸的检测。     

茶叶中草甘膦残留现状与对策

近年来,草甘膦作为茶园常用除草剂,茶叶中的残留问题备受关注.文章介绍了茶叶中草甘膦的残留现状、检测方法及草甘膦在茶树中的吸收转运代谢行为;分析了草甘膦代谢产物氨甲基膦酸的毒性和风险状况;针对现阶段茶叶中草甘膦存在的问题及隐患提出了相应的建议,为茶叶农药残留安全提供预警信息.     

全自动固相萃取结合UPLC-MS/MS测定茶叶中的草甘膦及其代谢物

建立超高效液相色谱-质谱/质谱法(UPLC-MS/MS)测定茶叶中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的分析方法。用水-二氯甲烷体系对样品进行提取和初步除杂，在全自动固相萃取仪中通过聚苯乙烯键合苯磺酸混合型阳离子交换柱进一步净化样品溶液基质，利用正交试验和方差分析得出最优的衍生条件为5%硼酸钠缓冲溶液和10 mg·m L^-1的9-芴基甲基三氯甲烷(FMOC-Cl)衍生剂在室温下衍生2 h，衍生后的样品溶液在HSS T₃色谱柱和5 mmol·L^-1乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)-乙腈流动相体系下进行梯度洗脱分离，经UPLC-MS/MS进行内标法定量分析。草甘膦和氨甲基膦酸在0.2～50 ng·m L^-1质量浓度范围内线性关系良好，相关系数(R²)均大于0.999，该方法的检出限为2μg·kg^-1，定量限为5μg·kg^-1。低、中、高3个加标水平(5、50μg·kg^-1和250μg·kg^-1)的回收率为94...     

茶树生长稀释在农药降解中的定量

本文报道了不同年度、季节和茶树品种新梢生长速率的差异及新梢生长对农药的稀释作用。研究表明,同一品种茶梢生长速率年度间差异不大,而不同季节和不同品种间有较大差异,不同生育年龄新梢的生长速率也有明显差异。还证明了新梢的生长速率常数即为其生长稀释速率常数。决定生长稀释速率的因子是田间茶树上不同生育年龄新梢的生长速率及茶园中各种新梢的比例。在同样的条件下,茶树生长稀释对不同农药所起的作用有很大差异。对残留期短的农药(如敌敌畏、辛硫磷、马拉硫磷),生长稀释在总降解中的作用不足10%,对杀螟硫磷、乐果、亚胺硫磷的作用     

冰核细菌在山东茶树上的分布规律及消长动态研究

对山东茶树上冰核细菌的种类和分布规律及消长动态进行了研究,结果表明:在山东茶树上可分离得到泛菌属两个种的冰核细菌,分别为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)。分离到的22株冰核细菌中,冰核活性最强的是8号和11号。茶树上不同部位存在的冰核细菌的密度和频率不同,初展叶(芽)上分离得到的冰核细菌的密度最高,也较易分离得到,其次为嫩叶和老叶;茶树品种和不同的茶树栽培区域同样也会影响冰核细菌的分布,如在青岛地区分离的冰核细菌的密度大于泰安地区,不同品种上存在冰核细菌的密度也不同。此外,在雨水较多、湿度较大的季节茶树上冰核细菌的密度较高,而在干燥寒冷的时候则较难分离得到冰核细菌。     

微卫星DNA分子标记技术及其在茶树研究中的应用

本文阐述了微卫星DNA的结构及其多态性分析原理和微卫星标记DNA技术的实践方法,并简要介绍了近年来微卫星DNA分子标记技术在茶树遗传多样性、亲缘关系、种质鉴定、遗传图谱构建、目的基因的定位等方面的应用.     

mRNA差别显示技术及其在茶树基因研究中的应用

mRNA差别显示技术是研究差别表达基因的有效方法。本文介绍了mRNA差别显示技术的基本原理和特点,并阐述了近年来mRNA差别显示技术在茶树逆境胁迫基因表达、激素诱导基因表达、突变基因表达等方面的应用,并对其进行展望。     

茶树体胚APX基因克隆及其在体胚发生过程中的表达与酶活性分析

以铁观音茶树体胚为材料,克隆了茶树抗坏血酸过氧化物酶基因CsAPX(Genbank登录号为MG799534.1)。CsAPX基因包含一个长度为753 bp的开放阅读框(ORF),共编码250个氨基酸,并对其进行相关生物信息学分析。APX酶活性测定结果表明在球形胚至子叶胚阶段APX酶活性呈现下降趋势,并在子叶胚阶段到达最低值,随着体胚进一步的分化,在子叶胚、成熟胚和萌发胚阶段,茶树APX酶活性不断上升,总体呈"先降后升"的趋势。在体胚发生过程中CsAPX基因的表达分析显示,CsAPX基因在茶树体胚发生的5个阶段均存在显著差异表达,总体呈"升—降—升"的趋势,其中在萌发胚阶段的CsAPX基因的表达水平显著高于其他4个阶段,推测CsAPX基因在体胚发生过程中的萌发胚阶段发挥着重要的作用。     

茶悬浮培养细胞玻璃化超低温保存研究

为保存具有稳定代谢能力的优良茶细胞系,本文对茶叶悬浮培养细胞玻璃化法超低温保存进行了初步研究。结果表明:预培养以4d最佳,60%PVS2冰浴装载以20min最好,100%PVS2冰浴脱水处理60min最优,40℃复温解冻细胞存活率最高,采用这些参数进行完整试验的细胞存活率达到76%,初步建立了茶悬浮培养细胞玻璃化超低温保存的冷冻程序。     

茶树CsAAPs亚家族基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术,从龙井43中成功克隆了5个茶树AAPs（Amino acid permeases,氨基酸通透酶）基因。氨基酸序列比对结果表明,5个CsAAPs亚家族蛋白的序列同源性较高,为70.27%。根据氨基酸序列同源性构建系统发育树,结果显示5个CsAAPs分属3组。生物信息学分析表明,CsAAPs均含有9~10个跨膜区域和16~18个AAP保守基序。为了研究该亚家族对氮素的响应情况,选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,氮饥饿两周后,分别供应不同浓度的NH₄NO₃,然后利用qRT-PCR对CsAAPs在不同组织、氮素水平及茶树品种中的表达情况进行分析。研究发现CsAAPs在营养组织中均有表达,但是存在一定的组织表达差异,其中CsAAP3在茎中表达量最高,CsAAP8的主要表达部位为根和茎。在给氮素饥饿处理的茶苗从新供氮之后,CsAAP3的基因表达在3个氮素利用效率不同的品种间差异较大;在氮高效品种中茶302茎中表达的CsAAP3和CsAAP8,可以快速地对低氮条件做出响应,在低氮处理3 h后,基因表达水平明显增加。此研究预示着CsAAPs亚家族在茶树体内可能通过复杂的氨基酸转运参与氮代谢调控。     

福建省53份茶树种质资源遗传多样性ISSR分析

利用ISSR分子标记技术对福建省7个地区的茶树品种进行遗传多样性和遗传结构的分析。筛选出的12条引物共扩增出97条条带,其中多态性条带有92条,多态性谱带百分率为94.84%;53份供试材料可划分为5大类(GS=0.71),遗传距离介于0.66~0.99之间;Nei基因多样性指数为0.224,Shannon's信息指数为0.368,不同地区茶树的遗传多样性参数差异较大,其中宁德福安地区最高,福州鼓山地区最低;总变异系数为0.332,地区内个体间遗传多样性为0.154,而地区间为0.231,福州地区与其他地区之间的相似性较弱;研究认为,福建省茶树遗传多样性丰富,不同地区茶树存在高频率遗传变异,而缺乏遗传信息交流是造成福州地区遗传多样性较低的可能因素。     

茶树CssHSP18.1基因克隆及表达分析

sHSPs基因家族可编码一类小分子的热激蛋白,广泛分布于植物中,具有分子伴侣的功能,在植物抵抗逆境胁迫中起着重要作用。通过基因克隆的方法,获得1个茶树CssHSP18.1基因的开放阅读框（Open reading frame,ORF）,其全长480 bp,编码159个氨基酸。生物信息学分析表明,CssHSP18.1蛋白含有1个典型HSP20结构域,相对分子质量约为18.25 kDa,等电点为5.68,偏酸性,与栎和苹果亲缘关系最近,无信号肽与跨膜结构。RT-qPCR分析表明,CssHSP18.1在甘露醇（D-Mannitol）处理下表达量低于对照组;γ-氨基丁酸（GABA）能促进该基因的表达,在处理后1 h时表达量达到峰值;吲哚乙酸（IAA）和聚乙二醇（PEG 6000）处理后,CssHSP18.1在0.5 h时表达量最高,即GABA、IAA、PEG 6000均可诱导CssHSP18.1的表达。为获得CssHSP18.1可溶性蛋白,构建了pET-28a-CssHSP18.1重组质粒进行原核表达,并分别对表达菌株、诱导温度以及IPTG（异丙基- -D-硫代吡喃半乳糖苷）诱导浓度进行优化。结果显示,CssHSP18.1蛋白最佳表达菌株为BL21（DE3）,最佳诱导温度和IPTG浓度分别为30℃和1.2 mmol·L^-1。最后,采用Western blot对表达的CssHSP18.1蛋白进行验证。本研究为进一步揭示CssHSP18.1基因的生物学功能提供依据。     

广东省山茶属植物种质资源地理分布研究

山茶属植物种质资源(Camellia L.)主要分布于中国南部、西南部、东南部省区。通过查阅文献及植物标本,对广东省山茶属植物种质资源的地理分布进行研究。结果表明：广东省山茶属植物种质资源共4个亚属、10组、48种,占中国山茶属种数的20.6%;在广东省分布广泛,多集中于北部山区;在广东省的垂直分布海拔范围为50～1 800 m。     

茶树多酚氧化酶基因的PCR-RFLP多态性分析

采用PCR-RFLP技术,检测茶树多酚氧化酶(PPO)基因中4个限制性核酸内切酶酶切位点在不同品种中的多态性,以研究其与品种适制性及遗传背景的关系。遗传参数分析表明:4个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),HpaⅡ酶切位点(引物L7/L8扩增区段)呈现高度多态,BsuRⅠ酶切位点呈现中度多态,这2个酶切位点在不同品种中的基因型分布与品种的遗传背景有直接的关联,可作为遗传标记应用于茶树品种遗传亲源关系分析与亲子鉴定。HpaⅡ酶切位点在引物L7/L8扩增区段存在丰富的多态性,且与品种适制性具有明显关联,适制红茶的品种多为AA基因型,此位点能被HpaⅡ内切酶完全酶切;适制绿茶与乌龙茶的品种多为BB型或AB型,此位点不能被酶切或不能完全被酶切,该HpaⅡ酶切位点可作为茶树品种适制性早期鉴定的遗传标记。对引物L7/L8扩增区域的HpaⅡ酶切位点在祁门4号×潮安大乌叶F1代群体进行分型检测的结果表明,该位点在F1代的分离符合孟德尔遗传规律(x2=0.23)。     

浙江开化县茶树种质资源的遗传多样性及亲缘关系分析

收集了浙江省开化县的不同茶树种质资源,利用SSR标记对资源的遗传多样性及个体间的遗传关系进行评估,筛选适于分子鉴别的核心标记组合,并分析样本的亲缘关系。研究结果显示：（1）14个SSR标记在供试样本中具有多态性,每个SSR位点的等位基因数为3~6个,平均等位基因数为4.14个,平均有效等位位点数为2.927个;（2）14个SSR位点的基因分型组合能精确的识别出每份种质资源,基于复合位点分析,成功筛选出10个核心SSR位点作为简化的组合,以该组合检测本试验的36份种质资源,其PE-1和PE-3分别超过0.99,PE-2超过0.95;（3）基于UPGMA构建进化树,将36份样本分为3个类群,并通过亲缘分析初步推测样本组中5个组合可能存在亲子关系。研究表明开化的茶树种质资源具有区别于现有育成品种的遗传背景,遗传多样性丰富。     

茶树CsANS基因及其启动子的克隆与生物信息学分析

采用RACE技术,获得茶树武夷奇种C18叶片花青素合成途径中的花青素合成酶(ANS)基因的c DNA全长序列。采用染色体步移技术获得该基因的启动子序列。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同遮光处理下的表达动态。结果表明,Cs ANS全长c DNA为1 000 bp,其中ORF(Open Reading Frame)为957 bp,编码320个氨基酸,含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能结构域;分离得到Cs ANS基因上游调控序列1 010bp,其含启动子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1(光响应元件)、circadian(生物钟相关元件)等与花青素合成途径相关的重要顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,该基因在全光照处理(CK)时表达量较高,75%遮光时表达量较低。说明该基因的表达受光照强弱的控制。