鹅细小病毒H1株VP2基因的克隆和序列分析

参考GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法对国内鹅细小病毒分离株H1(GPV-H1)株的结构蛋白VP2基因进行扩增，将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。结果表明：H1株VP2的核苷酸序列全长1764bp，编码587个氨基酸，与GenBarrk发表的GPV-B株、GPV-SHM株、GPV-YG株、番鸭细小病毒(MDPV)FRANCE株、FM株的VP2相比，核苷酸同源率分别为98．6％、96．2％、93．2％、80．3％、80．0％，推导氨基酸序列同源率分别为98．3％、97．5％、96．1％、88．2％、87．4％。     

华南地区小鹅瘟和番鸭"三周病"分离野毒株部分VP基因的序列差异分析

为了研究华南地区小鹅瘟病毒(GPV)和番鸭"三周病"病毒(MDPV)分离野毒株部分VP基因的序列差异情况,试验从华南地区分离到疑似5株小鹅瘟病毒和2株番鸭"三周病"病毒野毒,并分析其变异情况.结果表明:华南地区小鹅瘟病毒分离野毒株的VP基因均与小鹅瘟病毒具有较近的亲缘关系,说明VP基因可能和致病性有关;番鸭"三周病"病毒分离野毒株的VP基因与小鹅瘟病毒的相似性相对较低,但均与GenBank注册登陆的小鹅瘟病毒处于同一较大分支上.     

2020年广东肇庆地区鹅细小病毒VP1基因遗传进化分析

2019～2020年从广东肇庆地区的部份鹅场中收集到12份疑似小鹅瘟病例,对疑似小鹅瘟病例进行病原核酸鉴定,对阳性病例进行病毒分离和VP1基因的序列扩增和遗传进化分析.结果表明,12份疑似小鹅瘟病例中,共检测到7份阳性样品,阳性检测率为58.3％.从阳性病例样本中分离获得7株小鹅瘟病毒毒株,其中1株与Ⅰa亚群毒株核苷酸...     

鸡传染性法氏囊病病毒流行株VP1部分序列及VP2高变区序列分析

为了对鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的13个地方分离株与3个商品疫苗株的VP1-b基因(756 bp～1 522 bp)进行同源性和遗传进化分析,本研究对其进行RT-PCR扩增和序列测定.结果表明,获得的VP1-b基因长度均为767 bp; 13个分离株VP1-b节段核苷酸和氨基酸同源性分别为90.7 ％～100％和72.9％～100％,其中10株超强毒分离株与经典株、弱毒株、疫苗株的同源性较高,核苷酸和氨基酸同源性分别为95.7％～100％和94.5％～100％,所有12个超强毒分离株与超强毒参考病毒株的同源性均较低,核苷酸同源性仅为68.2％～79.2％;在遗传进化分析中,所有病毒株被分为3个分支,与相应病毒株的基于IBDV-VP2高变区(vVP2)序列的遗传进化树比较并结合同源性分析结果表明,除了弱毒株HUN0804之外,其它12个分离株可能均为重组病毒.据此推测,基因重组可能是目前IBDV流行的新趋势.     

番鸭细小病毒XX株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株和GD株基因序列,应用DNAstar分子生物学软件设计1对引物,应用PCR技术扩增MDPV XX株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到PGEM-T easy载体上,经菌液PCR鉴定后的重组子进行序列测定。结果表明,MDPV XX株基因大小为1764bp,编码587个氨基酸,其基因序列与国内外发表的FM株、GD株核苷酸序列同源性分别为98.4%和99.8%,而与同属的小鹅瘟病毒B株核苷酸同源性仅为78.2%。可见编码番鸭细小病毒结构蛋白的VP2基因较保守,且和同属的小鹅瘟病毒明显不同,这也是该病毒目前只有一个血清型的分子基础。     

5株鹅细小病毒分离鉴定及VP3基因遗传进化分析

从江苏省各市鹅场死亡的、具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾、肠病料组织中分离到5株病毒分离物。经过实验鉴定,该5株病毒分离能与小鹅瘟阳性血清发生沉淀反应,并均能使用针对小鹅瘟病毒VP3基因特异性引物扩增出与目的条带大小一致的DNA片段。将PCR产物纯化、连接、转化、TA克隆等一系列实验后将获得阳性重组质粒送测序。另外,为了探究该病毒的遗传进化方向,本研究同时对鹅细小病毒VP3基因进行了系统进化分析。     

5株鹅细小病毒分离鉴定及VP3基因遗传进化分析

从江苏省各市鹅场死亡的、具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾、肠病料组织中分离到5株病毒分离物。经过实验室鉴定,该5株病毒分离能与小鹅瘟阳性血清发生沉淀反应,并均能使用针对小鹅瘟病毒VP3基因特异性引物扩增出与目的条带大小一致的DNA片段。将PCR产物纯化、连接、转化、TA克隆等一系列实验后将获得阳性重组质粒送测序。另外,为了探究该病毒的遗传进化方向,本研究同时对鹅细小病毒VP3基因进行了系统进化分析。     

江苏省盐城市3株白羽肉鸭源鹅细小病毒的分离鉴定及其VP3基因遗传进化分析

为分离鉴定导致2017年江苏省盐城市樱桃谷鸭出现短喙、长舌、生长抑制以及死淘率迅速增加的病原,研究其基因遗传进化特点,探讨临床解决方案,用PCR方法,对这一地区3家养鸭场的发病鸭进行检测;对鹅细小病毒阳性样品进行病毒分离,并对其VP3基因进行扩增测序和遗传进化分析。结果显示:从发病鸭中分离到3株可引起鸭短喙与矮小综合征的病毒,分别命名为YC1、SQ1、SQ2;3株病毒VP3基因与我国樱桃谷鸭发生的鸭源鹅细小病毒核苷酸同源性在99%以上,与番鸭中分离的短喙与矮小综合征病毒核苷酸同源性为95%～99%,与经典小鹅瘟核苷酸同源性也在95%以上。结果表明,这3家养鸭场暴发的短喙与矮小综合征均由新型鹅细小病毒感染所导致。该毒株与欧洲分离株的亲缘关系更近,提示这3株病毒可能通过引种传入我国,或者由欧洲分离株进化而来。     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.     

番鸭细小病毒安徽分离株结构蛋白基因的克隆及序列分析

为研究番鸭细小病毒(MDPV)安徽分离株的遗传变异特征,通过PCR扩增获得了MDPV结构蛋白(VP)基因全长序列AH-MDPV-VP,并将该序列与GenBank中登录的12条MDPV和鹅细小病毒(GPV)VP基因序列进行比对。结果显示,AH-MDPV-VP基因全长2 199bp,包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白编码区。MDPV与GPV的VP基因部分序列一致,但具有明显的差异。进化分析显示,MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH为同一分支,亲缘关系较近。同源性分析显示二者核苷酸序列同源性最高,为99.9%,且AH-MDPV-VP与GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分离株与其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趋势,而与GPV则相反呈上升趋势。进一步显示MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH相似,可能为MDPV和GPV基因重组型水禽细小病毒。     

鹅细小病毒广西株的分离鉴定

将广西某养鹅场5日龄发病的雏鹅肝脾处理后接种于10日龄的鹅胚,分离到一株病毒,对死胚收集的尿囊液进行荧光PCR确诊后,对其VP3基因进行扩增测序,通过与GDFSH株(Guangdong)、82-0308株(Taiwan)、HLJ01株(Heilongjiang)和HBZF07株(Hebei)VP3基因序列分析,核苷酸序列同源性在96.2%以上,从分子水平上鉴定该分离株是鹅细小病毒.     

鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术及RACE方法扩增得到鸭肝炎病毒(DHV)浙江分离株Z10的全基因(5',3'末端序列用RACE法扩增)及4株DHV分离株的VP1基因.结果表明,分离株Z10的全基因片段长7689 bp,有1个大的开放读码框(ORF),ORF位于626～7326位核苷酸,编码2249个氨基酸.Z10分离株全基因序列与GenBank登录的6株具有代表性的DHV核苷酸序列比对,同源性94.5%～98.4%;所测得的DHV分离株的VP1基因的序列与目前GenBank上发表的具有代表性的DHv-Ⅰ VP1基因进行比对分析,结果4株Ⅰ型DHV的VP1基因cDNA长度均为714 bp,编码238个氨基酸.4株DHV-Ⅰ之间VP1基因的核苷酸序列同源性为93%～99.7%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;与参考毒株VP1基因的核苷酸序列同源性为92.2%～100%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,属于同一基因群.     

鸡传染性囊病病毒青岛分离株VP2基因的克隆及序列分析

为了克隆传染性囊病病毒青岛分离株(IBDV-QD)的VP2 基因及对其高变区序列进行分析,首先根据GenBank上已经发表的传染性囊病病毒(IBDV)UK661株的核苷酸序列,设计并合成了一对特异性的扩增IBDV-QD VP2 基因的引物.以IBDV-QD株基因组为模版,利用RT-PCR技术扩增出长约1.5 kb的基因片段,将其连接到pGEM-T-Easy载体上.经酶切分析、PCR鉴定及核苷酸序列测定,成功获得该分离株VP2基因的重组质粒.将IBDV-QD株VP2基因的高变区核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank中公布的14株IBDV相应序列应用软件进行同源性比较,并构建系统进化树.同源性比较和进化树分析表明,IBDV-QD与IBDV超强毒株(vvIBDV)关系最近,与标准强毒株、弱毒株、变异株相差较远;并且我国不同地区的vvIBDV存在差异,这为我国传染性囊病的流行病学调查奠定了基础.     

兔出血症病毒ZB分离株VP60基因克隆、截短表达与活性鉴定

为分析兔出血症病毒地方分离株的变异情况,并获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了克隆、序列分析与原核表达.ZB株分离病毒与GenBank中的6株RHDV VP60基因的核苷酸序列同源性在92.5％～97.9％之间,参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增了876 bp的VP60基因片段.将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,重组蛋白纯化后,Western blot检测表明具有良好的抗原性与特异性.     

禽脑脊髓炎病毒VR株衣壳蛋白基因的克隆及序列分析

用冻存的禽脑脊髓炎病毒Van Roekel(AEV VR)株通过SPF鸡胚传代复壮，获得了试验用病毒株样本。根据已知禽脑脊髓炎病毒1143(AEV 1143)株的衣壳蛋白VP0、VP3、VPl基因序列，设计了3对引物，分别扩增AEV VR株的VP0、VP3、VP1基因，将RT-PCR产物进行分子克隆和序列分析。结果表明，AEVVR株与AEV1143株VP0、VP3、VP1基因的核苷酸同源性分别为95．1％、93．6％和93．9％；氨基酸的同源性分别为97．57／6、97．5％和99．6％。     

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的番鸭细小病毒 (MPV) FM株基因组核苷酸序列 ,设计了 1对引物 ,分别对国内 2株番鸭细小病毒分离株 MPV扬州 (YZ)株和 MPV佛山 (FS)株主要结构蛋白 (VP2和 VP3)基因进行 PCR扩增 ,并克隆到p CR3.1T载体 ,经酶切鉴定筛选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较。结果表明 ,MPV YZ和 MPV FS的VP2 - VP3基因大小均为 176 4bp,编码 5 88个氨基酸。 MPV YZ、MPV FS与 MPV FM核苷酸序列同源性分别为98.5 %和 98.6 % ,氨基酸序列同源性为 97.1%和 97.8% ;MPV YZ与 MPV FS核苷酸序列的同源性为 99.5 % ,氨基酸序列同源性为 98.8%。     

猫细小病毒的分离与鉴定

为丰富猫细小病毒(FPV)流行病学资料和制备灭活疫苗,通过猫肾传代细胞(F81)培养方法从疑似感染FPV病猫粪便中分离病毒.对分离到的病毒进行理化性质分析和FPV特异性检测引物PCR鉴定,然后对FPV的VP2基因进行扩增测序.理化性质分析结果与FPV特性均相符,VP2基因测序结果与GenBank已发表的FPV标准株VP2基因序列对比分析,核苷酸序列同源性达到99.0％,证明该分离毒株为猫细小病毒.该毒株的成功分离进一步充实了我国FPV病毒库,也为灭活疫苗的制备奠定了基础.     

番鸭细小病毒和鹅细小病毒广东株VP1基因的克隆与序列分析

参考GenBank中的MDPV FM株和GPV B株全基因序列,设计并合成一对引物,分别对MDPV GD株和GPV GD株的结构蛋白基因(VP1)进行PCR扩增,并克隆到pMD18-T载体,筛选到重组质粒并测序.通过对MDPV GD株和GPVGD株的VP1基因的核苷酸序列分析,这两种病毒VP1基因大小均为2 199 bp,核苷酸序列同源性为87%,而位于VP1基因上的VP2至VP3基因起始密码子之间的核苷酸序列的差异较大,同源性仅为64%.另外对MDPV GD株和GPV GD株与各地方毒株的VP1和VP3基因核苷酸序列的同源性比较,显示它们之间差异较小.     

小鹅瘟病毒山东株的分离鉴定及VP3基因序列分析

从山东某患病鹅群中分离到一株病毒。根据小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因全序列,设计了一对特异性引物,提取病毒DNA进行PCR反应,成功扩增出372 bp的特异条带。将PCR产物纯化后,与pMD18-T载体连接,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10,经Amp和蓝白斑筛选和PCR鉴定后,对阳性克隆进行测序。测序结果表明该小鹅瘟病毒毒株的VP3基因片段与GenBank已公布的GPV相应序列的同源性在94.1%~98.4%之间。     

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析术

摘 根据国外已发表的番鸭细小病毒（MDPV）FM株基因组核苷酸序列设计1对引物，应用PCK技术扩增MDPVFS株的VP2-VP3蛋白基因片段。将扩增后的VP2-VP3结构蛋白基因克隆到T载体上，MDPVFS株基因大小为1764bp，编码528个氨基酸，对插入片段进行序列测定。结果表明，我国分离的MDPVFS株基因序列与国外发表序列的同源性为98．6％，与已发表的YZ株同源性为99．5％，可见番鸭细小病毒结构蛋白基因较保守。