猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。     

猪细小病毒SY-99株VP2基因的序列分析

克隆并测定猪细小病毒SY－99株VP2基因，与NADL－2（4973）株、NADL－2（5075）株、Kresse株和US－1株VP2基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比较与分析，发现PPV SY－99株与Kresse株VP2基因核苷酸和氨基酸同一性最高，推测SY－99株可能为一强毒株。     

间接ELISA检测犬细小病毒病血清抗体方法的建立

用犬肾细胞增殖犬细小病毒,经纯化﹑标化作为包被抗原,建立检测犬细小病毒抗体的间接ELISA方法。结果表明:抗原最佳包被浓度5μg/mL;血清最佳稀释度1:40,反应时间45min;酶标抗体最佳稀释度1:2000,反应时间45min;S/P≥0.240判为阳性,≤0.190判为阴性,介于二者之间为可疑。该抗原不与犬瘟热﹑犬传染性肝炎﹑犬冠状病毒病﹑猫泛白细胞减少症病原阳性血清反应;批内重复试验变异系数小于10%,批间重复试验变异系数小于15%;对20份免疫犬血清进行检测,阳性检出率为85%,明显高于血凝抑制试验(65%),符合率为80%。试验结果表明建立的间接ELISA检测犬细小病毒抗体方法特异、灵敏、可重复性好。     

猪细小病毒结构蛋白VP2及其疫苗的研究进展

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一,该病毒在世界范围内广泛存在并呈地方性流行, 给生猪的繁殖、发展带来了巨大的经济损失,故防制猪细小病毒病非常重要。PPV VP2蛋白是病毒粒子的主要衣壳蛋白,在体外能自我装配成病毒样颗粒,并能刺激机体产生抗PPV中和抗体,且可作为抗原转运载体,所以研究VP2对PPV新型疫苗研制至关重要。文章综述了猪细小病毒结构蛋白VP2及其疫苗的研究进展。     

猪细小病毒结构蛋白VP2研究进展

猪细小病毒(PPV)是引起猪繁殖障碍性疾病的重要病原之一,目前该病在世界很多国家均有流行和报道,给养猪业带来巨大损失。传统的灭活苗和弱毒苗又都存在各自的缺陷,新型诊断试剂及疫苗的研究迫在眉睫。VP2蛋白是病毒粒子的主要衣壳蛋白,具有在体外能自我装配成类病毒粒子,并能刺激机体产生抗PPV中和抗体,可作为抗原转运载体等特性,故VP2蛋白在猪细小病毒诊断试剂及新型疫苗研究领域具有很大的潜力。论文就VP2的分子生物学及其在该病诊断与预防等方面的研究进展进行了综述。     

猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原捕捉ELISA方法的建立

为制备猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体(McAb),建立检测猪细小病毒的抗原捕捉ELISA方法 (AC-ELISA),本研究以原核表达的重组VP2蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA方法筛选,成功获得了2株能稳定分泌抗猪细小病毒VP2蛋白的McAb,命名为3C4、5F8。以多克隆抗体作为捕获抗体、单克隆抗体5F8作为检测抗体,通过双抗夹心ELISA各个反应条件的优化,建立检测猪细小病毒抗原捕捉ELISA方法。该方法与日本乙脑病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)均不发生交叉反应;与RT-PCR相比较,符合率、敏感性和特异性分别为93.6%、90.9%、94.4%。本研究建立的猪细小病毒AC-ELISA有良好的重复性、敏感性和特异性,可应用于猪细小病毒感染的早期诊断。     

猪细小病毒VP2基因及其编码蛋白研究进展

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起猪繁殖障碍的重要病原之一，主要引起初产母猪不孕、流产、木乃伊胎、死产，而母猪本身并不表现临床症状，其他猪感染后也无明显的临床症状。PPV最先由Mary和Mahnet于猪瘟病毒组织培养时发现。从60年代中期，许多国家相继分离到该病毒并逐步明确其致病作用。我国于1982年由中国兽药监察     

猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用

参考Gen Bank中发表的猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,应用Primer5.0软件设计了一对引物,预期目的条带约591 bp。对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了试验,建立了PPV的PCR检测方法。符合性实验结果表明,该PCR方法优于HA、VI以及IHA。使用该方法对215份病料进行了检测,检出阳性样品25份,检出率为11.63%。结果表明,该方法可用于PPV的诊断及流行病学监测。     

不同毒株猪细小病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用PCR扩增了猪细小病毒NJ-1株、NJ-2株、7909株和Vaccine株的VP2基因,分别克隆于pGEM-TEasy载体中,测定其核苷酸序列,并推导出相应的氨基酸序列,对其核苷酸和氨基酸序列进行分析和同源性比较。所测4个序列中,NJ-1株、NJ-2株和7909株序列均为1437bp,共编码479个氨基酸;而Vaccine序列为657bp,比其他毒株缺失780bp,共编码219个氨基酸。将所得4个序列与GenBank中NADL-2株、Kresse株、China株及VR-1株相应的核苷酸及氨基酸进行同源性比较,发现其核苷酸和氨基酸的同源性分别在97.7%~99.9%和97.2%~99.2%之间,具有高度同源性;通过绘制系统进化树可知,分离自国内的China株、NJ-1株、NJ-2株、7909株及Vaccine株亲缘性最为相近,与其他毒株的亲缘关系较远。     

猪细小病毒核衣壳VP2蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定

以纯化的PPV重组VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,间接ELISA筛选和3次以上细胞克隆,获得了5株稳定分泌抗PPV VP2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为2D5、1F11、2B4、3C8、1 H3。其染色体平均数均为87～102条,分泌抗体亚类4株为Ig M类,1株为IgG类,Western blot检测表明,5株单抗均识别猪细小病毒VP2蛋白;间接免疫荧光鉴定表明,5株单抗均与PPV全病毒发生反应;间接ELISA鉴定与其他相关病毒的交叉反应性表明,制备的5株单抗不与TEGV、PRV和PEDV反应,表明所制备的抗体与猪细小病毒具有较强的特异性反应。     

猪细小病毒SC-1株VP2基因的克隆及生物信息学分析

根据PPVNADL-2株基因组序列设计了一对引物,以复制型DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.0kb的DNA片段,将其插入克隆载体质粒pUC19,构建重组质粒pPVP2,测序显示PPV-SC-1VP2基因全长1740bp,共编码579个氨基酸。多序列比对结果显示,猪细小病毒VP2基因保守性强,仅存在个别的差异;密码子偏向性分析结果表明,PPV-SC-1VP2基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,并且与PPV-SC-1NS1在密码子的偏向性上具有相同的属性,主要偏向于使用以A结尾的密码子;氨基酸疏水性分析表明,PPV-SC-1VP2蛋白在77~82、291~304、362~373、400~411、465~477等位点存在较明显的亲水区段;跨膜区结构分析显示该蛋白不存在显著意义的跨膜区;分析该蛋白的抗原位点可能位于60~68、81~88、266~275、351~357、398~404位点处。     

检测猪细小病毒血清抗体乳胶凝集试验方法的建立及初步应用

将猪细小病毒在IBRS-2细胞上同步培养增殖,待出现细胞病变后,反复冻融,收获病毒液,用甲醛灭活。随后用经硫酸胺沉淀、透析后浓缩的细小病毒液进行方阵滴定,选择致敏乳胶的最佳条件,制成细小病毒乳胶凝集试验（LAT）抗原。抗原与细小病毒阳性血清反应出现肉眼可见的凝集颗粒,而与生理盐水、PBS、犊牛血清、猪瘟、衣原体、口蹄疫、伪狂犬病、弓形体及萎缩性鼻炎等阳性血清不出现凝集现象。用所建立的细小病毒乳胶凝集试验（LAT）与血凝抑制试验检测了203份猪血清,其中血凝抑制抗体阳性为161份,阴性为42份,阳性率为79.31％;乳胶凝集抗体阳性为150份,阴性为53份,阳性率为73.89％,两种方法阳性符合率为93.16％,经统计学检验P＞0.05,两者差异不显著。结果表明,乳胶凝集试验可以作为临床上大量血样进行血凝抑制试验前的初筛,具有简便、准确的优点,在检测细小病毒（PPV）抗体上具有较好的应用前景。     

重组猪细小病毒VP2基因的猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的构建及纯化

参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本实验室构建的含绿色荧光蛋白标记基因的伪狂犬病毒(PRV)通用转移质粒pG和构建好的pMD-VP2质粒,用BamHⅠ对质粒pG和pMD-VP2进行酶切,然后用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理,纯化回收后将VP2基因插入pG质粒中获得重组伪狂犬病毒转移质粒pGVP2。用脂质体转染法将PRV HB-98株全基因组与质粒pGVP2共转染ST细胞,得到携带有PPV VP2外源抗原基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2株。结合VP2基因PCR扩增和绿色荧光观察,经5轮病毒空斑纯化得到了纯化的重组病毒rPRV-VP2株。     

猪细小病毒VP2基因核酸疫苗的构建及免疫原性

将PPV VP2基因酶切后克隆到真核表达载体pcDNA-3.1(+)中,构建pcDNA-VP2,经脂质体法转染IBRS-2细胞后,Western blotting检测pcDNA-VP2能正常表达.采用 pcDNA-VP2肌注Balb/c小鼠,作间接ELISA抗体检测试验,并采用淋巴细胞增殖试验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)法对小鼠的细胞免疫进行检测.结果表明,pcDNA-VP2能诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答.PCR扩增检测结果显示,未能从免疫小鼠各组织的基因组中扩增出VP2基因片段.     

猪细小病毒病PCR检测方法的建立及应用

根据NCB I中登录的猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,应用Prim er Prem ier 5.0软件设计一对引物,经反应条件优化,建立PPV的PCR检测方法。经特异性和敏感性测定,其最低检测值可达6×10-3ng/μl。采用PCR方法对118份临床样品进行应用检测,结果检测到6份为阳性样品。     

猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达

利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0kb的基因片段，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列。将所得的核心苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较，同源性均在99%以上，从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2；将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f。利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况，结果发现pET17bVP2f质粒在45kD处有一特异性表达带，而其它几种质粒均未看到特异性表达带，推测VP2基因3‘端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响。这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义。     

猪细小病毒VP2蛋白的原核表达及其免疫原性评估

利用原核表达载体pET28a和pColdⅠ与猪细小病毒VP2基因分别构建重组表达质粒,并采用与伴侣蛋白共表达和低温诱导表达猪细小病毒VP2蛋白,并以电镜观察、血凝效价测定等进行鉴定。结果显示,2个表达载体均能对重组蛋白进行可溶性表达。冷休克载体组pColdⅠ-VP2蛋白在上清中表达效率更高且杂蛋白较少,诱导时不需要额外添加L-阿拉伯糖,表达过程工艺相对更简单。纯化后的pColdⅠ-VP2蛋白具有一定的免疫反应性,能在体外组装成病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),且具有血凝活性,使用206佐剂混合乳化重组蛋白免疫豚鼠后,血清中能检测到高滴度血凝抑制抗体。上述结果为进一步研究新型安全高效的猪细小病毒疫苗提供了数据支持。     

四川省部分种畜(猪)场猪细小病毒病血清抗体的检测

猪细小病毒是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。以胚胎和胎儿感染及死亡为特征。实践中，本病以预防为主，采用猪细小病毒疫苗免疫。采用乳胶凝集抗原，对我省部分种畜（猪）场的猪血清进行了猪细小病毒病血清抗体检测，结果显示，平均阳性率为56％，其中阳性率最高达93％，最低为14．71％。