荧光定量PCR技术及其在动物检疫中的应用

作为体外基因的快速扩增技术,PCR的应用存在很多局限性,如伴随高敏感性而引起的假阳性、EB染色对操作者的危害及环境的污染。为了克服这些缺陷,荧光定量PCR(fluorescence quantitative poly-merase chain reaction,FQ-PCR)应运而生,FQ-PCR解决了传统PCR方法不能准确定量、易交叉污染等实际问题,反应过程中通过实时监测PCR反应体系中的荧光信号便可得知靶序列初始浓度,从而达到快速定性、定量检测的目的。按照荧光产生的原理,可将FQ-PCR分为染料法和探针法两种类型。染料法是在常规PCR反应体系中加入SYBR Green I等荧光染料,…     

实时荧光定量PCR检测畜禽肉制品中鸭源性成分

根据鸭mtDNA COX基因上的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR用于检测畜禽肉制品中的鸭源性成分。结果表明,建立的方法特异性强,与鹅、鸡、羊、牛等15种动物DNA无非特异性扩增;灵敏度高,可检测1.0pg/μL鸭源DNA的存在;重复性好,同DNA浓度所测得Ct值的变异系数均小于3%;应用该法对模拟混合样品进行检测,结果与预期相符,且常见肉类DNA的存在并不影响该法对鸭源性成分检测的灵敏度。说明本试验建立的鸭源性成分实时荧光定量PCR法特异、敏感、稳定,可快速准确检测畜禽肉制品中含有的鸭源性成分。     

荧光定量PCR技术及其在动物传染病定量检测中的应用

荧光定量PCR是近年发展起来的一 种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核 酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR 技术的有机结合,而荧光探针是荧光定量 PCR的核心。目前报道的荧光探针主要有 TaqMan、Amplisensor、分子信标、Lightcycler 以及在这4种探针基础上发展起来的其他荧 光探针。各种荧光探针在定量PCR中的作 用是识别和报告特定核酸。这些荧光探针与 相应的靶分子杂交时经历一个自发荧光形成 或消失的构象变化,只有与完全互补的靶核 酸杂交时才会出现这种变化,当靶核酸存在 碱基错配或缺失时,荧光探针就不会与之杂 交,也不会出现荧光的变化。在检测时根据 这种荧光变化来确定检测中特定核酸的存在 和量的多少。荧光探针用于定量PCR不但 提高了PCR的检测灵敏度,还能在同一封闭 管中对模板进行准确定量检测,特别适合特 定核酸扩增的实时监测。荧光定量PCR用 于动物传染病的诊断,不但能定量检测病原 体感染的强弱和在机体内的分布,还具有灵 敏、快速、省力的特点。     

荧光定量PCR技术在疾病检测上的应用

实时荧光定量PCR技术融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,以直接探测PCR过程中荧光信号的变化获得定量的结果。因其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点,成为当前疫病检测广泛采用的分子生物学诊断技术。本文就实时荧光定量PCR技术在疾病检测上的应用作一综述。     

实时荧光PCR技术在动物疫病诊断中的应用研究

实时荧光定量PCR技术于1996年美国Applied Biosystems公司推出以来,取得飞速发展。该技术通过在普通PCR反应体系中加入荧光探针或荧光染料,在PCR过程中直接检测荧光信号的变化情况,从而能够实时监测整个PCR进程,     

荧光PCR法定量检测动物源性饲料中的牛、羊成分

疯牛稿是由于健康牛食入含有致病性朊粗的人工蛋白质饲料(肉骨粉)所致，而目前尚未见能有效、快速地检测饲料中牛、羊成分的技术报道。本文在前期研究的基础上．运用荧光定量PCR法．针对牛、羊、鸡、猪几种不同动物的特异性基因序列设计了牛、羊两种动物的特异性探针，通过对整个PCR过程的实对荧光监测，来鉴定饲料中的牛、羊成分，并对其定量范围做了简单的计论。本方法能有效解决普通PCR的样品污染问题，具有特异性强、是敏度高、重复性好等特点。     

实时荧光定量PCR技术

荧光定量PCR技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的,具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、操作简单等优点,不但能够用于基因定量检测,还能准确定量疾病相关基因的表达,现已广泛应用于人类和动物疾病的快速检测、定量分析、早期诊断、基因分型等方面。它可以采用绝对定量和相对定量2种方式实现定量检测,但都有各自的优缺点,需根据具体的试验选择合适的定量方式,从而得到更准确的试验结果。提高荧光定量PCR技术的特异性和灵敏度需从多方面着手,主要指特异性探针及引物的设计,选择合适的Mg2 浓度、引物和探针浓度、循环数等。     

实时荧光定量PCR技术在水产研究中的应用

实时荧光定量PCR（Real—time fluorescent quantitative PCR,FQ—PCR）技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种通过检测荧光信号的变化进行核酸定量的技术。与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。本文综述了实时荧光定量PCR技术的基本原理及其在水产研究中的应用。     

实时荧光定量PCR技术及应用

实时荧光定量PCR技术是在常规PCR基础上发展起来的核酸定量技术,于1996年由美国Applied Biosystems公司推出.当前,实时荧光定量PCR技术应用范围很广,例如,能从粪便材料中分离出的细菌DNA来精确定量检测肠道菌,使我们能详细地分析肠道中优势菌与荧光原位杂交(FISH)及培养方法检测不到的非优势菌,为理解肠道菌群与机体状况关系提供重要线索.该技术从原理上分为荧光染料检测模式和荧光探针检测模式两方面.     

荧光定量PCR检测方法在猪瘟诊断上的应用研究进展

实时荧光定量PCR技术是结合PCR技术、光谱技术和计算机技术发展起来的一种新型分子生物学定量检测技术,其融合了PCR技术的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量的特点,不仅实现了对核酸模板的定量,而且具有特异性强、灵敏度高、重复性好、准确性强、自动化程度高、速度快、全封闭反应、无污染等优点,在猪瘟疫苗的定量检测、猪瘟病毒的诊断以及猪瘟强、弱毒鉴别诊断中得到广泛应用,显示出良好的应用前景。本文就荧光定量PCR技术及其在猪瘟诊断上的应用概况作一综述,以期为我国猪瘟的综合防控提供参考。     

猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法研究进展

实时荧光定量PCR技术是结合PCR技术、光谱技术和计算机技术发展起来的一种新型分子生物学定量检测技术,其融合了PCR技术的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量的特点,它不仅实现了对核酸模板的定量,而且具有特异性强、灵敏度高、重复性好、准确性高、自动化程度高、速度快、全封闭反应、无污染等优点,在猪瘟疫苗的定量检测、猪瘟的诊断以及猪瘟病毒强、弱毒株鉴别诊断中得到了广泛应用,显示出了良好的应用前景。论文就荧光定量PCR技术及其在猪瘟诊断上的应用做一简要综述,为我国猪瘟的综合防控提供参考。     

实时荧光PCR技术在动物疫病诊断中的应用

近年来，实时荧光PCR技术在动物疲病诊断中的应用得到了进一步的发展，在诊断动物的病毒性、细菌性和寄生虫性疫病中得到了广泛的应用。实时荧光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，又可进一步提高灵敏度；实时荧光PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，实时荧光PCR技术将会在动物疫病诊断中得到更加广泛的应用。     

实时荧光定量PCR检测多重耐药大肠杆菌AcrA基因mRNA表达水平

体外单一药物诱导标准大肠杆菌ATCC25922,获得了耐氯霉素（CHL,MIC≥256 mg/L）、耐环丙沙星（CIP,MIC≥256 mg/L）、耐水杨酸钠（SAL,MIC≥275 mg/L）、耐四环素（T,MIC≥512 mg/L）的菌株。选取ATCC25922株,4株中度耐药菌SAL（175）、CHL（64）、T（64）、CIP（128）,4株高度耐药菌SAL（275）、CHL（256）、T（512）、CIP（256）,和临床分离的3株耐药大肠杆菌H1、H9、H10,通过实时荧光定量RT-PCR方法检测外输泵AcrA基因的mRNA表达水平。系统自动分析软件显示,Ct值与标准质粒浓度的对数之间存在良好的线性关系,回归系数为0.992。检测结果表明：H10、CHL（256）、CIP（256）拷贝数最高,达1015拷贝/μL;T（512）、H9、T（128）、SAL（275）、H1为1014拷贝/μL;CHL（128）、T（64）、CHL（64）为1013拷贝/μL;ATCC25922为1012拷贝/μL。不同程度耐药株AcrA基因的表达量不同,临床分离株和诱导的各高耐药菌株均比ATCC25922株表达量高,且差异极显著（P≤0.01）。这说明不同耐药程度的11株菌cDNA的量存在差异,AcrA基因转录水平与耐药水平成正相关。     

禽源大肠杆菌荧光定量PCR方法的构建及应用

为建立一种灵敏、准确且快速检测禽源大肠杆菌的方法,根据禽源大肠杆菌uidA基因的一节特异性保守序列设计引物,建立用于禽源大肠杆菌的荧光定量PCR(qPCR)检验方法,并对其各方面进行评价。试验数据表明所建立的qPCR方法的Ct值与标准品在4.69×10²～4.69×10⁹copies/μL范围内存在优良的线性关系,线性相关系数为R²=0.993;该方法标准曲线方程为y=-3.2786x+39.032,熔解曲线表现为单峰,不存在非特异性扩增。对重组质粒标准品的最低检测浓度为4.69×10²copies/μL,是普通PCR方法的1000倍。该方法检测临床样本阳性率为68.3%(41/60),普通PCR阳性检出率为23.3%(14/60),阳性检出率高出45%。此次研究建立的检测禽源大肠杆菌的荧光定量PCR检测方法可用于禽源大肠杆菌的快速诊断,对于禽大肠杆菌病的监测具有重要意义。     

布鲁氏菌实时定量荧光PCR检测体系的建立及应用

本根据GenBank上公布的布鲁氏菌BCSP31基因保守区域序列设计合成一对特异性引物与TapMan探针,建立整套快速准确鉴定布鲁氏菌的实时定量荧光PCR检测体系。以实验室构建的克隆有布鲁氏菌目的片段的重组质粒为标准品,进行实时定量荧光PCR反应检测,通过优化反应条件,建立标准曲线。以标准品为模板,对该方法的特异性、敏感性与重复性进行检测与分析。并以临床样本进行检测的结果进行比较分析,结果表明,该检测体系的检测灵敏度高,重复性与特异性良好。本研究建立的实时定量荧光PCR可用于准确检测样本中的少量的布鲁氏菌,具有良好的应用前景和市场价值。     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

根据沙门菌保守的fimY基因序列设计合成了引物和TaqMan探针，建立了快速检测沙门菌的实时荧光定量方法，并对反应条件进行了优化，组装成快速检测试剂盒。通过对临床样品的检测，该试剂盒的检测灵敏度达4.5CFU（25μL反应体系），比常规PCR高100倍，而且稳定性良好，至少可以冷冻保存9个月。结果表明，所建立的沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点，适于大量样品的检测。     

实时荧光定量PCR检测布鲁菌方法的建立

旨在建立实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。经选取高度保守的具布鲁菌属特异性的BSP31基因设计了一对引物及探针,并采用矩阵法优化反应体系,筛选出引物、探针、dNTP和Mg2+最优浓度配比,同时进行了特异性和灵敏性试验,建立了实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。该方法可用于对布鲁菌病普查监测及进出境动物及其产品的检验检疫。     

荧光定量PCR法的优化及其在牛羊源性成分检测中的应用研究

SYBR Green荧光定量PCR法可对含牛羊源性成分饲料进行快速筛选。本文通过优化PCR条件,将原有的三步法简化为两步法,筛选时间由最初的116min减少至67min,并应用于170份饲料样品的检测。经过筛选,排除了166份阴性样品中的162份样品,占97.6%;被怀疑为阳性样品的8份样品中,有4份样品最终被确认为阳性样品。此方法的应用,将提高饲料中牛羊源成分检测的速度和灵敏度,加强了防止疯牛病传播的保障力度。     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速及量化的猪瘟病毒(CSFV)检测方法,设计扩增CSFV E2基因的特异性引物,建立Eva Green染料的RT-qPCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性测试,并检测疑似猪瘟病毒感染的临床样品.结果显示,所建立的RT-qPCR检测方法标准曲线的线性相关系数R2=1.000,具有良好的线性关系...     

TaqMan实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数

以3-磷酸甘油醛脱氢酶为内参基因,建立一种快速检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的TaqMan荧光定量PCR方法.通过对反应参数进行优化,建立针对目的基因和内参基因的双标准曲线,并对重组酵母基因组中外源基因和内参基因的拷贝数进行同时定量检测,外源基因与内参基因起始模板拷贝数的比值即为外源基因在重组酵母菌株基因组中的拷贝数.结果表明,2条标准曲线在101～108拷贝·μL-1具有良好的线性关系,以及良好的敏感性和重复性.利用该方法对60株重组酵母菌株进行荧光定量PCR检测,结果筛选到38株单拷贝插入菌株和22株多拷贝插入菌株.本研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR方法方便、高效,可用于重组毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的检测.