黑龙江省和海南省PWL基因家族在稻瘟病菌中的分布及变异

【目的】了解不同稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）菌株群体中PWL基因家族的分布和变异特征,为研究不同稻瘟病菌群体的遗传多样性及特异性提供依据。【方法】通过参考NCBI中公布的无毒基因序列分别对PWL基因家族的启动子区和CDS区设计特异性引物共8对,对2020年采自黑龙江省和海南省不同地区的397个稻瘟病菌单孢分离菌株提取DNA,进行无毒基因的PCR扩增并通过琼脂糖凝胶电泳检测,从检测结果中分别选取囊括不同地区的代表菌株对扩增片段进行测序分析。测序结果与NCBI中相应无毒基因启动子区和CDS区的碱基与氨基酸序列进行比较分析。【结果】在PCR电泳检测结果中,PWL1在所有菌株中均未检测出;PWL2、PWL3和PWL4在黑龙江省和海南省中均扩增出特异性片段,说明这3种基因在两省中均有分布并分别存在不同的分布频率与变异类型。其中PWL2在黑龙江省和海南省中分布频率最高,分别为98.14%和100%;PWL3和PWL4在两省中的分布频率具有显著差异,这2种基因在黑龙江菌株中频率分别为89.30%和82.79%,而在海南菌株中均为5.49%。通过对无毒基因组合进行分析,结果显示,组...     

稻瘟病菌无毒基因序列变异研究进展

稻瘟病是水稻生产上的重要病害,稻瘟病菌无毒基因与水稻抗病基因间符合基因对基因学说,当寄主的抗病基因产物直接或间接识别稻瘟病菌的无毒基因产物时,可激发寄主产生过敏性坏死反应。在病原菌的致病系统中,无毒基因不稳定,经常发生变异,无毒基因的变异导致其逃脱寄主抗病基因的识别,抗病品种丧失抗病性。因此,了解无毒基因的变异机制对于培育抗病品种是至关重要的。无毒基因的变异机制主要包括点突变、缺失、插入、复制、移码突变等。目前,无毒基因AVR1-CO39,PWL,AVR-Pita的变异机制报道较多,ACE1,Avr Piz-t,AVR-Pia,AVR-Pii,AVR-Pik/km/kp的变异机制报道较少。     

黑龙江省稻瘟病菌无毒基因的检测

为了探索黑龙江省稻瘟病菌无毒基因的分布情况,通过分子标记法对黑龙江省19个地区的204个稻瘟病菌的菌株进行PCR扩增,检测是否含有无毒基因Avr-pita、AVR-CO39、PWL2和PWL3。结果表明:各基因的出现频率差异较大,PWL2的出现频率较大,为52.94%,PWL3最低,出现频率为0,Avr-pita和AVRCO39的出现频率分别为39.22%和37.75%。黑龙江省稻瘟病菌的群体结构复杂,在不同地区甚至相同地区的菌株中无毒基因的存在情况都有明显的差异。     

PWL基因家族在稻瘟病菌中的分布及变异初探

PWL寄主特异性无毒基因家族是稻瘟病菌无毒基因中一个重要的类群,了解PWL家族成员在稻瘟病菌中的分布和变异对稻瘟病菌群体遗传多样性的研究具有重要价值。研究通过设计23对引物对PWL家族成员进行分布和变异分析,结果筛选到12对引物有特异性扩增结果。扩增结果表明PWL家族基因的主要变异为缺失,试验结果表明,PWL1基因仅存在于牛筋草来源的稻瘟菌菌株中存在,而在分离于水稻的稻瘟病菌中表现为完全缺失;与此相反,PWL2基因则仅在水稻来源的菌株中存在。而插入变异仅存在于部分菌株PWL4基因的上游区域。结果还表明PWL家族成员在稻瘟病菌中具有丰富的的扩增多态性,对稻瘟病菌群体遗传多样性的研究具有重要价值。     

黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t的检测与分析

【目的】检测黑龙江省稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t在不同地区、年份间流行菌株的分布情况与变异机制,了解其等位基因的致病表型,为黑龙江省抗瘟品种布局提供参考依据。【方法】利用NCBI中公布的无毒基因序列对3个无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t的基因全长和编码序列（coding sequence,CDS）分别设计特异性引物,将2016年和2017年采自黑龙江省不同地区335个稻瘟病菌单孢分离菌株的DNA进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测分析,并挑选不同带型和不同地区代表菌株的PCR产物进行测序。测序结果与相应无毒基因序列进行碱基与氨基酸序列的比较分析,并利用水稻抗性单基因系,对不同变异类型的稻瘟病菌菌株进行致病型测定。【结果】在PCR电泳检测中AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t均出现特异性条带,说明这3个无毒基因在黑龙江省均有分布,并以不同分布频率与突变类型出现。3个无毒基因平均扩增频率分别为75.52％、87.16％和85.67％。其中AVR-Pib通过电泳检测与PCR产物测序检测出4种带型（无带、高带、中高带与低带）和5种变异类型AVR-Pib（1-1、1-2、2、3、3-1）,基因型AVR-Pib-1-1、AVR-Pib-1-2、AVR-Pib-2和AVR-Pib-3-1为新发现的变异类型,其中基因型AVR-Pib-1-1和AVR-Pib-1-2均为转座子Pot2的插入,但插入位点不同;基因型AVR-Pib-2在阅读框上游存在小片段的插入;基因型AVR-Pib-3-1碱基序列与原序列比对有4处差异,即32（C/G）35（T/A）36（T/A）38（T/A）,导致氨基酸翻译提前终止。对检测到的5种等位基因型进行致病型测定,分析发现除正常基因型AVR-Pib-3外,其他变异基因型无毒功能均已丧失。而AVR-Pik经PCR产物测序检测出7种等位基因型,AVR-Pik（D、A、B、C、E、F、F2）,碱基序列的变化均导致氨基酸错义突变,7种等位基因型均已见报道。无毒基因AvrPiz-t通过电泳检测和PCR产物测序分析,发现2种带型（高带和正常带型）与4种基因型AvrPiz-t（A、B、C、D）,其中AvrPiz-t-A为正常基因型;基因型AvrPiz-t-B在191位处有碱基A的插入,导致氨基酸翻译提前终止;基因型AvrPiz-t-C为新发现的等位基因型,其特点在于与A类型存在17（T/C）和19位处碱基C的插入,发生移码突变翻译提前终止;高带型对应的无毒基因型AvrPiz-t-D经测序验证为Pot3转座子的插入。4种基因型菌株分别接种水稻单基因系发现,AvrPiz-t-A可以被Piz-t识别表现无毒,AvrPiz-t（B、C、D）均不能被Piz-t所识别而表现为有毒性。【结论】黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t分布较为广泛,且变异类型丰富,研究结果可为选育和推广携带相应抗病基因的水稻品种提供参考。     

辽宁省稻瘟病菌无毒基因型鉴定及分析

【目的】鉴定稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的无毒基因型,了解无毒基因在不同地区流行菌株中的分布情况,为品种布局提供参考。【方法】根据已经克隆且与稻瘟病菌致病性相关的6个无毒基因序列设计引物,选取辽宁省稻瘟病常发区的26株稻瘟病菌单孢菌株,提取各菌株DNA样本作为模板,进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳及PCR产物测序,对6个无毒基因PCR产物进行碱基和氨基酸序列的分析比较。对琼脂糖凝胶电泳未出条带的,设计不同引物进行验证性试验。【结果】在PCR产物电泳检测中,Avr1-CO39、Avr-pia和Avr-pii没有产物条带,对这3个无毒基因设计验证引物,其PCR产物电泳检测仍没有条带出现,其结果证明辽宁省各水稻主产区流行稻瘟病菌中多不携带Avr1-CO39、Avr-pia和Avr-pii;对于其他3个无毒基因 AvrPiz-t、Avr-pik和Avr-pita则有特异性扩增产物,说明这3个无毒基因在各稻区稻瘟病菌中以不同突变类型及不同频率出现。其中,与Pi2、Pi9和Piz-t对应的AvrPiz-t,分别在22个菌株的中被检测到,且有21个菌株的序列与其序列一致,说明该基因遗传相对稳定,也间接证明携带Pi2、Pi9和Piz-t 的水稻品种在辽宁地区的广谱抗性;与基因组序列不同的16号菌株,在DNA序列192 bp处发生一个单碱基C的缺失,从而导致移码突变,且碱基突变导致氨基酸序列至72位氨基酸时提前终止,而使该基因编码的蛋白质失去无毒基因的功能。与Pik、Pik-p、Pik-m和pik-s对应的Avr-pik,电泳检测结果表明各菌株均有特异性条带出现,经测序验证等位基因序列分为4种类型（B、D、F、G）,其中12个菌株携带可为Pik或其等位基因Pik-m和pik-p所识别的D类型;9个菌株携带B类型,该等位基因曾被报道,但是否具有无毒基因的功能仍未验证;另有2个菌株携带F类型等位基因,该基因为首次发现,并分别出现在丹东和盘锦地区。其特点在于与D类型基因间存在143（A/G）的碱基差异,氨基酸序列翻译结果显示其为错义突变,即48（G/D）;而其余3个菌株携带G类型等位基因,该基因亦属首次发现,且仅出现在抚顺新宾地区,碱基序列与D类型存在168（G/A）的差异,导致翻译提前终止,基因功能丧失。对于Avr-pita,26个菌株特异性扩增产物一致,但测序检测到5种等位基因类型,且均与Avr-pita有差异,碱基序列的变化多导致错义突变。这5种等位基因的氨基酸序列之间差异由3个氨基酸位点的差异所致,分别为83（D/N）、192（Y/C）和207（K/R）,3处突变均在基因结构域范围内,几种等位基因均已见报道。【结论】辽宁稻区流行稻瘟病菌中Avr-pik、AvrPiz-t和Avr-pita分布较为广泛,选育及推广携带相应抗病基因的水稻品种可减轻稻瘟病的危害。     

稻瘟病菌致病性变异

 利用日本单基因鉴别品种,研究云南原有稳定粳稻、籼稻及日本鉴别菌系的致病性,结果表明,稻瘟病菌的致病性变异方向复杂,但也有稳定的菌株存在,日本菌、云南籼稻菌和粳稻菌之间的致病性变也存在一定差异,提出了鉴别品种与菌株致病性的适合性.     

稻瘟病菌致病性变异研究

１９９７年对四川省东南部稻瘟病菌２３０个有效单孢菌株测定结果表明,病菌生理小种由４群１７个小种组成,以２８群小种为优势种群,出现频率为７０．２％。不同生态区及不同水稻品种间病菌生理小种组成有明显差异。同一水稻品种叶瘟和穗强。同一水稻品种不同叶片、不同病穗乃至同一叶片不同病斑间都可测出不同生理小种。     

稻瘟病菌二个无毒基因的初步分析

 分析了2个稻瘟病田间采集菌株Y95-223和Y94-64的杂交后代的54个菌株对合系35号、楚粳3号及日本鉴别品种新2号、梅雨明、PiNo.4和K60共11个水稻品种致病性测定结果。结果表明:陆稻菌株Y94-64对合系35号、楚粳3号、PiNo.4分别持有2个无毒基因,对新2号、K60分别持有一个无毒基因;菌株Y95-223对梅雨明持有一个无毒基因,因为Y95-223对梅雨明不致病,Y94-64对它致病,而杂交后代非致病菌株与致病菌株比为1∶1．     

稻瘟病菌致病性变异及稳定菌系的筛选

本文利用中国稻瘟病菌生理小种鉴别品种及日本的具已知基因鉴别品种,研究了日本的稻瘟病菌鉴别菌系,我国北方稻区辅助鉴别菌株及保存5～10年菌株的致病性。研究结果表明,菌株的致病性受其自身致病基因及环境因素等多方面影响,在众多的菌株中仍有稳定菌株存在。讨论了稻瘟病菌致病性变异性。提出了稻瘟病菌稳定菌株的筛选方法。     

Detection and Analysis of Magnaporthe oryzae Avirulence Genes AVR-Pib,AVR-Pik and AvrPiz-t in Heilongjiang Province

【Objective】The objective of this study is to investigate the distribution and variation mechanism of avirulence genes AVR-Pib, AVR-Pik and AvrPiz-t in Magnaporthe oryzae strains from different regions and years in Heilongjiang Province, to understand the pathogenic phenotypes of different avirulence gene alleles, and to provide a reference for utilization and distribution of resistance cultivars in Heilongjiang Province.【Method】Based on the avirulence gene sequences published in NCBI, specific primers were designed to amplify full length and the coding sequence (CDS) regions of three genes, respectively. From 2016 to 2017, 335 M. oryzae strains in different regions of Heilongjiang Province were collected and isolated, and their DNA was PCR-amplified using avirulence genes primers and analyzed by agarose gel electrophoresis. The PCR products with different band patterns and from representative strains of different regions were selected for sequencing. The sequencing results were compared with the corresponding avirulence gene sequences for base and amino acid. The pathogenic phenotype of M. oryzae strains with different variant types was determined based on the rice resistance to single-gene lines.【Result】The specific bands of AVR-Pib, AVR-Pik and AvrPiz-t were detected in PCR detection and appeared in different distribution frequencies and mutation types, indicating that these 3 avirulence genes were all distributed in Heilongjiang Province. The average amplification frequency of the 3 avirulence genes was 75.52%, 87.16% and 85.67%, respectively. Among them, 4 types of band (bandless, high band, mid to high band and low band) of AVR-Pib were detected by electrophoresis analysis and 5 variant types AVR-Pib (1-1, 1-2, 2, 3, 3-1) were detected by PCR product sequencing. The genotypes AVR-Pib-1-1, AVR-Pib-1-2, AVR-Pib-2 and AVR-Pib-3-1 are newly discovered variant types, of which genotypes AVR-Pib-1-1 and AVR-Pib-1-2 are insertions of transposon Pot2 but with different insertion sites. The genotype AVR-Pib-2 has a small fragment insertion in the upstream of CDS region. The genotype AVR-Pib-3-1 base sequence has 4 differences from the original sequence, namely 32 (C/G) 35 (T/A) 36 (T/A) 38 (T/A), and the amino acid translation was terminated prematurely. Pathogenic analysis showed that except for the normal genotype AVR-Pib-3, the other alleles lost their avirulence functions. Seven AVR-Pik alleles (D, A, B, C, E, F, F2) were detected after PCR product sequencing, and the alterations in the nucleotide sequences of these alleles all resulted in amino acid missense mutations. The 7 AVR-Pik alleles have been reported previously. The avirulence gene AvrPiz-t was analyzed by electrophoresis and sequencing of PCR products, and 2 types of band (high band and normal band type) and 4 genotypes of AvrPiz-t (A, B, C, D) were revealed. Among them, AvrPiz-t-A is the original genotype, while AvrPiz-t-B has a base A insertion at position 191, causing premature termination of amino acid translation. Genotype AvrPiz-t-C is a newly discovered allelic type, characterized by the presence of a nucleotide variation at position 17 (T/C) and the insertion of base C at position 19 compared with type A, leading to the frameshift mutation and premature translation termination. The high band type avirulent genotype AvrPiz-t-D was sequenced and verified as having an insertion of the Pot3 transposon. Rice single-gene lines infection showed that the strains with AvrPiz-t-A were avirulent to Piz-t line due to Piz-t recognition, whereas the strains with AvrPiz-t (B, C, D) were virulent to Piz-t line due to lost the ability recognized by Piz-t.【Conclusion】The avirulence genes AVR-Pib, AVR-Pik and AvrPiz-t of M. oryzae in Heilongjiang Province are widely distributed and the types of variation are abundant. The results of this study can provide a reference for breeding and popularizing rice cultivars with corresponding disease-resistance genes.     

江西省稻瘟病菌的无毒基因分析

以30个水稻抗稻瘟病近等基因系或单基因系为材料,在水稻苗期接种,测定来自江西省水稻产区195个稻瘟病菌单孢菌株的致病性。结果表明,江西省稻瘟病菌群体含有29个与测试抗病基因相对应的无毒基因,但未检测到无毒基因Avr-a(2),其中60.00%菌株表现出强致病性。病菌群体对抗瘟基因Pi-zt,Pi-1(1),Pi-z5和Pi-k表现出较低的毒力频率,表明这些抗瘟基因在江西省可作抗源单独或聚会使用。2006-2008年江西省稻瘟病菌群体中分别出现了24,27,29个无毒基因,其中有24个无毒基因在各年份均有分布,Avr-a(1),Avr-a(2),Avr-i,Avr-ks(1),Avr-ks(2),Avr-ta,Avr-b,Avr-t,Avr-sh(2),Avr-km,Avr-ta(C),Avr-ta2,Avr-kp(C),Avr-b(C),Avr-3(1)和Avr-5(t)等16个无毒基因的出现频率均低于30%,提示在江西省内与之相对应的抗瘟基因在抗稻瘟病育种中应慎用。江西省稻瘟病菌单孢菌株无毒基因组合数目为0～18个,数字相对较小。     

广东省侵染美香占2号的稻瘟病菌致病性及无毒基因变异分析

[目的]分析侵染广东稻区优质品种美香占2号稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的致病性及无毒基因变异特征,为美香占2号在不同稻区的合理布局提供参考依据.[方法]利用9个抗稻瘟病单基因系,对稻瘟病菌单孢分离菌株进行致病性测定;并利用8个稻瘟病菌已克隆无毒基因的功能性分子标记对2013-2018年不同年份、不同...     

黑龙江省稻瘟病菌遗传多样性研究

利用8个代表性菌株从153对引物组合中筛选出多态性高且稳定性好的10对引物组合,对来自黑龙江省各水稻主要产区的214个稻瘟病菌菌株进行RSAP(Restriction site amplified polymorphism)分析,得到134条多态性条带,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,得到196个不同单元型(带型)的代表性菌株的指纹图谱。用UPGMA进行聚类分析,以相似系数0.83为界,将214个菌株196个单元型划分为10个遗传宗谱,10个遗传宗谱在黑龙江省的分布存在明显地域差异。     

2011年鄂西地区水稻稻瘟病菌遗传多样性的分析

[目的]扩大鄂西地区稻瘟病菌菌库,分析其群体结构.[方法]收集鄂西不同地区2011年间的感病稻秆,分离保存稻秆上的穗颈瘟病菌,通过RAPD、rep-Pot2-PCR、REMAP 3种标记对分离的菌株进行分子标记.[结果]从9个稻秆上共分离得到29个稻瘟病菌.遗传多样性分析结果表明,相似性水平在75％时,2011年供试菌株可分为5个遗传宗谱,宗谱3（7个菌株）和4（19个菌株）为优势宗谱,其余3个为稀有宗谱.[结论] 2011年鄂西地区稻瘟病菌由5个遗传宗谱组成.     

谷瘟病菌无毒基因型鉴定及分析

【目的】鉴定不同地区谷瘟病菌（Magnaporthe oryzae）所含无毒基因的类型,确定无毒基因在菌株中的分布及变异情况,为深入研究谷瘟病菌无毒基因变异机制提供参考。【方法】从中国北方谷子主产区不同区域内采集并分离76个谷瘟病菌的单孢菌株,提取其基因组DNA,根据目前已成功克隆的稻瘟病菌的7个无毒基因的核苷酸序列设计特异性引物,进行PCR扩增及电泳检测,并对部分菌株的无毒基因进行测序分析。【结果】在76个谷瘟病菌中,无毒基因ACE1、Avr-pita、Avr1-CO39和AvrPiz-t的扩增率为100％,无毒基因Avr-pik、Avr-pia和Avr-pii的扩增率分别为63.2%、42.1%和21.1%。在谷瘟病菌菌株P11和P34中,Avr1-CO39的扩增条带较预期片段大490 bp,测序结果发现菌株P11和P34中的Avr1-CO39基因序列完全一致,均在启动子区插入了490 bp核苷酸,该插入序列与non-LTR retrotransposon: Mg-SINE的相似度达99.16％。Avr-pita的测序结果发现,谷瘟病菌菌株中的Avr-pita基因序列变异较为丰富,其变异形式主要为单核苷酸的变异,包括单碱基的插入、缺失及多位点的SNP。Avr-pia的变异类型主要为整个无毒基因的缺失,经测序验证等位基因序列分为4种类型。Avr-pia-A与参考序列（AB498873.1）一致,包含10个菌株;Avr-pia-B包含20个菌株,在-116、-109和-16 bp处分别存在C/T、G/T和C/A变异,但与参考序列的CDS区序列相同;Avr-pia-C仅包含菌株P10,在+150 bp处存在T/G变异,但为同义突变;Avr-pia-D仅包含菌株P18,在+212 bp位点处存在C/T变异,导致该变异位点由编码苏氨酸突变为编码异亮氨酸。谷瘟病菌Avr-pii包含3种等位基因类型。Avr-pii-A型与参考序列（AB498874.1）一致,共包含14个菌株;Avr-pii-B型和Avr-pii-C型分别在+139和+64 bp处存在A/G变异,核苷酸的变异导致该位点由编码苏氨酸改为丙氨酸。Avr-pii-B型和Avr-pii-C型变异均为首次报道。单元型分析表明,AG2包含23个菌株,占供试菌株的30.2%,为优势单元型。【结论】明确了不同地区的谷瘟病菌中无毒基因ACE1、Avr-pita、Avr1-CO39和AvrPiz-t不存在地理来源的差异;而无毒基因Avr-pik、Avr-pia和Avr-pii在各地分布有差异。谷瘟病菌AG2单元型为优势单元型,其次是单元型AG1和AG5。     

黑龙江省和吉林省稻瘟病菌种群多样性研究

为明确黑龙江和吉林省稻瘟病菌种群多样性,采用Pot2-Rep-PCR方法对来自黑龙江省和吉林省部分稻区49个稻瘟病菌菌株的DNA进行指纹分析。研究结果表明,供试的稻瘟病菌种群在DNA水平上变异较大,存在丰富的多态性;在20个遗传谱中第2个谱系为优势谱系,包含黑龙江省11个菌株,吉林省9个菌株,其他19个系谱的菌株数为1~10个不等。谱系3菌株既是黑龙江省菌株,又是黑龙江省特有的谱系类型。聚类分析结果表明,参试稻瘟菌株遗传多样性程度(系谱数/菌株数)黑龙江省(7/23=0.304 3)、吉林省(11/26=0.423 0),吉林省稻瘟病菌的多样性要强于黑龙江省稻瘟病菌。