转基因马铃薯植株的抗性筛选及其PCR鉴定

近年来,转基因技术研究发展很快,筛选、鉴定转基因植株是基因转移的必须环节。本实验利用农杆菌(含有pARTGF植物表达载体)介导法将外源基因转入马铃薯植株,经过含有卡那霉素培养基的抗性筛选,初步筛选出转基因马铃薯植株A、B、C分别为5株、7株、8株;将筛选的转基因马铃薯植株利用PCR进行检测,经分析,其结果初步表明,已成功将目的基因转入马铃薯基因组中,并获得阳性植株分别为2株、4株、5株。     

PCR检测转基因大豆

［目的］定性检测转基因大豆。［方法］以非转基因大豆和CP4-EPSPS转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（CP4-EPSPS）为检测的目的片段,建立PCR反应体系。采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA,并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。［结果］改进CTAB法提取的大豆基因组DNA电泳条带清晰完整,转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA均可扩增出约409 bp的条带即Lectin基因,而只在转基因大豆中检测出CP4-EPSPS特异性片段;当转基因大豆的含量为100%～0.2%时,均可扩增出特异性条带。［结论］该研究建立了转基因大豆的PCR检测方法。     

DP -305423转基因大豆PCR检测方法研究

根据DP- 305423外源插入片段与植物基因组序列设计特异性引物,以leetin基因(118 bp)作为内参照基因,筛选最佳引物并对反应程序和反应体系进行优化,最终建立转基因大豆DP - 305423转化体特异性定性PCR检测方法.对该方法进行了特异性、灵敏度、稳定性和重复性测试.结果表明:该方法能够特异性检测出DP...     

市售马铃薯转基因成分检测

[目的]检测市售马铃薯转基因成分。[方法]采用CTAB法提取样品的基因组DNA,分别设计花椰菜花叶病毒35s启动子（pro-moter from canliflomer mosaic virus,CaMV 35s）和胭脂碱合成酶3’转录终止子（nopaline synthase lerminator,NOS）作为特异性引物,然后对基因组DNA进行PCR扩增检测,根据扩增后产物的琼脂糖凝胶电泳图可分析出其中是否含有转基因成分。[结果]10份马铃薯样品中5份检测出含有转基因成分,占检测样品的50%。[结论]由结果推断出市场上销售的转基因马铃薯占总马铃薯销售量的50%左右。     

转基因产品的检测方法

目前,转基因产品的检测方法主要有分子杂交、PCR方法、酶联免疫分析法和基因芯片等,其中分子杂交包括Southern杂交、Northern杂交和Western杂交。对以上转基因产品检测方法进行了介绍,并对它们的优缺点进行了分析。     

转基因抗草甘膦油菜的实用PCR检测方法

 利用定性PCR技术 ,建立了检测孟山都公司培育的转基因抗草甘膦油菜中的epsps、gox和fmv35s的方法 ,同时设立了阳性内对照napin。该方法的检测灵敏度为 0 .0 5 %。利用复合PCR可以在一个PCR反应中同时检测出epsps、gox、fmv35s和napin基因。这种方法可以有效地用于转基因抗草甘膦油菜中的外源基因的检测。     

DNA提取方法对转基因甘蔗PCR检测的影响

研究了不同提取方法和不同生长时期甘蔗提取的DNA对转基因甘蔗植株PCR检测的影响。结果表明,幼苗时期提取的甘蔗叶片模板DNA质量高于田间成熟植株;甘蔗幼苗时期的PCR检测易于成熟植株;CTAB法、SDS法和CTAB-SDS法提取的甘蔗叶片DNA均能满足幼苗期甘蔗抗性植株的PCR检测要求;对成熟转基因甘蔗植株而言,以CT...     

马铃薯黑痣病多重实时定量 PCR 检测方法的建立

为建立快速、准确、可靠的马铃薯黑痣病鉴定和检测方法,以黑痣病病原菌立枯丝核菌核糖体基因簇间的保守序列—转录间隔区（Internal transcribed spacer,ITS）为靶区域,同时引入马铃薯细胞色素氧化酶（cytochrome oxidase gene,Cox）作内参,应用多重实时定量 PCR 技术,建立马铃薯黑痣病病原菌TaqMan RFQ-PCR 多重快速检测方法。结果表明：RFQ-PCR 检测体系的引物-探针具有高度的特异性,灵敏度比普通 PCR 方法高10～100倍;内参基因的引入还可有效避免假阴性的出现。方法特异性强、灵敏度高、简单、快速、可靠。     

马铃薯疮痂病的实时定量PCR检测方法

应用实时定量PCR技术对马铃薯疮痂病进行检测,在Nec1、TxtAB致病基因上进行引物探针的设计,在Nec1基因上筛选获得最佳探针引物。本方法重复性好,特异性强,灵敏度高,可实现准确定量。     

转基因水稻种子中外源元件的PCR检测

基因重组技术突破了传统育种所遇到的一些障碍，能够准确、快速地把目的基因导入寄主细胞中，从而赋予寄主以抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境、延熟等优良特性，或使其营养品质得到改善。但转基因农作物潜在的风险还是一个尚待研究的领域，有关转基因植物对环境安全、生物物种安全、人类安全与健康的影响尚无定论。各国都纷纷针对转基因产品的贸易制定了相应政策，并建立了许多转基因产品的检测方法［1，2］。 水稻是一种重要的粮食作物。自1988年第一批水稻转基因植株问世以来，中国、日本、泰国、德国、菲律宾、瑞士、英国、加拿大等国家在水稻转基因研究领域取得了一系列成果，许多转基因水稻品系已进入田间试验。预计在不久的将来，转基因水稻将实现商品化［3］。因此，有必要建立快速、简便、灵敏的转基因水稻种子检测方法。     

应用聚合酶链反应快速检测沙门氏菌

利用聚合酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｃｎ，ＰＣＲ）技术检测沙门氏菌。根据沙门氏菌鞭毛素Ｉ相抗原基因，设计了一对各长２０个碱基的引物，扩增２６９ｂｐ的片段。并用８个标准标沙门氏菌株和３个阴性菌株检查引物特异性，结果完全相符。采用５０μＬ体积，ＮＴＰｓ２００μｍｏｌ，引物各１μｍｏｌ，ｍｇ＋＋３ｍｍｏｌ，Ｔａｑ酶２Ｕ。循环温度为９７℃７ｍｉｎ予变性后；９４℃１ｍｉｎ，６０℃１ｍｉｎ，３５个循环后再延伸７２℃７ｍｉｎ。经电泳分析，灵敏度可达每毫升检出１０４个细胞，经二次扩增后，灵敏度还可提高。实验共检查了３０个可疑样品，检出率明显高于生化检查和免疫学方法检查。     

使用Eva Green染料的荧光PCR定性检测转基因产品

本文把一种新型荧光染料——Eva Green应用在荧光PCR中,通过设计特异性的引物来检测转基因产品。所检测的转基因基因包括内对照基因rbcl,外源基因的筛选基因Carny 35S启动子,NOS终止子,NPTⅡ基因,外源基因的鉴定转基因大豆roundupready的CP4CP4EPSPS和转基因马铃薯NEWLEAF的PVYcp。实验结果表明,各对引物特异性强,使用EvaGreen荧光检测的结果稳定,检测线可以小于0．5％．     

PCR技术在印度腥黑穗病菌检测和鉴定中的应用

利用2对小麦印度腥黑穗病菌（Tilletia indica Mitra)特异性引物（Tin3/Tin4,F3／R1）和2对黑麦草腥黑穗病菌T.walkeri特异性引物（Tin7/Tin8,Tin11/Tin4)建立快速鉴定T.indica及其近似种T.walkeri的PCR程序。引物Tin3/Tin4,F3/R1可特异性扩增T.indica分别得到415bp和498bp产物,扩增T.walkeri无产物;引物Tin/Tin8,Tin11/Tin4可特异性 扩增T.walkeri得到391bp和415bp产物,扩增T.indica无产物。4对引物扩增T.horrida、T.controversa和T.laevis无产物。产物片段的测序验证了PCR反应的可靠性。为进口粮检疫中T.indica的鉴定提供了快速、简便、实用的PCR诊断技术。     

火焰原子吸收光谱法测定薯类中微量元素

用非完全消化法处理样品,以火焰原子吸收光谱法成功地测定了马铃薯及甘薯中的钙、镁、铁、锌.在低温下用高氯酸-硝酸(1 3)消解样品,配制成透明的草绿色样品溶液.用La3 作钙、镁的释放剂以消除化学干扰,以氯化钠作钾的消电离剂以消除电离干扰.对消解溶剂的选择、各种干扰、试液与其空白溶液物理性质的一致性进行了考察.测定结果的RSD小于3.9%,测定结果与灰化法一致,相对误差小于±2.6%.方法简便准确.     

应用MRCO设计提取螺旋藻多糖的研究

采用单因素分组试验与计算机优化设计对钝顶螺旋藻水溶性多糖的提取、分离工艺条件进行了研究,比较了浸提温度、提取时间、浸提次数、水料比等因素对钝顶螺旋藻水溶性多糖分离提取的影响,选定适宜的提取工艺条件为：温度７５℃、提取时间２ｈ,水料比４３：！,乙醇体积为７５％,提取次数为２次,用Ｓｅｖａｇｅ法、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００柱层析法纯化螺旋藻多糖,使其纯度达到９６．８％,并肜纸层析法,紫外光谱对纯度进行     

应用聚合酶链反应快速检测沙门氏菌

根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列设计引物，对沙门氏菌属A－F各群中共15株沙门氏菌标准菌株、27株沙门氏菌现场分离菌株和其他10株非沙门氏菌菌株进行聚合酶链反应（PCR）扩增，结果沙门氏菌均出现495bp特异性DNA扩增条带，所有对照均未出现特异条带，提示这对引物具有很强的沙门氏菌属特异性。PCR敏感性试验显示，该体系能检出14pg以上的沙门氏菌DNA。通过对5种不同的DNA模板提取方法的比较，选择操作简便、快速、成本低廉的热裂解法。采用该方法。采用该方法，对生鲜奶样进行检测，经与国家标准卫生检验方法相比较，两者符合率达100％。     

甘蔗白条病(Xanthomonas albilineans)PCR检验技术研究

应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术检测甘蔗茎白条病无症样品和细菌纯培养及ＤＮＡ,并以改良半选择培养基（ｍＸＡＭ）加以验证。结果表明,ＰＣＲ能特异性地检出白条黄单胞包括标准菌株３３９１５ＡＴＣＣ和血清型Ⅰ,Ⅱ等１９个菌株。但不能扩增其它５个分离自蔗茎的腐生黄单胞和１３个其它属种的植物细菌。能够检出少至１０ｐｇ靶细菌的总ＤＮＡ或２０个活细菌。ＰＣＲ检测灵敏度较ＥＬＩＳＡ和ＤＩＡ高１００～１０００倍。田间样品检测结果与实际发病符合度为９３．４６％。该项技术适用于国内外甘蔗种质资源交换和口岸检疫以及病害流行学研究。     

应用PCR快速检测单核细胞增生症李斯特菌的研究

用聚合酶链式反应(PCR)扩增hly基因,检测单核细胞增生症李斯特菌的纯培养物及其模拟污染的生猪肉、水和牛奶。41株单核细胞增生症李斯特菌的PCR结果呈阳性,而其他李斯特菌,包括英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、威儿李斯特菌和格氏李斯特菌以及非李斯特菌均未出现特异性片段。这表明所扩增的hly基因3′末段850bp的DNA片段对单核细胞增生症李斯特菌具有较高的特异性。PCR对单核细胞增生症李斯特菌纯培养物的检测低限达10~5cfu·mL~(-1),对16hLEB增菌培养的模拟污染生猪肉、水和牛奶的增菌培养液用PCR捡测,结果检测生猪肉低限达400cfu·kg~(-1)、水和牛奶为400cfu·L~(-1)。整个检测过程只需24h。这表明PCR法对单核细胞增生症李斯特菌的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点。     

一步法复合RT-PCR鉴别ND强毒与AI病毒的研究

根据新城疫病毒（NDV）融合蛋白和禽流感病毒（AIV）核蛋白的核酸序列设计2对引物,对NDV和AIV的特异扩增片段分别为156bp和219bp,建立了同时检测强毒力NDV和AIV核酸的一步法复合RT—PCR。试验中未能检出弱毒力NDV,IBV,IBDV,REV,REOV及SPF鸡肌肉组织的RNA,从不同年代分离的16个NDV强毒株全为阳性而NDV弱毒株全为阴性。经验证,复合引物与单一引物的扩增效率一致,能够检出NDV和H;亚型AIV的最低病毒量分别为10^3.7EID。和10^3.9EID50。试验结果表明,此次建立的一步法复合RT—PCR特异、敏感,适用于强毒力NDV和AIV．感染的快速鉴别。     

PCR方法进行牛Y—DNA特异性片段的分子克隆

本研究应用聚合酶链反应扩增牛Ｙ染色体特异性ＤＮＡ片段,从宰后成年公,母牛肝提取ＤＮＡ,分别俄为ＰＣＲ扩增模板,扩增产物电泳结果,公牛样品具有特异性ＤＮＡ扩增谱带,而母牛样品则没有扩增带,以ｐＵＣ１８为载体,将扩增片段构建成牛Ｙ特异性的部分Ｙ染色体文库。本实验所克隆的牛Ｙ特异性ＤＮＡ片段可以作为奶牛胚胎性别鉴定的探针ＤＮＡ。