检测鼻气管鸟疫杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立

利用DNAStar对GenBank上发布的鼻气管鸟杆菌(ORT)16S rRNA基因进行序列分析,根据分析结果选择其保守区域设计1对特异性的引物。扩增16SRNA部分保守基因序列并将其克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,经鉴定、纯化后作为阳性标准品,用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线的建立。反应条件反复优化后,成功建立了检测ORT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法对ORT的最低检测量约为100拷贝数/μL,比普通PCR高100倍;与引起禽类呼吸系统疾病的其他病原体之间无交叉反应;批内和批间试验的变异系数均小于0.63%,充分显示该方法具有良好的重复性和稳定性。对46份临床样本进行ORT检测,该方法检测的阳性样本为38份,检出率为82.26%。在38份阳性样品中,普通PCR只检出30份阳性样品,常规细菌培养只检出23份阳性样品。结果表明:本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法比其他方法更敏感,为临床上快速准确的检测、诊断禽类ORT的感染提供了敏感可靠的检测方法。     

猪丹毒杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感的检测猪丹毒杆菌方法,本研究根据猪丹毒杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,并优化反应条件,建立了检测猪丹毒杆菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明:以重组质粒为标准品建立的标准曲线在7.66×108拷贝/μL~7.66×10拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;最低可以检测到7.66×10拷贝/μL的标准品阳性质粒;该方法与其他22种常见细菌均无交叉反应;批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的方法和细菌分离鉴定方法分别对36份临床样品进行检测,阳性率分别为19.44%和11.11%,两者符合率为91.67%。本研究建立的方法可用于猪丹毒杆菌感染的早期诊断、临床样品的高通量快速诊断检测以及猪丹毒杆菌定量分析。