小菜蛾COX7C基因的克隆与表达分析

细胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase,COX)是真核细胞线粒体内膜和需氧细菌细胞膜呼吸电子传递链的终端氧化酶,与ATP的合成密切相关,COX7C基因属于细胞色素C氧化酶核基因编码的一个亚基。本研究克隆了小菜蛾COX7C基因,测序后获得1条全长为213bp的PxCOX7C基因开放阅读框序列,进化树分析表明COX7C在同一目昆虫中也不是完全保守的。荧光定量PCR分析COX7C在小菜蛾毒死蜱品系(CRS)、氟虫腈品系(FRS)和敏感品系(SS)3龄幼虫中的表达水平,结果表明COX7C在3个品系中均有表达,且在FRS中的表达量显著高于SS,说明其可能与小菜蛾对氟虫腈解毒代谢相关。本研究对小菜蛾COX7C进行了初步的探索研究,为今后对COX7C进一步的功能研究奠定基础。     

谷氨酸棒杆菌Cgl0864基因强启动子的鉴定

鉴定强启动子可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)代谢工程育种及重组蛋白生产提供高效的基因表达调控元件,但谷氨酸棒杆菌内源性强启动子的鉴定鲜有报道。本试验进行谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株细胞全蛋白二维电泳并对高表达蛋白质斑点进行质谱分析,选取分子量大小约为30 kDa、等电点约为4.6的斑点作为研究对象,分析其所对应蛋白编码基因的启动子。启动子预测结果表明,谷氨酸棒杆菌Cgl0864基因启动子P0864转录活性强。将强启动子Ptac-M和启动子P0864分别插入启动子探测载体pDXW-11,转化ATCC13032菌株感受态细胞,获得工程菌株C. glutamicum/pDXW-11-Ptac-M和C. glutamicum/pDXW-11-P0864。氯霉素耐受性试验结果显示,菌株C.glutamicum/pDXW-11-Ptac-M和C.glutamicum/pDXW-11-P0864的氯霉素耐受性分别为30和40μg/mL;报告蛋白CAT氯霉素酰基转移酶活性检测结果显示,C.glutamicum/pDXW-11-Ptac-M和C.glutamicum/pDXW-11-P0864菌株细胞抽提物上清液CAT蛋白氯霉素酰基转移酶比活力分别为4.50和6.12 U/mg;氯霉素乙酰基转移酶基因cat转录水平的荧光定量PCR试验检测结果显示,cat基因在启动子P0864的控制下,其转录水平是在Ptac-M控制下转录水平的1.84倍。以上结果表明,谷氨酸棒杆菌Cgl0864基因启动子P0864是强启动子。     

大白菜小植株突变体s1光合能力及光反应相关基因的转录组分析

植株的大小与光合能力密切相关。本研究以大白菜小植株突变体s1和其野生型WT为材料,通过测定叶绿素含量、净光合速率、叶绿素荧光参数以及对光反应相关基因的转录水平分析,解析大白菜植株大小与光合能力的相关性。结果表明:与野生型相比,大白菜小植株突变体s1的叶绿素含量无显著差异,但光合速率显著降低29%;Fv/Fm和Y(II)值在二者之间无显著差异(P>0.05),而s1的外叶和新叶ETR值都显著低于WT;进一步的转录组分析表明光合电子传递链上的PSII、PC、FNR、ATP合酶相关基因表达下调0.94～1.69倍。由此证实,大白菜小植株突变体s1光合速率低与光合电子传递链中的基因表达下降及光合电子传递速率下降有关。该研究为进一步挖掘大白菜植株大小相关的优异基因资源提供了良好的试验材料,也为大白菜分子设计育种提供了理论依据。     

基于转录组测序解析南瓜子叶黄化的分子机理

为研究南瓜叶色黄化突变的机制，挖掘黄化相关关键基因，试验以南瓜自然黄化突变体为试材，通过高通量RNA测序(RNA-seq)对苗期子叶进行转录组分析。结果表明：从检测的26 445个表达基因中鉴定出12 687个差异表达基因(DEGs),包括6 444个上调基因，6 243个下调基因；其中2 321个DEGs是转录因子编码基因。选取14个与光合色素密切相关的DEGs进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析，发现它们的基因表达水平与转录组测序结果一致。经KEGG富集分析，发现卟啉和叶绿素(Chl)生物合成、光系统Ⅰ、光系统Ⅱ、光合作用-天线蛋白、电子传递和F型ATP酶相关基因的表达显著下调。谷氨酰-tRNA还原酶、镁离子螯合酶、叶绿素a加氧酶基因异常表达，血红素代谢相关基因表达上调抑制了Chl合成；β-胡萝卜素3-羟基酶促进了类胡萝卜素生成；另外，光合作用过程受阻也反馈抑制Chl合成，Chl合成受阻和类胡萝卜素合成受促导致南瓜叶色黄化。研究结果为南瓜黄化突变的分子机制提供了新的见解，为关键基因功能分析和南瓜育种奠定了基础。     

基于转录组学的巨菌草内生链霉菌拮抗玉蜀黍平脐蠕孢的分子机理

通过Illumina Hiseq4000高通量测序平台,采用PE150测序策略研究了玉蜀黍平脐蠕孢在链霉菌发酵液胁迫下(S组)的转录组变化,共得到128 613 786个clean reads,筛选出4 559个差异基因.与无发酵液的对照组相比,S组中有2 283个基因表达上调,2 276个基因表达下调;从中挑选出表达量差异最大的22个基因作为内生链霉菌调控拮抗的拟关键基因,这些基因多涉及氨基酸合成和代谢以及信号转导途径,说明链霉菌发酵液对玉蜀黍平脐蠕孢的氨基酸生物合成和MAPK信号通路相关基因的影响显著;采用实时荧光定量PCR验证其中5个基因的表达量,其趋势与转录组分析结果基本一致.     

线粒体和叶绿体中能量转化问题研究

该研究探讨了在线粒体和叶绿体中质子驱动力和三磷酸腺苷(ATP)生成的关系。质子驱动力是驱动ATP生成最直接的因素。结合线粒体内膜的电子传递链系统和叶绿体内囊体膜上的光合系统,分析了线粒体内膜电子传递链、ATP合成酶以及叶绿体内囊体光反应和暗反应的能量转化机制,并且对线粒体和叶绿体系统中的能量转化效率问题进行了定量计算。     

盐胁迫下园林植物彩叶树响应菌根共生的比较转录组分析

土壤盐分是典型的非生物胁迫因素之一,严重影响着植物的生长发育。为了解盐胁迫下鸡爪槭(Acer palmatum)对接种丛枝菌根真菌的应答分子机制,对接种丛枝菌根处理(AM)、盐胁迫处理(SS)、盐胁迫接种丛枝菌根处理(AS)及对照处理(CK)进行转录组测序分析。结果表明,基于转录组测序技术(RNA-Seq)测序共获得4 672个新基因;将SS与AS处理进行比较时,鉴定出455个差异表达基因(DEGs),其中286个基因上调表达,169个基因下调表达。对获得的DEGs进行功能注释及富集分析,GO(gene ontology)分析结果表明,盐胁迫下接种丛枝菌根真菌涉及蛋白质生物合成相关过程、ATP生物合成过程、蛋白质谷胱甘肽化、细胞分化调控、氮同化相关过程、呼吸电子传递链以及类胡萝卜素代谢等生物过程。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析结果表明,主要涉及苯丙烷、黄酮类、二芳基庚烷类及姜酚的次生代谢通路。综合GO、KEGG富集分析结果可知,这些基因主要参与植物细胞内部环境的改善、氮代谢相关过程和宿主光保护机制。实时荧光定量PCR(...     

转ATP/ADP转运蛋白基因籼稻的初步研究

ATP/ADP转运蛋白(AATP)在质体膜上负责外源ATP的转入,直接关系到质体内ATP浓度,从而可能影响质体内相关的一些重要代谢途径(如淀粉合成).本研究利用4个转基因结构(水稻aatp正反义转基因结构和菊芋aatp正反义转基因结构),采用农杆菌介导法获得了113个转基因水稻克隆.PCR、Southern Blot验证和后代遗传分析表明,外源基因多数以较低拷贝数整合到水稻基因组中.RT-PCR相对定量检测分析表明,插入基因在水稻中高水平表达,且与内源aatp基因在转录水平上存在复杂的相互干扰,反义植株aatp的转录水平比正义株系的低.     

青田田鱼幼鱼脑组织在急性低氧胁迫、复氧恢复的转录组分析

为了解青田田鱼(Cyprinus carpio var. qingtianensis, Paddy Field Carp)对稻田急性溶氧变化的水环境适应性, 依据青田田鱼对低氧耐受性参数及当地稻田水环境溶氧日变化的实际情况模拟急性低氧和复氧环境,基于RNA-seq技术对青田田鱼幼鱼常氧对照组[温度:(25.37±0.76)℃,溶氧:(7.07±0.39)mg/L,CB组],低氧胁迫6 h组[温度:(25.65±0.76)℃,溶氧:(0.57±0.16)mg/L,HB组]和复氧恢复6 h组[温度:(25.78±0.58)℃,溶氧:(7.21±0.53)mg/L,RB组]脑组织进行转录组分析。结果表明:HB组与CB组文库比较发现存在1 094个差异基因,其中,730个上调,364个下调;RB组与HB组文库比较发现2 288个差异基因,其中,803个上调,1 485个下调;RB组与CB组文库比较发现201个差异基因,其中,80个上调,121个下调。进一步将差异表达基因进行 GO 功能注释和 KEGG 富集分析发现差异基因主要富集在糖酵解/糖异生、HIF-1信号、mTOR信号及VEGF信号等通路上。通过RT-qPCR对糖酵解/糖异生及相关通路中的6个差异基因进行验证,证实了转录组测序结果的可靠性。这些结果为研究青田田鱼在急性溶氧变化环境下的生理调节机制提供了分子生物学的基础研究。     

甘蔗ATP结合蛋白基因克隆及其干旱胁迫下的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗ATP结合蛋白基因,分析其基本生物学信息及在干旱胁迫下的表达特性,为ATP结合蛋白的功能研究提供理论依据.[方法]从乙烯诱导甘蔗差异表达转录组和水分胁迫下甘蔗cDNA文库中获取ATP结合蛋白基因序列,设计其引物进行RT-PCR扩增,利用生物信息学软件进行序列分析及其蛋白结构和功能预测,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测干旱胁迫处理下的甘蔗ATP结合蛋白基因的表达情况.[结果]克隆获得的甘蔗ATP结合蛋白基因全长2145bp,编码714个氨基酸,其蛋白分子质量为79.430kD,理论等电点(pI)为9.33,不稳定系数为44.38;甘蔗ATP结合蛋白与玉米ATP结合蛋白的核苷酸序列及其推导氨基酸系列同源性最高,均达93%.甘蔗ATP结合蛋白主要由无规则卷曲(42.02%)、α螺旋(25.63%)和延伸链(22.27%)结构组成,具有蛋白激酶催化结构域、ATP结合位点、核苷酸结合位点(NBS)、糖基化位点、激酶磷酸化结合位点及核定位信号等;甘蔗ATP结合蛋白可能主要定位在细胞核、叶绿体、线粒体和过氧化物酶体中,起中间代谢调控作用,或参与转录调控、免疫应答、胁迫应答及信号转导等生物反应.qPCR检测结果显示,在干旱胁迫7d后,甘蔗ATP结合蛋白基因的表达量明显下调,约为对照的30%,恢复正常供水(复水)后,表达量回升.[结论]甘蔗ATP结合蛋白基因表达受干旱胁迫诱导,可能参与甘蔗对干旱逆境胁迫响应的代谢调控.     

CO2加富条件下胡萝卜光合通路及差异基因表达分析

为了探究CO₂加富条件下胡萝卜光合通路及相关差异基因表达，试验在日光温室中分别设置富碳区(FC,CO₂浓度为(800±50)μmol/mol)和对照区(CK，自然环境)，于收获期测定产量，处理61 d后收集胡萝卜叶片进行转录组测序，并对富碳处理后的差异表达基因进行KEGG注释和代谢途径分析，最后对gene33346、gene33340和gene33386等3个光合相关基因进行实时荧光定量PCR验证。结果表明，CO₂加富条件下总生物学产量、地上部鲜质量和地下部鲜质量均显著高于对照区，且较对照区增产36.56%。转录组结果表明，各样品的Q30碱基百分比均不小于95.24%，说明测量结果较为准确，可用于下一步数据分析；差异表达基因KEGG富集结果表明，光合通路为显著富集的第一条通路，说明CO₂加富对光合产生了显著影响。光合相关基因在富碳条件下上调表达，推测可能是由于其参与了光合过程中的电子传递和ATP的合成；其中gene33346、gene33340和gene33386等3个光合相关基因的相对表达量与其F...     

脂肪酸对小鼠前体脂肪细胞分化中脂代谢基因mRNA表达的影响

采用RT-PCR技术,分别研究短链和长链脂肪酸及P38 MAPK通路抑制剂SB20358对小鼠前体脂肪细胞分化过程中脂代谢相关基因转录表达的影响及其调控机制.结果表明:短链脂肪酸可提高PPARγ2和C/EBPα mRNA表达量(P<0.05),而长链脂肪酸上调PPARγ2、C/EBPα、FAS、SREBP-1c mRNA表达量(P<0.05),但脂肪酸对TGH表达量影响不显著(P>0.05);当P38MAPK抑制剂存在时,PPARγ2、FAS和SREBP-1c mRNA表达量显著下降(P<0.05),而C/EBPα和TGH表达量变化不显著(P>0.05).表明脂肪酸可通过P38MAPK通路促进PPARγ2增量表达从而促进小鼠前体脂肪细胞分化.     

将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)转移到链霉菌染色体整合载体的构建

链霉菌抗生素的生物合成对培养环境中氧的供应相当敏感,为了改善这一溶氧问题,本研究通过将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)克隆到含ФC31int,attP基因的诱导型表达载体pU8600上,构建了可接合转移到链霉菌的整合型表达vgb基因的质粒pHZ1276。pHZ1276通过接合转移导入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans),所得重组子经Southern杂交验证后,进行诱导表达,菌体经破碎后所得蛋白粗提物经Western杂交和CO结合试验表明vgb基因在该菌中表达出了有活性的VHb蛋白。     

转PEPC+PPDK双基因水稻的光合特性

【目的】系统研究ATP处理后转PEPC+PPDK双基因水稻的光合特性,证明ATP是增强转C4基因水稻光合能力的关键因子。【方法】以原种和转PEPC+PPDK双基因水稻为材料,进行了PCR检测,C4光合酶活性的测定。通过ATP处理后,分析了光、温—光合曲线和活性氧代谢有关指标,统计分析了相关的产量构成因素。【结果】原种中虽有全套的C4光合酶,但活性很低。PCR检测出玉米的PEPC和PPDK基因转入普通水稻后,转PEPC+PPDK双基因水稻高表达了C4光合酶活性。在高光和高温条件下,同未施ATP的相比, ATP处理后转PEPC+PPDK双基因水稻光合速率分别提高17%和12%。在光氧化条件下,耐光氧化能力进一步增强,产量提高15%。【结论】ATP处理后,转PEPC+PPDK双基因水稻增强了光合生产力,表明ATP是设计类似C4水稻的关键因子。     

人类免疫缺陷病毒单克隆抗体在小麦胚乳中的表达

为了建立利用小麦生产抗人类免疫缺陷病毒(HIV)单克隆抗体的方法,将植物胚乳特异启动子AsGlo分别与该抗体的重链(HC)和轻链(LC)连接构建小麦表达载体,以基因枪法转入小麦品种扬麦158。转基因T0～T3代PCR鉴定表明,HC和LC在小麦基因组中共整合和稳定遗传。RT-PCR分析表明,IgG重链和轻链基因可在小麦胚乳中正常转录。酶联免疫吸附(ELISA)进一步证实了IgG在小麦胚乳中的积累和抗原结合活性,表明IgG蛋白能够在小麦胚乳中稳定表达,可利用小麦种子生产抗HIV抗体。     

辣椒绿茎突变体gh1转录组及候选基因表达分析

以EMS诱变的辣椒绿茎突变体gh1和紫茎野生型樟树港辣椒(ST–8)为材料，测定茎中花青素含量；采用转录组测序技术(RNA–seq)和实时荧光定量PCR(qRT–PCR)分析与辣椒茎中花青素生物合成相关基因的表达水平。结果表明：突变体gh1茎中的花青素含量极显著低于ST–8茎中的花青素含量；与ST–8相比，gh1共获得1794个差异表达基因，包括1003个上调表达基因，791个下调表达基因；与花青素生物合成途径相关的基因包括9个结构基因(DFR、UF3GT、F3H、ANS、CHI、CHS、C4H、PAL、4CL)和3个转录因子(TT8、AN1、TTG1)；对与花青素合成相关的差异表达基因进行转录组表达量分析和qRT–PCR分析，筛选出4个结构基因(CHS、CHI、DFR、UF3GT)和1个转录因子(AN1)，推测这5个基因可能在辣椒茎中花青素生物合成途径中起重要作用。     

油茶种仁成熟过程油脂合成代谢的转录组分析

以普通油茶品种"闽43"种仁为试验材料,应用转录组测序技术分析油茶种仁成熟阶段中3个发育时期转录组的表达差异,探讨油茶种子油脂代谢的分子机制。转录组测序结果发现,与脂肪酸和甘油三酯代谢相关的4个基因乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶α亚基基因(ACCase α-CT)、β酮脂酰合酶基因(KASⅢ)、长链酰基辅酶A合酶基因2(LACS2)和甘油三磷酸酰基转移酶基因4(GPAT4)随着油茶籽的成熟,表达水平呈上升趋势。4个基因的RT-q PCR的分析结果与转录组数据一致,此外,种仁的含油量的变化趋势与4个基因的表达水平相一致。研究结果表明,4个基因在油茶籽油脂代谢过程中发挥重要作用,有助于油茶籽含油量的增加。     

氧化磷酸化相关基因在大鼠肝再生中表达模式

为在基因转录水平了解氧化磷酸化相关基因在肝再生(liver regeneration,LR)中的作用,通过搜索网站资料和查阅相关论文等方法获得上述基因,用Rat Genome 230 2.0芯片检测它们在大鼠再生肝中表达变化,初步证实上述基因中31个基因与肝再生相关.它们表达的相似性分为均上调、上调占优势、均下调、下调占优势、上调和下调相近等5类,分别涉及9、1、15、4和2个基因,共表达上调42次、下调102次,表明肝再生中表达降低基因多于表达加强基因.它们表达的时间相关性分为12组,表明肝再生中细胞生理生化活动具有阶段性.根据芯片结果推测,肝再生早期和前期氧化磷酸化反应和ATP合成减少,中期和后期增强.其中,31个肝再生相关基因起重要作用.     

谷氨酸棒杆菌信号肽探测载体的构建及强信号肽筛选

强信号肽的使用是提高蛋白分泌效率的关键,筛选强信号肽具有重要的应用价值。本试验以大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌基础穿梭载体pAU2为骨架,以枯草芽孢杆菌的碱性丝氨酸蛋白酶AprE为报告蛋白,分别使用强启动子tac-M和谷氨酸棒杆菌核糖体结合位点一致序列来控制报告基因的转录和翻译,成功构建谷氨酸棒杆菌信号肽探测载体pAU20。分别对来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、以及谷氨酸棒杆菌中共16种Sec型信号肽编码序列进行PCR扩增,与pAU20连接,转化谷氨酸棒状杆菌,获得重组信号肽探测载体工程菌株。工程菌株摇瓶发酵培养物上清液AprE酶活测定结果表明,C. glutamicum/pAU20-Vpr、C. glutamicum/pAU20-BprA上清液比酶活分别为180.02和167.6U/mg蛋白质,均显著高于C.glutamicum/pAU20-cgr2070上清液比酶活(105.09 U/mg蛋白质);C. glutamicum/pAU20-oppA、C. glutamicum/pAU20-Epr、C. glutamicum/pAU20-cgr2063和C.glutamicum/pAU20-ywaD上清液比酶活分别为96.68、86.18、82.52和80.56U/mg蛋白质,均稍低于C. glutamicum/pAU20-cgr2070上清液比酶活。这些结果表明,信号肽Vpr、BprA、cgr2070、oppA、Epr、cgr2063和ywaD都属于谷氨酸棒杆菌强信号肽。     

乳酸乳球菌抗氧化的研究进展

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)主要是通过发酵产能的,但是有研究发现,在添加氯化高铁血红素后乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)能形成一条呼吸链,在乳酸乳球菌(L.lactis)IL1403中发现了能够编码呼吸链蛋白的基因,同样的现象在粪链球菌中(Strepto coccus feacalis)也有发现。当氧出现在电子传递链中,质子的排出和质子运动势(PMF)的产生都会加倍。相比较其他的兼性或者专性厌氧菌,乳酸乳球菌(L.lactis)的呼吸作用可以促进代谢能量的产生,由于这种呼吸作用,乳酸乳球菌(L.lactis)有更好的生长得率和显著的存活率,这表明在发酵条件下产生的代谢能量不足,从而会限制乳酸乳球菌(L.lactis)的生长。氧在呼吸链中扮演了重要的有益角色,而不是起毒害作用。