瓜实蝇普通气味结合蛋白基因的克隆及原核表达

利用RT-PCR和RACE方法克隆获得瓜实蝇Bactrocera cucurbitae (Coquillett)普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)基因的cDNA全长序列,命名为BcucOBP.测序结果表明,BcucOBP开放阅读框全长447 bp,编码149个氨...     

铜绿丽金龟气味结合蛋白AcorOBP11的表达纯化及功能分析

[目的]通过研究铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)气味结合蛋白11(odorant binding protein 11,OBP11)与寄主植物挥发物的结合特性,探讨AcorOBP11的功能,为阐明铜绿丽金龟识别寄主植物的嗅觉分子机制打下基础.[方法]设计特异性引物,通过RT-PCR克隆AcorOBP1...     

柑橘大实蝇非典型气味受体基因的克隆、序列分析及组织表达模式

旨在探究柑橘大实蝇(Bactrocera minax)非典型气味受体(odorant receptor co-receptor,Orco)基因的分子特征和组织表达模式,通过对前期获得的柑橘大实蝇成虫转录组数据分析,利用RT-PCR技术克隆柑橘大实蝇Orco基因,并对该基因进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检...     

南瓜实蝇气味结合蛋白基因鉴定及组织分布

[目的]克隆南瓜实蝇(Bactrocera tau)的气味结合蛋白(odorent binding proteins,OBPs)基因,并分析其相关生物学信息,为了解南瓜实蝇的嗅觉机制提供参考.[方法]基于南瓜实蝇转录组测序结果筛选获得OBPs基因并进行生物信息学分析,通过基因克隆测序验证鉴定OBPs基因,并采用sqRT...     

斑翅果蝇气味结合蛋白OBP56h与小分子化合物的结合特征

【目的】克隆斑翅果蝇（Drosophila suzukii）气味结合蛋白56h（odorant binding protein 56h,OBP56h）基因,诱导表达斑翅果蝇OBP56h重组蛋白(DsuzOBP56h),研究其与小分子化合物的结合特性。【方法】通过RT-PCR并设计特异性引物克隆斑翅果蝇OBP56h ORF全长,从NCBI数据库中下载相似度高的昆虫气味结合蛋白序列,进行序列比对和分析。以NdeⅠ和XhoⅠ为酶切位点,将OBP56h连入pET-30a(+)原核表达载体,将重组质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞。扩大培养阳性菌株,并用IPTG诱导表达DsuzOBP56h重组蛋白。收集菌液,通过超声波破碎细胞得到蛋白,利用Ni-NTA柱纯化蛋白,进行Tris-HCl透析,用BCA法测定蛋白浓度。蛋白用50 mmol·L ^-1 Tris-HCl（pH 7.4）稀释至终浓度2 μmol·L ^-1,配基用色谱级甲醇稀释至终浓度1 mmol·L ^-1,以4,4′-二苯胺基-1,1′-联萘-5,5′-二磺酸二钾盐（4,4′-dianilino-1,1′-binaphthyl-5,5′-disulfonic acid dipotassium salt,bis-ANS）荧光探针为报告子,利用荧光竞争结合试验检测DsuzOBP56h蛋白与18种候选小分子化合物配基的结合特性。 【结果】克隆获得了斑翅果蝇OBP56h的ORF全长,共405 bp,N-端含有19个氨基酸组成的信号肽,具有6个保守半胱氨酸位点,符合OBP的典型特征,与其同属的黑腹果蝇OBP56h进化关系最近。成功连入pET-30a(+)表达载体,在1 mmol·L ^-1IPTG、28℃条件下诱导DsuzOBP56h蛋白表达,并过柱纯化得到目的蛋白。荧光光谱试验显示,荧光探针bis-ANS与DsuzOBP56h的解离常数为0.9568 μmol·L ^-1,适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子;进一步的荧光竞争结合试验表明,在18种候选配基中,苦味物质盐酸小蘖碱和香豆素与DsuzOBP56h的结合亲和性较强,解离常数分别为12.16和17.93 μmol·L ^-1,柚皮素与DsuzOBP56h的解离常数为25.32 μmol·L ^-1,草莓叶片产生的一种对斑翅果蝇具有吸引作用的挥发性气味物质β-环柠檬醛也能与DsuzOBP56h结合,其解离常数为31.37 μmol·L ^-1。【结论】斑翅果蝇气味结合蛋白OBP56h能与测试的多种植物苦味物质和挥发性气味物质结合,表明DsuzOBP56h很有可能参与斑翅果蝇对食物味觉和嗅觉的识别行为,研究结果可为理解斑翅果蝇的取食行为提供理论依据,并为开展斑翅果蝇的生态防控提供新思路。     

沙葱萤叶甲气味结合蛋白GdauOBP20的基因克隆、 原核表达及其结合特性

【目的】 沙葱萤叶甲（Galeruca daurica）是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础。【方法】 基于沙葱萤叶甲转录组数据,利用RACE技术对沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20进行cDNA全长克隆;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;通过原核表达系统表达目的蛋白,并使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行重组蛋白纯化。最后采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN）为荧光探针,检测GdauOBP20重组蛋白与13种主要寄主挥发物的结合情况。【结果】 GdauOBP20的cDNA全长序列为567 bp（GenBank登录号MK250532）,其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构;开放阅读框（ORF）全长为420 bp,编码139个氨基酸。氨基酸序列中含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。预测蛋白三级结构中含有6个α螺旋和两对由半胱氨酸形成的二硫键。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合常数为12.8 μmol·L ^-1,结合能力较好,可作为本试验的荧光报告子。在所测的13种主要寄主植物挥发物中,除与二烯丙基三硫醚无结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯和环庚三烯的结合能力最强,解离常数分别为22.91和26.55 μmol·L ^-1,而与月桂烯结合能力最弱,解离常数为116.29 μmol·L ^-1。【结论】 沙葱萤叶甲GdauOBP20能与寄主植物的多种主要挥发性物质结合,推测其可能在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中发挥重要的作用。     

柑橘大实蝇成虫的时空分布与产卵规律

通过实地调查,观察并分析了柑橘大实蝇Bactrocera(Tetradacus)minax(Enderlein)成虫在柑橘园及其附近杂树林的觅食产卵活动规律。结果表明:在柑橘大实蝇羽化开始到羽化盛期,以柑橘园与杂树林交界区域的成虫密度最大,并于6月11日达到高峰,在Z3监测带(杂树林与基准带相距5m)每个诱捕罐的诱捕虫数为(24.0±5.6)头,J1监测带(柑橘园与基准带相距5m)为(74.7±21.9)头,显著高于其他监测带;羽化盛期60%以上的柑橘大实蝇成虫在Z3监测带和J1监测带的交界带内活动;羽化盛期过后的产卵期,诱捕虫数明显下降,且柑橘大实蝇在柑橘园中的分布比较均匀,Z1监测带(杂树林与基准带相距100m)没有诱到成虫,其他不同监测带的诱捕虫数也没有显著差异;柑橘大实蝇产卵时对果实的不同部位具有明显的选择偏好性,其中果腰处的产卵痕数量分别是果蒂和果脐处的7倍和4倍,而且果实阴面的产卵痕数量显著高于阳面,是阳面的7倍;柑橘大实蝇对柑橘果实所处的空间位置没有明显偏好。     

烟夜蛾气味结合蛋白的同源模建

[目的]预测烟夜蛾(Helicoverpa assulta)的气味结合蛋白。[方法]用同源模建的方法构建烟夜蛾(Helicoverpa assulta)气味结合蛋白的三维结构,并用Procheck、Verify_3D、Errat、ProSa2003等程序进行评价。[结果]程序评价结果表明模建结构是可靠的。模建结构显示烟夜蛾的气味结合蛋白由6个α-螺旋和连接这些螺旋的回折构成,底物结合口袋成锥形;6个保守的半胱氨酸形成3个对结构起稳定作用的二硫键。[结论]预测结构可靠,为烟夜蛾的研究及虫害的防治提供了理论依据。     

柑橘大实蝇的危害和防治

在湖北省秭归县,柑橘大实蝇主要是对柑橘类产生危害,尤其是脐橙与杂交橙。一旦出现柑橘大实蝇这一病虫害,将对柑橘产量造成严重的影响。因为该病虫害发生面积相对较大,危害损失严重,致使果农遭受了严重的经济损失。基于此,文章以柑橘大实蝇为研究重点,阐述其危害与防治措施,希望对降低柑橘大实蝇带来的危害有所帮助。     

柑橘大实蝇滞育型与非滞育型蛹的代谢谱比较

【目的】明确柑橘大实蝇（Bactrocera minax）滞育型（D）与非滞育型（ND）蛹各自在不同时间点之间的代谢谱差异,以及相同时间点上D型与ND型蛹之间的代谢谱差异。此外,发掘在不同对比组合中具有显著差异的代谢物种类。【方法】在化蛹后1 d内,注射20E溶液解除滞育,获取ND型蛹;注射10%乙醇溶剂获取对照D型蛹。在注射后1、15和30 d收集两种类型的蛹,利用核磁共振（NMR）技术对样品进行检测。运用Chenomx软件将NMR谱图信号与数据库逐一比对分析,确定代谢物种类和对应的浓度。再使用偏最小二乘判别分析法（PLS-DA）进行数据分析,明确D1对D15对D30、ND1对ND15对ND30、D1对ND1、D15对ND15、D30对ND30共5个对比组合之间的代谢谱差异。最后结合变量投影重要性分析（VIP）和单因素方差分析或t检验,发掘在不同对比组合中具有显著浓度差异的代谢物种类。【结果】 在所有样品中,共获得50种代谢物及其浓度。其中,氨基酸及其衍生物20种、有机酸11种、糖类4种、核酸组分5种,其他代谢物10种。PLS-DA分析表明,D型蛹在3个时间点之间代谢谱差异显著;ND型蛹在注射后15 d和30 d之间代谢谱无显著差异,但两者均与注射后1 d之间差异显著;在3个不同时间点上,D型与ND型蛹之间代谢谱均差异显著。VIP分析和单因素方差分析或t检验结果表明,共有21种代谢物浓度至少在一个对比组合中呈现显著差异,其中,D1对D15对D30组合中有10种;ND1对ND15对ND30组合中有12种;D1对ND1组合中有6种;D15对ND15组合中有12种;D30对ND30组合中有8种。柠檬酸、葡萄糖、麦芽糖、脯氨酸、海藻糖、谷氨酸、天冬酰胺和N-乙酰谷氨酸出现显著差异的次数最多。【结论】出现显著差异次数最多的代谢物中,柠檬酸、葡萄糖、麦芽糖、脯氨酸、海藻糖、谷氨酸和天冬酰胺能直接或间接进入三羧酸循环,说明柑橘大实蝇滞育期间能量代谢和物质转化产生了显著的变化。此外,海藻糖、脯氨酸、N-乙酰谷氨酸和肌醇的显著差异有助于调控柑橘大实蝇滞育期间的耐寒性。研究结果可为后续解析重要代谢物及相关生理途径在柑橘大实蝇滞育中的作用机理提供依据。     

桃小食心虫化学感受蛋白CSP16配体结合特性

[目的]桃小食心虫(Carposinasasakii)是我国北方果树生产中的重要害虫之一,本文通过体外表达桃小食心虫化学感受蛋白CsasCSP16,明确其与寄主挥发物分子和性信息素分子的结合特性,并通过生物信息学预测CsasCSP16与挥发物分子结合的关键氨基酸位点,为揭示桃小食心虫嗅觉的分子机理提供理论依据.[方法]...     

中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP7的表达及结合特性

[目的]中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)是我国本土蜂种,也是重要的传粉昆虫和经济昆虫.气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)是蜜蜂嗅觉感知中的关键蛋白.在前人对中蜂AcerOBP7基因序列特征分析的基础上,本研究进一步对其表达特性及与气味物质的结合能力进行探究,...     

桔小实蝇takeout基因的克隆和序列分析及时空表达

采用RT-PCR及RACE技术克隆了桔小实蝇(Bactrocera dorsalis(Hendel))takeout基因的cDNA全长序列,命名为BdorTO。测序结果表明:BdorTO开放阅读框全长747 bp,编码248个氨基酸,相对分子质量约为28.15×103,等电点为5.29。Signal P软件分析表明,该蛋白N端具21个氨基酸的信号肽,为分泌型蛋白。氨基酸序列比对表明,BdorTO蛋白与其他昆虫TO蛋白的序列一致性较低,其中与刺舌蝇(Glossina morsitans)的序列一致性最高,一致性值为48.6%。荧光定量PCR分析表明,BdorTO在触角中的表达量最高,推测BdorTO可能参与了桔小实蝇嗅觉感受过程;在雄虫生殖节中的表达量明显高于雌虫生殖节,提示BdorTO可能与桔小实蝇雄虫的生殖生理过程密切相关。