牛源停乳链球菌研究进展

停乳链球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，由其引发的奶牛乳房炎占总发病率的10%～50%。由于该菌具有传染性病原体和环境性病原体的双重特性，因此，该菌在奶牛乳房炎感染和传播过程中扮演着重要角色。牛源停乳链球菌的检测技术包括传统的生化鉴定和分子生物学技术，分子生物学技术包括PCR技术、16S rRNA基因序列测序、基因芯片、环介导恒温扩增法等，不同的检测方法均有其优缺点。牛源停乳链球菌致病性及致病机制与毒力基因相关，如黏附性基因、酶相关基因、生物膜相关基因等。停乳链球菌对常见的抗菌药耐药严重，且出现多重耐药性，耐药机制主要是停乳链球菌携带耐药基因所致。停乳链球菌疫苗有灭活疫苗、重组亚单位疫苗、蛋白疫苗等，但仍处于研究阶段。本文对牛源停乳链球菌分离鉴定技术、致病性及致病机制、耐药性及耐药机制、疫苗研发等方面进行综述，以期为防控停乳链球菌引起的乳房炎提供指导。     

貂源停乳链球菌似马亚种的分离鉴定

为了研究引起水貂肺炎死亡的病因,对送检的病死水貂进行剖检。从病死水貂病料中分离出了一株革兰阳性球菌,对其进行菌落形态观察、生化鉴定以及16S rDNA序列分析,构建系统进化树并进行同源性分析,同时对该菌株进行药敏试验。结果表明：根据分离菌的形态特征、生物化学特性,结合16S rDNA序列测定与进化树分析,将其鉴定为链球菌属的停乳链球菌似马亚种。药敏试验结果显示,该菌株对青霉素、阿莫西林、莫西沙星等药物敏感,但对四环素有较强的耐药性。     

猪源停乳链球菌类马亚种的分离与鉴定

从江西省吉安市某规模化养猪场发病仔猪关节液中分离得到1株革兰阳性链球菌,对其进行菌落形态观察、生化鉴定以及16S rRNA序列分子测序鉴定,并构建系统发育树;对分离菌进行药敏试验和健康小鼠的人工感染试验。结果根据分离菌的形态特征、理化特性,结合16S rRNA序列测定与系统发育分析结果,判定为链球菌属的停乳链球菌类马亚种(Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis),并命名为JXJASD-1株。抗生素药物敏感试验结果表明,分离菌株对阿莫西林、头孢拉定、利福平表现较高的敏感性,对强力霉素、青霉素G中度敏感,而对庆大霉素、卡那霉素、四环素、红霉素、复方新诺明、磺胺异噁唑表现出耐药性;致病性试验结果表明,分离菌株对小鼠有强致病性。本结果将对江西省仔猪停乳链球菌类马亚种病的防治提供指导。     

东北民猪源停乳链球菌的分离鉴定与药敏试验

为分离东北民猪源停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)并鉴定其生物学特性,从齐齐哈尔市某东北民猪场死亡仔猪的肝脏及其关节液样品中分离病原菌,通过生理生化试验和分子生物学试验鉴定分离菌,研究了分离菌的致病性和药物敏感性。结果表明,分离到革兰阳性球菌1株,生化指标与停乳链球菌停乳亚种相符。系统进化树分析表明,分离菌株与停乳链球菌停乳亚种参考菌株的同源性为97%~98%,其中与AB537921.1(Japan)同源性最高,达到98.99%,进一步从分子水平鉴定该菌为停乳链球菌停乳亚种。以0.2mL/只(3.2×10^9CFU/mL)接种量感染小鼠,发病率和病死率均为100%。分离菌对多黏菌素B、阿莫西林、氨苄西林、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、氟苯尼考、林可霉素、新霉素均敏感,仅对罗红霉素耐药。     

停乳链球菌内蒙分离株抗原基因MIG的克隆

停乳链球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌,根据GenBank中登陆的停乳链球菌表面蛋白MIG基因序列,设计一对引物,采用PCR的方法从临床分离的停乳链球菌内蒙分离株基因组DNA中扩增出MIG基因,得到一条1900bp的片段。将其连入PMD-19T载体中,经酶切,PCR及序列测定法进行鉴定。经DNA测序分析,证实与GenBank中停乳链球菌MIG基因(AF354651)序列同源性为95%,具有高度保守性。     

牛源停乳链球菌荚膜多糖提取及纯化方法研究

为建立最佳的牛源停乳链球菌荚膜多糖提取和纯化方法,用停乳链球菌地方菌株,开展了细菌生长过程中菌液浓度与荚膜多糖得率、发酵液pH值对荚膜多糖得率、不同浓度乙醇沉淀核酸及多糖的效果、温度和时间对荚膜多糖得率、冷酚抽提次数对荚膜多糖得率和蛋白含量的影响等一系列实验,同时对制备的3批荚膜多糖进行了各项指标的检测。结果表明,牛源停乳链球菌在p H值为7.0的发酵培养液中培养8 h时荚膜多糖得率最高,最佳的去核酸乙醇浓度为25%,最佳沉淀多糖的乙醇浓度为80%,最佳温度和时间为4℃作用24 h。制备的3批荚膜多糖,其荚膜多糖回收率均在85%以上,蛋白质与核酸含量均低于1%,唾液酸含量在12.5%～14.3%间。说明建立的牛源停乳链球菌荚膜多糖提取纯化方法纯化荚膜多糖得率和纯度均比较高,符合疫苗生产要求。     

牛源性停乳链球菌最佳培养基的筛选及影响因素研究

为了提高奶牛乳房炎多联苗的免疫效果,对停乳链球菌进行了最佳培养基的筛选及生长过程中影响因素的研究。结果表明,停乳链球菌在改良肉汤中生长缓慢,不适宜其生长,但在优化培养基和THB培养基中长势良好,尤其是在优化培养基中,停乳链球菌生长延迟期大大缩短,培养4 h即进入对数生长期,约12 h达到生长高峰期,生长周期比改良肉汤缩短近约50%,比THB缩短约2 h,且生长高峰期的细菌数量比THB和改良肉汤亦明显提高。培养过程中影响因素试验结果表明,溶氧量对停乳链球菌生长无影响;在优化培养基中,葡萄糖较适宜的浓度为10 g/L;在对数生长期内补加NaOH调节pH值,能明显提高细菌的产量,并能延长其对数生长期。     

梅花鹿大肠杆菌和链球菌混合感染的病例

2010年7月,山东省胶南一鹿场鹿群突然发病,出现以精神不好、排稀便、体温升高、站立不稳等为主要特征的传染病,有3只（1公2母）膘情较好的鹿死亡。发病当天死亡1只,第2d死亡2只,经过及时确诊并积极治疗,鹿场病情得到及时控制,再没有发生死亡并于1周后全部康复。本病通过临床症状、剖检、实验室诊断等,最后确诊为大肠杆菌和链球菌混合感染。     

无乳链球菌体外感染奶牛乳腺上皮细胞

用分离到的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,GBS)及标准菌株侵袭原代奶牛乳腺上皮细胞建立体外感染细胞模型,并进行细胞凋亡检测。同时,采用qRT-PCR方法检测细胞受到侵袭后白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等细胞炎性因子mRNA的转录水平。结果显示,标准菌株组(WL组)与空白组相比凋亡率差异极显著(P<0.01),分离菌株组(FL组)与空白组相比凋亡率差异极显著(P<0.01),分离菌株组与其标准菌株组的凋亡率差异也极显著(P<0.01)。qRT-PCR结果分析显示,标准株组TNF-α、IL-6及IL-8 mRNA转录水平与对照组相比,差异极显著(P<0.01);而分离菌株组TNF-αmRNA转录水平与对照组相比差异显著(P<0.05),IL-6及IL-8 mRNA转录水平差异不显著(P>0.05)。结果表明,与标准菌株相比,无乳链球菌分离株对奶牛乳腺上皮细胞侵袭和损伤能力较低,乳腺细胞的凋亡率也较低,当奶牛乳腺上皮细胞受到细菌侵袭的时候,细胞中IL-6、IL-8及TNF-α等炎性因子mRNA的转录水平都显著性提高,但在相同浓度下GBS标准株诱导细胞炎性因子的表达量显著高于GBS分离株。本试验结果为以后预防和控制GBS引起的隐性乳房炎提供试验依据。     

抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌的杀菌作用研究

为探究真菌防御素Plectasin衍生肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌的体外杀菌效果及其作用机制,本试验采用微量肉汤稀释法检测停乳链球菌CVCC 3938耐药性,通过NZ2114对停乳链球菌CVCC 3938最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）及在胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth,TSB）培养基和全脂灭菌（ultra-high temperature instantaneous sterilization,UHT）牛奶中的杀菌动力学曲线的测定评价其抗菌特性;借助扫描电镜、透射电镜和流式细胞仪观察NZ2114作用下的细菌形态变化;使用凝胶阻滞、荧光光谱和圆二色谱进一步分析NZ2114对细菌基因组DNA的作用。结果显示,停乳链球菌对氧氟沙星和四环素均产生耐药性,临床分离菌株则呈现多重耐药性,NZ2114对受试停乳链球菌和金黄色葡萄球菌的MIC值为0.11~0.45 μmol/L。抗菌肽在TSB培养基和全脂灭菌牛奶中均具有抑菌活性,且在短时间内（0.5~3 h）可使停乳链球菌菌落数下降3个数量级。扫描电镜、透射电镜和流式细胞仪结果表明,抗菌肽NZ2114能够破坏停乳链球菌细胞膜,导致其内容物泄漏。凝胶阻滞、荧光光谱和圆二色谱证实抗菌肽穿过细胞膜后与细菌基因组结合,破坏了DNA,以此达到杀菌目的。上述结果表明,抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌杀菌活性强,其破坏菌体细胞膜后可直接作用于胞内的基因组DNA并改变其二级结构。由此可见,抗菌肽NZ2114是一种极具前景的治疗停乳链球菌引起乳腺炎的抗生素替代品。     

奶牛停乳链球菌性乳房炎的诊治

<正>大庆市某牛场有产奶期奶牛80头,自2009年4月中旬临床型乳房炎发病率明显升高,到2009年5月初发病率达25%。病牛主要症状为乳房肿胀,皮下有大小不等的硬块,用手触摸有疼痛感,多数乳汁     

停乳链球菌MIG基因的克隆和原核表达

本研究用PCR方法从停乳链球菌C588的基因组DNA中扩增出MIG基因，用T／A克隆法将其插入pBS—T载体，并构建原核表达载体pET-32a（＋）-MIG。用BL21（DE3）／pET系统表达Trix—MIG融合蛋白，SDS—PAGE和Westem blot分析鉴定表达产物。结果PCR扩增产物经测序，证实与GenBank中停乳链球菌MIG基因（AF354651）序列同源性为99％。SDS—PAGE显示，经IPTG诱导后BL21（DE3）／pET-32a（＋）-MIG总蛋白中出现一条相对分子质量为89ku的新蛋白条带。Westem blot分析显示，MIG蛋白可与停乳链球菌多克隆抗血清发生特异性反应。MIG融合蛋白的表达为MIG在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。     

猪附红细胞体与链球菌的混合感染病例

猪附红细胞体病是由附红细胞寄生于猪红细胞或血浆中引起的一种血液传染病;猪链球菌病是致病性溶血性链球菌引起猪的一种急性、败血性传染病。这两种疾病已成为断奶猪的多发常见病之一,发病快,死亡率高,并给养殖业带来了巨大的经济损失。2009年7月中旬,某猪场断奶仔猪陆续发病并出现死亡。经综合诊疗为猪附红细胞体与链球菌的混合感染病,现将有关诊断与治疗经过整理如下。     

猪附红细胞体与链球菌的混合感染病例

猪附红细胞体病是由附红细胞寄生于猪红细胞或血浆中引起的一种血液传染病;猪链球菌病是致病性溶血性链球菌引起猪的一种急性、败血性传染病。这两种疾病已成为断奶猪的多发常见病之一,发病快,死亡率高,并给养殖业带来了巨大的经济损失。2009年7月中旬,某猪场断奶仔猪陆续发病并出现死亡。经综合诊疗为猪附红细胞体与链球菌的混合感染病,现将有关诊断与治疗经过整理如下。     

一起成年牛感染肺炎型链球菌的病例报告

牛肺炎链球菌病是由肺炎链球菌引起的一种急性败血性传染病，主要发生于犊牛。患畜为传染源，主要经呼吸道感染，具有发病急、死亡快、死亡率高、呈散发或地方流行性的特征。2011年10月隆安县南圩镇光明村发生一起成年水牛急性死亡病例，经采集病料送检，分离出一种革兰氏阳性球菌，经生化试验和PCR鉴定为肺炎链球菌。     

猪附红体、链球菌和弓浆虫混合感染病例的诊治经过

2009年1月，某养猪户带一病猪前来求诊。该户共养大小猪只120余头，体重在20—50kg之间，喂食的饲粮主要有米皮、玉米粉和一些预混剂。平时免疫接种过伪狂犬病、气喘病、五号病、猪瘟、蓝耳病等疫苗。其中，五号病、猪瘟和蓝耳病3种病均进行了2免。     

鸡盲肠肝炎和大肠杆菌病混合感染的诊治

江苏省洪泽县岔河镇某草鸡养殖示范户在树林下饲养的5000只70日龄草鸡,连续5天发生零星死亡,每天死亡10～15只,第6天开始,每天死亡80多只,用多种抗菌药治疗,效果不明显。(一)临床症状病鸡缩头闭眼,被毛松乱,食欲下降,极度消瘦,腹泻,粪便呈黄绿色,有的头脸发青紫色甚至呈紫黑色,多数发病后3～5天死亡。(二)病理剖检解剖6只病死鸡,主要病理变化见表1。(三)实验检测分别采取肝脏、气囊、心包液,涂片染色镜检和细菌分离培养,同     

一例鸡新城疫病毒和大肠杆菌混合感染的诊断

解剖5只送检的临床发病鸡及病死鸡,发现4只剖检鸡均有腺胃乳头出血、直肠和泄殖腔出血,喉头有大量粘液等病变,2只鸡的气囊出现混浊.采集病料,处理后接种10日龄SPF鸡胚,发现鸡胚在48h左右死亡,收集死亡鸡胚的尿囊液,用1%的鸡红细胞进行血凝试验(HA),结果HA效价为27左右,进一步用新城疫阳性标准血清进行血凝抑制试验(HI),实验表明HI为阳性;对肝脏病料中进行细菌分离培养,结果 18h后麦康凯琼脂平板上,长出红色的菌落群,经生化鉴定为埃希氏大肠杆菌.由此可断定,该鸡群混合感染了新城疫病毒和大肠杆菌.