细小病毒反向遗传操作技术研究进展

细小病毒感染的动物宿主广泛,包括猫科、犬科、猪科、牛科、鸭科和鼬科等动物,是动物的一种重要病原.病毒反向遗传学技术是在获得病毒全基因组序列的基础上,构建感染性克隆,通过DNA重组、定点突变、插入、缺失等遗传修饰手段创造突变体,并研究突变体所造成的表型效应,从而研究基因的生物学功能.论文对ssDNA细小病毒反向遗传学技术...     

猪细小病毒SH-1株VP2和NS1基因的克隆与原核表达

通过PCR技术,从感染了猪细小病毒的ST细胞中扩增出猪细小病毒的VP2基因和NS1基因,并将其亚克隆至原核表达载体中,分别构建了重组表达载体pET32c/VP2和pET30a/NS1,经IPTG诱导,使pET32c/VP2和pET30a/NS1在受体菌BL21(DE3)中得到高效表达。经Western-blot检测具有生物学活性,为猪细小病毒野毒与疫苗毒的鉴别诊断奠定基础。     

一例猪细小病毒病的诊断

从取自某猪场表现初产母猪流产胎儿的肾脏、脾脏、肠系膜淋巴结组织,进行研磨后接种猪原代肾细胞,成功分离到一株病毒。该病毒的豚鼠红细胞血凝活性为27,用针对猪细小病毒结构蛋白VP2的特异性引物对分离病毒进行扩增,将扩增结果进行克隆测序,结果经BLAST分析后,证实分离到一株猪细小病毒。     

猪细小病毒病的综合防治

正猪细小病毒病是由猪细小病毒(PPV)引起的繁殖障碍病,该病主要表现为胚胎和胎儿的感染及死亡,特别是初产母猪发生死胎畸形胎和木乃伊胎,而其他年龄的猪感染后一般不见明显的临床症状。(一)病原猪细小病毒(PPV)为细小病毒科细小病毒属成员。病毒对热具有较强抵抗力,56℃48 h、70℃2 h病毒的感染性和血凝性均无明显改     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

福贡县猪细小病毒病的流行情况监测与分析

2012年~2014年,采用猪细小病毒酶联免疫吸附试验,对我县57个村饲养的部分生猪进行了猪细小病毒监测.共监测血清样品687份,结果:猪细小病毒血清抗体阳性数112份,阳性率16.30%.通过监测,基本查清了我县猪细小病毒的流行分布情况.     

一株新型猪细小病毒的鉴定和分子克隆

在与猪圆环病毒2型混合感染的患病猪肺泡灌洗液中鉴定出一株新型的猪细小病毒,命名为PPV4,该病毒与牛细小病毒2型同源性较小,与编码ORF3的Bocavir-us属(如牛细小病毒、犬细小病毒和人bocavirus等)同源性较高。PPV4的ORF3编码一个含204个氨基酸残基的蛋白质,与bocaviruses的ORF3编码蛋白质的大小类似;而bocaviruses的ORF3编码蛋白质相互间相似性较高,PPV4的ORF3编码蛋白质与GenBank非冗余蛋白质数据库中的蛋白质无同源性。     

猪细小病毒病实验室诊断技术

猪细小病毒可引起猪的繁殖障碍性疾病,其特征为感染母猪,特别是初产母猪,产出死胎、畸形胎、木乃伊胎、流产及病弱仔猪.给养猪业带来的经济损失巨大.主要对猪细小病毒病的实验室诊断技术进行了介绍,以期为有效防控该病提供参考.     

猪细小病毒SX株的分离鉴定

从发生蓝耳病的猪场采集流产、死胎病料中分离出了一株病毒,适用传代细胞后,该病毒能够在ST细胞上生长并引起明显的呈拉网状和细胞脱落的细胞病变(CPE),能够凝集0.5%的豚鼠红细胞,经猪细小病毒阳性血清中和后不能引起细胞病变(CPE),也失去了血凝特性;用特异荧光抗体染色可见细胞核内出现特异性荧光.采用特异性PPV NS1基因的引物进行扩增,得到了大小约为2.18 kb的片段,测序并与猪细小病毒相应序列进行比较,同源性为99%以上,鉴定该病毒为猪细小病毒,命名为PPV-SX.说明目前有部分猪繁殖障碍是由猪细小病毒和PRRS共同感染而致.     

猪细小病毒NS1基因低温诱导表达及间接ELISA方法的建立

利用PCR技术从猪细小病毒的DNA模板中扩增了NS1的基因片段,将PCR产物克隆至pET32c载体,将构建好的重组质粒pET32c-NS1,转入表达宿主茵BL21中,利用低温诱导表达的方法,避免了包涵体的形成.West-ern-blot结果显示,表达产物有良好的生物活性.纯化后的重组蛋白作为抗原,包被酶标板,建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法.抗原最佳包被质量浓度为2.5 mg/L、血清最佳稀释度为1∶200.表达的NS1蛋白可作为免疫诊断试剂用于检测PPV,且能很好的区别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪.     

猪细小病毒分子生物学研究进展

猪细小病毒是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。本文就猪细小病毒生长、生化特性、基因组结构、转录、编码蛋白以及表达调控等方面的研究作了全面的综述,以期为研究猪细小病毒提供参考。     

猪细小病毒分子生物学研究进展

本文就猪细小病毒基因组结构、转录和翻译、蛋白质的结构和功能及其在诊断方面的应用等多年来的研究作了综述，以期为防制猪细小病毒提供参考。     

博卡病毒概述

一、分类博卡病毒属于细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属。细小病毒科由细小病毒亚科和浓核病毒亚科组成,包括一些重要的人和动物疾病的病原体。前者感染脊椎动物,后者感染节肢动物。细小病毒亚科分为5个属:细小病毒属、红病毒属、依赖病毒属、Amdovirus和博卡病毒属,最近又提出了Hokovirus和Cnvirus这两个新的属,还有与细小病毒亚科的任何成员都不产生聚簇的牛分离株(BPV2和BPV3)和猪分离株(PPV4)。博卡病毒属包括牛细小病毒(BPV1)、犬细小病毒(CPV)、大猩猩博卡病毒(GBoV1)、人类博卡病毒(HBoV1-4)和猪博卡病毒。     

猪细小病毒病防控

生猪在感染猪细小病毒后,会出现生殖方面的障碍,降低养殖场内部繁育成效的同时,还会诱发猪渗出性皮炎。仔猪感染后易引起多系统衰弱综合征,猪细小病毒的传播途径较多,母体多无明显病变,前期不易发现,综合防控难度相对较高。本文第一部分阐述了猪细小病毒病的病原学、流行病学、临床症状、诊断及治疗;第二部分探讨了猪细小病毒病的防控策略,旨在为猪细小病毒病的有效防控提供一些参考措施。     

猪脑心肌炎病毒分离株BJC3全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定

本研究旨在建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)的感染性克隆技术.利用RT-PCR分3段扩增出脑心肌炎病毒BJC3株的全基因组cDNA,依次克隆至低拷贝质粒pWSK29,构建出全长质粒pWSKBJC3/w,经体外转录和转染BHK-21细胞拯救病毒.结果表明,构建的全长cDNA克隆具有感染性,在BHK-21细胞上可拯救出病毒.拯救病毒(命名为rVBJC3W)在BHK-21细胞上的生长特性与其亲本病毒BJC3一致,并保持了对小鼠的致病性.本研究成功构建了中国第1株猪脑心肌炎病毒的感染性克隆,为深入研究其分子致病机制提供了必要的工具.     

雏鸡贫血因子和细小病毒

关于细小病毒细小病毒(Parvovirus)被发现已有好多年了。侵害人和家畜、家禽的细小病毒都各不相同。这类病毒的大小约为22～25毫微米,含有一条单链直线状的 DNA,其在氯化铯中的密度为每立方厘米1.4克。有些细小病毒可独立生活,称为“自由生活细小病毒”;其他细小病毒则只是在存在腺病毒的情况下才有活力,这些就被称为腺病毒依赖性细小病毒。尚未发现腺病毒依赖性细小病毒可引起疾病,但“自由生活细小病毒”则可引起多种重要疾病,如猪的繁殖障碍、幼犬的心脏病和成年犬的腹泻,以及鹅的 Derzsy's 病。     

猪细小病毒2型、3型、6型多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立同时快速检测猪细小病毒2型(PPV2)、猪细小病毒3型(PPV3)、猪细小病毒6型(PPV6)的方法,本研究根据PPV2、PPV3、PPV6各自的NS基因序列设计3对特异性引物,建立了一种能同时检测上述病原的多重PCR方法。结果显示,建立的多重PCR方法对PPV2、PPV3、PPV6的基因组DNA均能有效扩增,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、日本乙型脑炎病毒(JEV)的核酸均无特异性扩增,特异性较强;对PPV2、PPV3、PPV6的重组质粒最低检测限分别为4.32×10^3拷贝/μL、9.62×10^3拷贝/μL、4.25×10^3拷贝/μL,与其他研究者已建立的单一PCR检测结果一致,敏感性较高。利用本研究建立的多重PCR方法对25份可疑临床样品检测,同时利用文献报道的单一PCR方法检测,二者结果一致。本研究建立的多重PCR方法为检测PPV,及该病的流行病学调查提供了技术支持。     

实时荧光定量PCR检测猪细小病毒

根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了引物和探针,从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中提取DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌JM109,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行PCR和测序鉴定,表明目的片段已经成功克隆.将104～108拷贝反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度为102拷贝.本方法的建立为猪细小病毒感染的早期诊断奠定了基础.     

一株内源性猪细小病毒的分离与鉴定

本研究从不明病毒污染的ＰＫ１５细胞培养物中分离到了一株猪细小病毒,从形态学、血清学、分子生物学几个方面对其进行了鉴定,同时克隆了该毒株ＶＰ２基因,并测定了其核苷酸序列。将该毒株命名为ＳＹ－９９株。     

猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原捕捉ELISA方法的建立

为制备猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体(McAb),建立检测猪细小病毒的抗原捕捉ELISA方法 (AC-ELISA),本研究以原核表达的重组VP2蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA方法筛选,成功获得了2株能稳定分泌抗猪细小病毒VP2蛋白的McAb,命名为3C4、5F8。以多克隆抗体作为捕获抗体、单克隆抗体5F8作为检测抗体,通过双抗夹心ELISA各个反应条件的优化,建立检测猪细小病毒抗原捕捉ELISA方法。该方法与日本乙脑病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)均不发生交叉反应;与RT-PCR相比较,符合率、敏感性和特异性分别为93.6%、90.9%、94.4%。本研究建立的猪细小病毒AC-ELISA有良好的重复性、敏感性和特异性,可应用于猪细小病毒感染的早期诊断。