卵母细胞扫描电镜和透射电镜样本的制作

[目的]探讨卵母细胞扫描电镜和透射电镜的制作方法,为相关研究提供技术支持。[方法]以猪GV期和体外成熟MⅡ期卵母细胞（抽吸法采集）为研究对象。①扫描电镜样本制备：供试GV期和MⅡ期卵母细胞于PBS（pH值7．4）中清洗后,部分转入0．1％透明质酸酶中,38．5℃孵育15min,微吸管吹打去除卵丘细胞（CC）,即获得无卵丘细胞的卵母细胞,用以观察卵母细胞外透明带（ZP）结构;取去除卵丘细胞的部分卵母细胞,经PBS液洗后,再置于0．5％链霉蛋白酶中,在实体显微镜下观察,待透明带溶解时,小心地将卵母细胞转入PBS中,即获得了无透明带的卵母细胞,用以观察卵母细胞膜表面的微绒毛（Mv）。未去除卵丘细胞的卵母细胞、去除卵丘细胞的卵母细胞及去除透明带的卵母细胞分别经PBS洗2～4次后,于2．5％戊二醛中4℃固定6h,再经PBS清洗3次,每次30min;再于1％锇酸中固定1．5h,然后再经PBS清洗3次,每次30min;之后,用乙醇逐级（30％、50％、70％、90％、100％、100％）脱水,每级20min;样品脱水后,用乙酸异戊脂置换;置换后的样品直接移到样品台上,再放入临界点干燥仪干燥,粘台,IB-5离子溅射仪喷金,置于扫描电子显微镜下观察、拍照。②透射电镜样本制备：供试卵母细胞也经PBS清洗,戊二醛固定,琼脂包埋后锇酸固定,乙醇脱水,步骤基本同上,只是最后用环氧丙烷置换。脱水后的样品于Epon-812树脂和丙酮等体积混合液中渗透4h,再在纯Epon-812中渗透过夜;然后将样品包埋,放入聚合器中聚合（35℃,24h;45℃,24h;60℃,48h）;聚合后的样品在实体显微镜下修块,半薄切片定位,重新包埋,LKB—V超薄切片机切片;超薄切片用醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色,样品自然干燥后在透射电子显微镜下观察、拍照。[结果]电镜下观察到的细胞形态结构完好,超微结构清晰。扫描电镜下,GV期卵母细胞的卯丘细胞紧密包围在卯母细胞外,微绒毛呈致密状垂直于卵膜表面,透明带呈不规则的蜂窝状,有小梁突起。在体外成熟MⅡ期卵母细胞中,卵丘细胞变得松散,卵母细胞表面的微绒毛结构显得更光滑,透明带呈不规则的蜂窝样,但蜂窝状结构增多,且小梁突起更明显。透射电镜下,GV期卵母细胞的卵丘细胞在透明带周围紧密排布,并有大量突起伸人透明带中;卵母细胞微绒毛数量较多、相对较长,且也伸人透明带中;线粒体呈圆形,多为横嵴并清晰,成簇分布于皮质区;脂滴以两种不同形式存在于大部分细胞质内,一种呈均质状,另一种不均质且有透亮条纹,两种形式的脂滴常相邻存在,并以均质脂滴居多。脂滴外包有不连续的滑面内质网;高尔基体发达,由多层扁平囊泡及大小泡组成;在MⅡ期卵母细胞中,卵丘细胞间缝隙连接增大,出现了明显的卵周隙;与培养前卵母细胞相比,微绒毛相对较短、较粗,且从ZP内撤回;线粒体体积增大,仍成簇伴随着脂滴分布;脂滴仍以两种不同形式存在,但以不均质脂滴居多;不均质脂滴呈球状,且上透亮条纹增多,电子密度更高;皮质颗粒位于卵质膜下,呈单层排列。[结论]证实该方法适用于卵母细胞超微结构观察的制样,另外,此法也适用于休积小、数量少、游离细胞的电镜样本制备。     

猪卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化

为研究猪未成熟期(GV期)和体外成熟期(MⅡ期)卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化,随机取新鲜与冷冻-解冻后的GV期和MⅡ期卵母细胞制备电镜标本.GV期和MⅡ卵母细胞分3组进行处理:Ⅰ组为对照组,Ⅱ组为GV期卵母细胞冷冻组,Ⅲ组为MⅡ期卵母细胞冷冻组.结果表明,所用玻璃化冷冻程序更适用于猪GV期卵母细胞的冷冻保存,GV期冷冻组卵母细胞的二乙酸荧光素(FDA)染色存活率、卵裂率均明显高于MⅡ期卵母细胞冷冻组.透射电镜观察结果发现,猪GV期卵母细胞经玻璃化冷冻后,主要表现为部分卵丘-卵母细胞复合体(COC)发生卵丘细胞脱落,透明带破损,卵丘细胞碎裂,卵丘细胞与卵母细胞间的连接受到破坏,卵母细胞微绒毛断裂、消失、数量减少,卵母细胞内脂滴多呈均质状.而MⅡ期卵母细胞冷冻后,皮质颗粒仍呈单层排列于质膜下,仅可见形态不规则的不均质脂滴,其周围常严重空泡化.试验表明,采用适当的冷冻方案,可以获得少量源于冷冻保存的猪GV期卵母细胞的胚胎.而猪MⅡ期卵母细胞冷冻后,经体外受精未见卵裂,脂滴严重空泡化是其最为明显的变化.     

猪卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化

为研究猪未成熟期(GV期)和体外成熟期(MⅡ期)卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化,随机取新鲜与冷冻-解冻后的GV期和MⅡ期卵母细胞制备电镜标本.GV期和MⅡ卵母细胞分3组进行处理:Ⅰ组为对照组,Ⅱ组为GV期卵母细胞冷冻组,Ⅲ组为MⅡ期卵母细胞冷冻组.结果表明,所用玻璃化冷冻程序更适用于猪GV期卵母细胞的冷冻保存,GV期冷冻组卵母细胞的二乙酸荧光素(FDA)染色存活率、卵裂率均明显高于MⅡ期卵母细胞冷冻组.透射电镜观察结果发现,猪GV期卵母细胞经玻璃化冷冻后,主要表现为部分卵丘-卵母细胞复合体(COC)发生卵丘细胞脱落,透明带破损,卵丘细胞碎裂,卵丘细胞与卵母细胞间的连接受到破坏,卵母细胞微绒毛断裂、消失、数量减少,卵母细胞内脂滴多呈均质状.而MⅡ期卵母细胞冷冻后,皮质颗粒仍呈单层排列于质膜下,仅可见形态不规则的不均质脂滴,其周围常严重空泡化.试验表明,采用适当的冷冻方案,可以获得少量源于冷冻保存的猪GV期卵母细胞的胚胎.而猪MⅡ期卵母细胞冷冻后,经体外受精未见卵裂,脂滴严重空泡化是其最为明显的变化.     

牛卵丘－卵母细胞复合体体外成熟前后超微结构

实验用透射电镜技术研究了牛卵立－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）体外成熟前后卵母细胞、卵丘细胞及它们之间联系的结构特征．体外培养前,卵母细胞微绒毛数量较少,有的伸入秀明带中;各种细胞器集中分布于皮质区,形成“细胞器带”;核膜可打褶,核仁致密化．卵母细胞与卵丘细胞间及卵丘细胞之间形成间隙连接;卵丘细胞中线粒体致密、形态多样．成熟培养后．微绒毛增多．卵周隙形成;高尔基复合体消失,脂滴伴随着线粒体内迁．少数线粒体转变为幼稚型,皮质区形成“细胞器游离带’;皮质颗粒开始沿质膜下呈线状排列,但有的仍成团分布;排出第一极体处无微绒毛．中期赤道板附近无细胞器;卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间联系中止;卵丘细胞中线粒体转变为幼稚型．     

牛卵丘－卵母细胞复合体体外成熟前后超微结构

实验用透射电镜技术研究了牛卵立－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）体外成熟前后卵母细胞、卵丘细胞及它们之间联系的结构特征．体外培养前,卵母细胞微绒毛数量较少,有的伸入秀明带中;各种细胞器集中分布于皮质区,形成“细胞器带”;核膜可打褶,核仁致密化．卵母细胞与卵丘细胞间及卵丘细胞之间形成间隙连接;卵丘细胞中线粒体致密、形态多样．成熟培养后．微绒毛增多．卵周隙形成;高尔基复合体消失,脂滴伴随着线粒体内迁．少数线粒体转变为幼稚型,皮质区形成“细胞器游离带’;皮质颗粒开始沿质膜下呈线状排列,但有的仍成团分布;排出第一极体处无微绒毛．中期赤道板附近无细胞器;卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间联系中止;卵丘细胞中线粒体转变为幼稚型．     

马鹿卵母细胞的超微结构研究

目的通过对马鹿卵母细胞的超微结构进行研究,旨在为马鹿繁殖育种的研究提供基础理论依据。方法用FSH对母马鹿进行超数排卵,采用抽吸法和切割法采集卵母细胞,利用透射电镜观察其超微结构。结果在光镜下,马鹿卵母细胞的平均直径为172.958±17.298μm,卵丘细胞厚度为67.750±33.107μm,透明带厚度为13.782±2.516μm。电镜下,卵母细胞外的卵丘细胞紧紧包裹卵母细胞,且与卵母细胞之间有大量细长的微绒毛相联系;卵丘细胞核呈卵圆形,其长径为4.250±0.042μm,短径为2.750±0.071μm;透明带均匀,与卵母细胞结合紧密;在皮质区集中分布大量的多嵴型线粒体、脂滴和空泡,线粒体长径为0.600±0.106μm,短径为0.490±0.117μm;细胞核中颗粒状的核质分布非常均匀。     

OPS玻璃化冷冻对山羊卵母细胞超微结构的影响

对山羊不同发育阶段卵母细胞ＯＰＳ玻璃化冷冻的超微结构损伤进行了电镜观察。结果表明，卵丘细胞除内质网扩张外，未见其他明显的结构损伤；卵母细胞的质膜损伤以ＧＶ期最为严重，其次为培养９ ｈ的，ＩＶＭ 的最轻；ＧＶ期卵几乎看不到微绒毛，而培养９ ｈ和ＩＶＭ卵微绒毛保存较好；ＧＶ期卵母细胞线粒体有的发生了损 伤，主要表现在嵴不清或扩张，培养９ ｈ和ＩＶＭ卵母细胞的线粒体基本上保持了正常的结构；培养９ ｈ卵母细胞的 内质同发生了扩张，ＩＶＭ卵母细胞内质网结构正常。     

小檗碱对玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量及胚胎发育的影响

【目的】探讨小檗碱对玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量及体外受精胚胎发育效果的影响。【方法】体外成熟液和胚胎培养液中添加小檗碱为Ber组,未添加小檗碱为对照组,MII期卵母细胞进行冷冻液处理为冷冻液处理对照组和冷冻液处理+Ber组;采用开放式拉长塑料细管法对卵母细胞玻璃化冷冻与解冻,试验各组别为GV期冷冻组、GV期冷冻+Ber组、MII期冷冻组、MII期冷冻+Ber组。观察卵母细胞体外成熟效果及其体外受精胚胎体外发育效果;观察卵母细胞冷冻化学损伤存活率及其体外受精胚胎发育率;采用尼罗红染色法观察卵母细胞中脂滴含量,观察卵母细胞玻璃化冷冻解冻后存活率及其体外受精胚胎发育率;利用差异染色法和TUNEL法计数囊胚内细胞团和细胞总数以及细胞凋亡数。【结果】Ber组能够极显著促进猪卵母细胞体外成熟,显著降低猪卵母细胞玻璃化冷冻的化学损伤,促进猪卵母细胞冷冻解冻后的细胞存活率,而猪MII期卵母细胞相对于GV期卵母细胞具有很好的冷冻解冻后的存活率;小檗碱能降低猪卵母细胞玻璃化冷冻后的脂滴含量,MⅡ期卵母细胞冷冻前后脂滴含量均低于GV期冷冻前后;小檗碱能够促进猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻解冻后的体外成熟,且有利于猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后早期胚胎的发育,相对于冷冻MII期卵母细胞,冷冻GV期卵母细胞具有更好的体外发育效果;小檗碱能够提高猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后体外发育囊胚内细胞团数与细胞总数,降低其细胞凋亡,有利于提高猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后体外受精胚胎发育至囊胚的质量。而GV期相对MII期则冷冻效果更佳。【结论】小檗碱能够通过降低玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量,从而提高其冷冻解冻后体外成熟率和体外受精胚胎发育质量;GV期玻璃化冷冻卵母细胞相对于MII期,在冷冻解冻后其体外受精胚胎发育质量有更好提高。相关机制还有待今后进一步研究。     

蝶蛹金小蜂卵黄发生前后脂肪体和卵泡的超微结构

用透射电镜观察了蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum卵黄发生前后脂肪体超微结构的变化,同时观察了卵巢中不同发育时期卵泡的超微结构.卵黄发生前(蛹期)的脂肪体细胞含有大量蛋白颗粒和线粒体,但未见粗面内质网,早期蛹脂肪体细胞中可见多囊泡体;卵黄发生期(隐雌成蜂～5日龄雌成蜂)的脂肪体细胞内粗面内质网和线粒体均较为丰富.在新形成的卵泡中,卵母细胞内尚无卵黄蛋白沉积,但脂滴较多;在Ⅰ级和Ⅱ级卵泡中,卵母细胞中沉积有较多的卵黄体和脂滴,且Ⅱ级卵泡中的卵黄体明显大于Ⅰ级卵泡;Ⅲ级卵泡中,卵母细胞内充满卵黄体和脂滴,并已形成卵壳.     

中华绒螯蟹卵黄发生的超微结构研究

对中华绒螯蟹卵母细胞卵黄发生全过程进行了电镜观察，结果表明：卵黄发生前期的卵母细胞为小生长期初级卵母细胞，细胞质嗜碱性、无卵黄颗粒，与卵原细胞相比，内质网等细胞组分数量明显增多；卵黄发生期的卵母细胞为大生长期初级卵母细胞，细胞质中出现指滴和大量卵黄颗粒，高尔基复合体、内质网、核糖体和溶酶体等细胞器均参与卵黄合成，细胞核呈生发泡状，细胞表面形成微绒毛，卵周隙中出现致密颗粒物质，但未被卵母细胞吸收；卵     

中华绒螯蟹卵黄发生的超微结构研究

对中华绒螯蟹卵母细胞卵黄发生全过程进行了电镜观察，结果表明：卵黄发生前期的卵母细胞为小生长期初级卵母细胞，细胞质嗜碱性、无卵黄颗粒，与卵原细胞相比，内质网等细胞组分数量明显增多；卵黄发生期的卵母细胞为大生长期初级卵母细胞，细胞质中出现指滴和大量卵黄颗粒，高尔基复合体、内质网、核糖体和溶酶体等细胞器均参与卵黄合成，细胞核呈生发泡状，细胞表面形成微绒毛，卵周隙中出现致密颗粒物质，但未被卵母细胞吸收；卵     

猪卵巢内卵母细胞发育的超微结构研究

本研究根据卵泡内颗粒细胞的形态、数量和卵泡腔的有无,把东北民猪、哈尔滨白猪卵巢内的卵母细胞划分成五个发育阶段:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(包括Ⅲ_1、Ⅲ_2)、Ⅳ、Ⅴ。电镜观察发现:第Ⅱ阶段卵母细胞质膜开始产生少量、短的微绒毛。继后,微绒毛长大,密度增加。透明带于第Ⅲ阶段的卵母细胞开始形成。两品种猪的卵母细胞中均有皮质颗粒(CGs)存在。最初,CGs 由第Ⅱ阶段卵母细胞近核区的高尔基复合体(Go)分泌面产生。此时,CGs 呈浓缩小泡和多泡小体中暗色颗粒的形式存在。其后,它们和 Go、线粒体(Mi)等逐步迁移到细胞质的皮质区。CGs 大多呈球形。根据它们的电子致密度可分为暗粒和明粒。CGs 的直径和数量随着卵母细胞体积而变化。在各发育阶段的卵母细胞中,CGs 平均数量和卵母细胞平均直径增长之间呈非常显著的强相关(P<0.01)。当卵母细胞将排卵时,CGs 达到最大数量。两品种猪之间,在 CGs 发生、大小、形态、数量和分布上均无明显差异。第Ⅲ_1阶段卵母细胞中有环层板产生。从第Ⅰ到第Ⅳ阶段的卵母细胞中,我们都发现了占优势的 Go,它们由小泡集团和膜性囊组成。当卵母细胞制造营养物质的时候,Mi、Go 和粗面内质网(RER)出现一个数量上的增加。并屡见 Mi 和 RER、Go 和 RER 相互连接的情况。这反映了它们的机能关系。第Ⅴ阶段的卵母细胞中,Go 几乎全部消失,RER 显著减少,Mi 一律变圆变小。但是,脂滴比第Ⅲ、Ⅳ阶段卵母细胞中的脂滴更大、更多。此时,脂滴约占胞质的2/5;脂滴的大量积聚是猪卵母细胞的特征之一。在卵周隙中有第一极体。根据超微结构的形态学所见,我们认为第Ⅴ阶段的猪卵母细胞质和质膜已经最终成熟。显然,这与排卵后还需在输卵管内进一步成熟的家兔、小鼠卵母细胞大不相同。     

神经生长因子对猪卵丘细胞扩散及卵母细胞体外成熟的影响

利用光学显微镜观察及地衣红染色方法,探究猪卵母细胞体外成熟过程中添加神经生长因子(NGF对猪卵丘细胞扩散和卵母细胞成熟的影响.结果表明:在猪卵母细胞体外成熟过程中添加NGF对猪卵丘细胞扩散无明显影响;单纯添加NGF并不能显著改变第二次减数分裂中期(MⅡ期)卵母细胞的比率,但却可以显著提高生发泡期(GV期)卵母细胞比率.当NGF与促性腺激素(eCG和hCG)联合作用时,MⅡ期卵母细胞比率相对于单纯地促性腺激素作用有显著提高.     

东北梅花鹿卵泡发育过程中卵泡细胞超微结构的观察

为了进一步弄清东北梅花鹿卵泡细胞超微结构的变化规律,本研究用透射电镜、目镜测微尺和显微照相技术对各期卵泡中卵泡细胞的超微结构进行了观察,并按卵泡大小、颗粒细胞层数、透明带状况及卵泡腔是否出现,把卵泡分成4个阶段。结果表明：原始卵泡-卵泡细胞与卵母细胞已开始建立结构上的联系,卵泡细胞的形态变化也是适应卵泡发育的需要;初级卵泡-细胞器数量增加,结构变得清晰,卵泡细胞中出现厚壁小泡,可能是一种早期的脂滴;次级卵泡-卵泡突起穿过透明带,并出现有营养作用的脂滴和支持作用的微丝;三级卵泡-高尔基复合体发达,多与粗面内质网相贴,核糖体丰富,成簇分布,接近排卵的卵泡中卵泡细胞发生扩展等一系列结构上的变化将利于受精。     

鲫鱼卵子发生──Ⅱ一些细胞器的变化和放射带的形成

在卵原细胞和早期的Ⅰ期卵母细胞中，没有内质网和线粒体．在Ⅱ期和Ⅲ期的卵母细胞中，线粒体和内质网逐渐增多，线粒体常被一层粗面内质网包绕着．在成熟卵子中，线粒体和内质网多分散在卵皮质部分．线粒体有多种形态结构．高尔基复合体经历了从少到多，再到少的变化过程．另外，鲫鱼的卵母细胞中还有丰富的环形片层．放射带是由卵母细胞和滤泡细胞伸出突起并向其中分泌物质而形成．     

小檗碱对猪卵巢卵母细胞体外成熟及其脂滴含量和分布的影响

[目的]探明不同形态的猪卵巢中卵母细胞体外成熟效果与脂滴的相关性,以及小檗碱对其的影响.[方法]将卵泡型卵巢GV期和黄体型卵巢GV期卵母细胞分别用添加小檗碱的成熟液体外成熟,观察体外成熟效果;用尼罗红染色的方法测定成熟前后的卵母细胞的脂滴含量,并观察成熟后各组卵母细胞脂滴的分布.[结果]卵泡型卵母细胞的颗粒细胞扩散率和第一极体排出率均显著高于黄体型卵母细胞(P＜0.05),小檗碱(Berberine,Ber)组卵母细胞的颗粒细胞扩散率显著高于对照组(P＜0.05),第一极体排出率极显著高于对照组(P＜0.01);体外成熟后,对照组卵母细胞中脂滴含量显著降低(P＜0.05),小檗碱组极显著降低(P＜0.01),且极显著低于对照组(P＜0.01).黄体型卵母细胞的脂滴含量则显著低于卵泡型(P＜0.05).猪卵母细胞成熟后的脂滴分布为分散型、外围型和不规则型,卵泡型卵母细胞脂滴主要呈分散分布,黄体型卵母细胞脂滴主要呈外围分布,并且黄体型卵母细胞脂滴呈不规则分布多于卵泡型.[结论]小檗碱能明显促进猪卵母细胞体外成熟,且卵泡型成熟效果显著好于黄体型;体外成熟后,卵母细胞脂滴逐渐减少,小檗碱组脂滴含量极显著减少,且黄体型卵母细胞脂滴含量明显减少;猪卵母细胞内脂滴的分布与卵巢所处的时期有关.     

牛卵母细胞发育的超微结构研究

本实验根据卵细胞的数量及分布、透明带的变化,卵泡大小等把牛卵母细胞的整个发育过程分为六个阶段,在超微结构的水平上进行了研究。随着卵母细胞的发育,高尔基体、线粒体、滑面内质网、皮质颗粒等细胞器数量不断增加,且逐渐迁移到皮质区。卵母细胞成熟时。高尔基体及粗面内质网消失,皮质颗粒开始在质膜下呈线状排列,而线粒体又向胞质中央区扩散。直径2毫米以上卵泡卵母细胞中,少嵴圆形线粒体一律转变为带帽线粒体,核仁发生致密化。此外,牛卵母细胞中有带有界膜的、均匀分布的囊泡。皮质颗粒成团发生和分布也是牛卵母细胞的特点之一。实验事实证明,皮质颗粒的形成与滑面内质网关系更为密切。     

猪卵丘扩展与卵母细胞核成熟关系的研究

 以猪卵丘卵母细胞复合体（COC）为实验对象研究了猪卵丘扩展与卵母细胞核成熟之间的关系,结果表明,（1）全程培养均暴露于激素环境中不利于卵丘的扩展;（2）卵丘扩展良好与卵丘扩展不好的卵母细胞核成熟比例无统计学差异（P>005）;（3）去除卵母细胞的COC培养后,卵丘细胞仍然能发生扩展;（4）培养24h后去掉COC的卵丘细胞不仅不影响卵母细胞的核成熟,而且极体完整的卵母细胞数目还显著增多（P<0.01）;但去颗粒细胞组卵母细胞的质膜不如对照组光滑;（5）带有壁颗粒细胞（mural granulosa cell,MGC）的COC扩展情况明显优于不带MGC的,其中含有极体的成熟卵数也显著高于后者（P<0.01）。     

香螺卵母细胞营养方式的研究

利用电子显微镜观察香螺卵子的发生情况,在香螺卵子发生过程中,靠近卵母细胞的滤泡细胞生命非常旺盛.滤泡细胞的内质网非常发达,呈环状,中心有脂滴产生.滤泡细胞和卵母细胞之间的膜有小泡产生.卵母细胞内部的内质网不发达;线粒体的嵴退化,内部有脂滴产生,因此推断香螺卵母细胞的营养方式为自体合成和异体合成两种.     

贻贝卵巢超微结构的研究

１９９７年作者利用透射电镜研究了贻贝卵巢的超微结构,发现卵原细胞,初级卵母细胞和卵黄发生前卵母细胞的超微结构相似,均由一个大而圆或多边形的核,粗面内质网,球形线粒体及丰富的游离核糖体等构成。但随着卵黄发生,细胞的体积越来越大。卵母细胞表面开始出现微绒毛,它是卵膜的一部分及卵将成熟的标志。卵黄的形成是双源的,但以外源为主。