蒺藜苜蓿MtMYB16基因克隆、表达及转录自激活分析

植物中MYB转录因子数量众多,功能多样,在植物生长发育、逆境响应等多方面发挥着重要作用。为研究MYB转录因子在蒺藜苜蓿中的功能,本研究采用PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆MtMYB16基因,该基因开放阅读框1074 bp,共编码357个氨基酸。进化树分析结果显示,MtMYB16蛋白与白花草木樨中MYB蛋白同源性最高。亚细胞定位结果显示,MtMYB16蛋白定位在细胞核中。酵母自激活检测结果显示,MtMYB16蛋白具有自激活活性,自激活结构域位于C端。表达分析结果显示,MtMYB16在蒺藜苜蓿根、茎、叶、花、果实中均有表达,在根中表达水平最高;IAA、MeJA能够降低MtMYB16表达水平;盐胁迫和干旱胁迫下,MtMYB16表达量在1.0 h时迅速增加,说明MtMYB16可能具有响应盐及干旱胁迫的功能。     

蒺藜苜蓿MtNSN1的克隆与功能分析

核干因子(NS)是一类广泛存在于动物细胞核中的GTP结合蛋白,主要参与胚的形成和细胞增殖,对维持细胞周期具有重要作用。本研究旨在初探蒺藜苜蓿MtNSN1的表达模式及其对生长发育的调控功能。克隆获得蒺藜苜蓿MtNSN1基因cDNA全长2193bp,其中开放阅读框为1800bp,编码599个氨基酸,蛋白分子量133.7kDa。进化树分析显示MtNSN1与大豆NSN1的氨基酸同源性为66.67%。组织器官表达分析表明,MtNSN1在蒺藜苜蓿花中表达量最高,根次之,叶中表达量最低。RNA原位杂交的结果显示该基因主要在蒺藜苜蓿生长发育活跃的茎尖分生组织及其周围的幼嫩叶中表达。MtNSN1转化野生型拟南芥得到超表达植株,通过统计分析表明超表达植株的主根长度和叶片数量都明显优于野生型。在超表达植株中5个细胞周期标记基因的表达水平均比野生型拟南芥显著上调;利用DNA化学诱变剂博来霉素对植株进行处理,发现超表达植株的根系受抑制程度小于野生型。以上结果表明,MtNSN1与蒺藜苜蓿茎尖分生组织的维持及地上、地下器官的发育有关,同时异源表达MtNSN1在转录水平上影响拟南芥细胞周期的表达。     

蒺藜苜蓿LEA基因家族全基因组分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)是一类在种子胚胎发育后期特异表达并受发育阶段及脱水信号调节的脱水保护蛋白,在响应植物干旱、低温、高盐等逆境胁迫中具有重要功能。本研究利用生物信息学手段,在全基因组水平对蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)LEA基因家族进行分析,并对其进化、基因结构、进化压力、染色体定位及基因表达模式进行了系统分析。本研究共筛选出23个蒺藜苜蓿LEA家族基因,可分为8个亚家族。基因定位结果表明,23个蒺藜苜蓿LEA基因分布于除6号染色体外的其他7条染色体上,但分布不均匀;家族成员外显子数目都不超过两个,结构简单。不同组织表达谱分析结果显示,LEA家族基因具有不同的组织表达模式,并受干旱逆境胁迫调控。本研究结果可为蒺藜苜蓿LEA基因家族的功能分析奠定基础。     

蒺藜苜蓿PYL基因家族的全基因组鉴定、表达和功能分析

脱落酸(ABA)是一种内源性激素,在调节植物的生长发育、非生物胁迫和生物胁迫反应方面发挥着重要作用。Pyrabactin resistance 1-like(PYR/PYL)蛋白在ABA信号传导途径中起核心调控作用。然而,在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中并没有关于这个家族的细节。本研究根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的14个PYL基因,利用BLAST方法鉴定蒺藜苜蓿基因组中的PYL家族成员。结果表明,鉴定得到14个蒺藜苜蓿PYL基因家族成员,且所有成员均含有PYR-PYL-RCAR-like功能域。预测启动子中的顺式元件发现所有蒺藜苜蓿PYL基因家族成员均含有与胁迫以及激素相关的元件。基因本体论(GO)富集分析与KEGG通路分析显示其主要参与到脱落酸信号通路及对外界刺激的反应。基因表达模式分析显示,其在逆境胁迫下表现出特定的表达模式。本研究为进一步研究蒺藜苜蓿PYL基因奠定了基础。     

蒺藜苜蓿MtCKX基因功能的初步鉴定

采用RT-PCR法克隆了蒺藜苜蓿MtCKX基因,基因编码区长1635bp,编码544个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码的蛋白与其他物种CKX蛋白具有较高的同源性,与鹰嘴豆的同源性最高。荧光定量分析结果表明,MtCKX基因在蒺藜苜蓿叶片中的表达量最高。此外,MtCKX基因还响应IAA、6-BA的诱导。成功构建了35S::MtCKX:YFP植物表达载体,亚细胞定位分析表明,MtCKX定位于细胞膜和细胞核。过表达的蒺藜苜蓿MtCKX基因可导致转基因拟南芥中细胞分裂素含量显著降低。     

EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物离子吸收和分配的影响

为探究苜蓿属植物的抗盐机理及外源油菜素内酯(EBR)对苜蓿属植物抗盐性的影响,选取蒺藜苜蓿、紫花苜蓿和金花菜3种苜蓿属植物为实验材料,研究NaCl胁迫及NaCl胁迫下喷施EBR对苜蓿属植物生长,体内无机离子吸收、分配及运输的影响。结果表明:1)NaCl胁迫会抑制苜蓿属植物的生长,影响植物体内K+、Ca2+、Mg2+离子的分配和运输。2)EBR能有效缓解NaCl胁迫对植物生长的抑制作用,维持植物体内的离子平衡,从而提高植物的耐盐性。3)紫花苜蓿耐盐性较强,蒺藜苜蓿耐盐性较弱。4)在盐胁迫条件下,紫花苜蓿根部抑制对Na+的吸收,减少离子毒害作用;蒺藜苜蓿将根中的Na+向茎和叶中运输,通过叶片的脱落,维持生长点的正常生长。     

蒺藜苜蓿E3泛素连接酶U-box基因克隆及表达分析

泛素化在植物生长和发育过程中起重要作用,E3泛素连接酶负责对靶蛋白特异性识别,其中U-box结构的E3泛素连接酶具有调控植物生长发育和免疫反应等功能,并在抗逆性方面发挥作用。目前,关于蒺藜苜蓿U-box家族基因的研究尚未见报道。本研究从蒺藜苜蓿中克隆得到U-box(MtPUB4)基因,该基因cDNA全长2448bp,编码815个氨基酸,包括1个U-box结构(C-X2-H-X7-C-X7-C-X2-C-H-X2-H)和5个ARM结构域,属于U-box/ARM类型E3泛素连接酶。构建原核表达载体pET-MtPUB4,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明在大肠杆菌中表达了MtPUB4蛋白。荧光定量PCR分析表明MtPUB4基因在蒺藜苜蓿花中的表达量最高,在根中表达量最低。MtPUB4基因受到NaCl、聚乙二醇、脱落酸诱导,随着诱导时间增加,表达量呈现出增长趋势。这些结果表明,MtPUB4基因在蒺藜苜蓿生长发育和抗逆性中可能起到重要调节作用,但在低温胁迫中表达量稍微下降,变化不明显。本研究成功构建了pBI121-MtPUB4植物表达载体,为进一步转化拟南芥突变体Atpub4奠定了基础。     

蒺藜苜蓿全基因组中U-box基因家族的筛选与特征分析

植物基因组中广泛存在U-box基因,其编码蛋白大部分作为泛素系统中决定底物特异性识别的E₃泛素连接酶,广泛地调控植物生长生殖发育以及响应逆境胁迫等过程。本文利用蒺藜苜蓿基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定蒺藜苜蓿U-box家族基因;采用MEGA6软件进行系统进化树分析;通过GSDS在线工具和Mapinspect软件进行基因结构及染色体定位分析;利用已有的蒺藜苜蓿芯片数据进行组织表达和胁迫响应表达分析。结果表明,蒺藜苜蓿基因组中含有41个U-box基因,不均匀地分布于蒺藜苜蓿的8条染色体上。根据结构域组成和系统进化分析将这些U-box蛋白分成6类。基因表达模式分析发现,该家族成员的表达具有一定的组织特异性,并能响应盐、干旱和氮素胁迫。这些研究结果为蒺藜苜蓿U-box基因家族的功能分析奠定了基础。     

西藏野生垂穗披碱草EnPLA1基因克隆与表达分析

为探究α-亚麻酸调控植物低温胁迫应答的分子机制,本研究从西藏野生垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb.）中克隆了其合成酶磷脂酶基因（EnPLA1）,对其进行生物信息学、基因表达模式和亚细胞定位分析,并采用外源添加的方法分析α-亚麻酸在西藏野生垂穗披碱草低温适应中的作用。结果表明：EnPLA1基因的编码序列（Coding sequence,CDS）全长为1 305 bp,编码434个氨基酸;分子量为47.44 KD,等电点为6.05;EnPLA1蛋白为亲水性蛋白且偏酸性,含有1个高度保守的Lipase（class 3）结构域和4个跨膜结构域;二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主;EnPLA1蛋白与粗山羊草（Aegilops tauschii subsp. Tauschii）,圆锥小麦（Triticum turgidum subsp.Durum）,大麦（Hordeum vulgare subsp.Vulgare）的氨基酸序列相似性达80.76%,且该蛋白主要定位在细胞质。EnPLA1基因在垂穗披碱草的根、茎、叶中均有表达,其中叶中表达高于茎和根;低温诱导叶和茎中EnPLA1基因表达（P<0.05）,对根中表达影响较小;25 μM α-亚麻酸处理显著地提高植物的抗寒性。本研究为深入地阐明EnPLA1基因调控垂穗披碱草低温适应机制奠定基础,并为利用优良野生种质资源改良牧草及作物提供思路。     

干旱胁迫下黄花苜蓿与蒺藜苜蓿两个抑制性差减杂交文库的构建及分析

水分胁迫是植物面临的最主要的非生物胁迫之一,研究植物的抗旱机理以提高植物的抗旱能力具有重大的意义。抑制性差减杂交是一种筛选特异表达基因的良好手段,使用该方法成功构建了豆科植物黄花苜蓿和蒺藜苜蓿2个差减文库并进行测序。通过GO分类和KEGG分析等手段对文库中序列进行分类,并分析表达序列的差异,发现黄花苜蓿文库中对抵抗水分胁迫起积极作用的基因表达序列明显多于蒺藜苜蓿。此外,还对筛选到的2个基因在2种苜蓿中的干旱响应表达模式进行了分析,结果表明,在黄花苜蓿中这2个基因的表达更加有利于响应和抵抗干旱。这些结果在分子层面上一定程度的解释了黄花苜蓿较蒺藜苜蓿更加抗旱的原因。     

全基因组水平蒺藜苜蓿CPP基因家族的鉴定及表达模式分析

CPP （cysteine-rich polycomb-like protein）基因家族是一类小转录因子，广泛存在于除酵母与原核生物外的各种生物体中，在植物生长发育及响应胁迫过程中具有重要作用。截至目前，CPP基因家族已在多个物种中被鉴定和研究，但在豆科模式植物蒺藜苜蓿中还未见报道。本研究采用生物信息学的方法，在蒺藜苜蓿中共鉴定出9个CPP基因。通过与3个物种CPP基因的蛋白序列构建系统发育树，将CPP基因分为3类，MtCPP成员与大豆的亲缘关系更接近。保守结构域分析表明MtCPP转录因子都具有1~2个CXC保守结构域。染色体定位分析得出，9个CPP基因分布在6条染色体上，并鉴定出2对旁系同源基因，均来源于片段重复事件。通过基因芯片技术检测MtCPP基因的表达模式结果显示，MtCPP基因的表达具有一定的时空特异性。MtCPP基因启动子中含有大量与激素以及胁迫相关的顺式作用元件，并且MtCPP2、MtCPP5、MtCPP6和MtCPP7基因具有响应干旱的表达特征，MtCPP2和MtCPP8基因具有响应盐胁迫的功能。该研究可为后期深入解析MtCPP基因家族功能和筛选参与苜蓿抗逆的MtCPP基因奠定基础。     

紫花苜蓿atpA基因的克隆及表达模式分析

叶绿体atpA基因位于ATP合酶的CF₁上，编码α亚基，是光合作用不可缺少的关键基因。本研究利用RT-PCR技术，从‘新疆大叶’苜蓿（Medicago sativa L.‘Xinjiang Daye’）中克隆出atpA基因，并进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR技术进行基因表达模式检测。结果显示，MsatpA基因编码510个氨基酸，相对分子质量为55.71 KD，等电点为5.22。MsAtpA蛋白含有多个磷酸化位点且无跨膜结构和信号肽，二级结构中α-螺旋占比最高；亚细胞定位预测该基因编码的蛋白位于叶绿体中，与同为豆科苜蓿属的黄花苜蓿（Medicago falcata）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的AtpA氨基酸序列同源性较高。表达模式检测结果显示，MsatpA基因在叶中的表达量最高，根中最少；结荚期的基因表达量显著高于其他发育时期；MsatpA基因响应低温、高温、盐和渗透胁迫应答，且呈现出不同的表达特点。研究结果为紫花苜蓿atpA基因功能研究奠定基础。     

低磷胁迫对崖州硬皮豆生长及酸性磷酸酶活性的影响

本试验为探究硬皮豆（Macrotyloma uniflorum）对低磷胁迫的响应机制,以‘崖州硬皮豆’为材料,采用水培方法,分析了不同磷浓度（5 μM,100 μM和250 μM KH₂PO₄）处理对硬皮豆生长和生理特性的影响。结果表明：与100 μM和250 μM磷处理相比,5 μM低磷处理抑制了硬皮豆株高、复叶数、叶面积、总根长,根表面积和根体积以及植株干重。同时,5 μM磷处理显著降低了地上部和根部磷含量、降低了叶片和根系可溶性磷含量和细胞壁磷含量;与100 μM和250 μM磷处理相比,5 μM磷处理增加了叶片和根系总酸性磷酸酶（Acid phosphatase,ACP）活性和细胞壁ACP活性;5 μM磷处理下叶片和根系总ACP活性是250 μM磷条件下的1.5~1.6倍,而叶片和根系细胞壁ACP活性是250 μM磷条件下的1.2~1.3倍。因此,提高酸性磷酸酶活性可能是硬皮豆响应低磷胁迫的重要机制。     

发根农杆菌介导的白花草木樨毛状根转化体系的建立

白花草木樨（Melilotus albus Medic.ex Desr.）是草木樨最常见的栽培用种之一，具有较强的抗逆性和固氮能力。为了开发一套高效的草木樨转化体系，本研究以白花草木樨为材料，以结瘤基因MaROP6为目的基因，建立了发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的高效白花草木樨毛状根转化体系。结果表明：利用该方法可以在两周左右获得毛状根，其发生率可达78%，MaROP6基因的毛状根转化率可达70.8%。qRT-PCR鉴定结果表明，MaROP6转基因毛状根的平均相对表达量为对照的36.87倍。毛状根转化体系的建立为白花草木樨基因功能的验证奠定了基础。     

多年生黑麦草LpPIL5基因特征分析及转录调控

光敏色素互作因子(PIFs)属于bHLH家族的一个亚家族,在植物光信号、激素信号传导和调控植物耐逆性等方面发挥重要作用。本研究从多年生黑麦草中克隆出一个PIF基因,其与拟南芥AtPIF5的亲缘关系最近,因此命名为LpPIL5-like(LpPIL5)。LpPIL5基因编码区序列(CDS)全长为1410 bp,具有5个外显子,编码470个氨基酸,具有典型的bHLH结构域和APB功能域,且其蛋白定位于细胞核。LpPIL5的启动子区域(1500 bp)具有ABRE、MBS和G-box等多种光、激素和逆境响应顺式作用元件。表达模式分析结果显示LpPIL5在叶片中表达量较高,而在根、茎、叶鞘等部位表达量较低。LpPIL5基因的表达受昼夜节律调控,且在光下的表达量显著高于黑暗。此外,聚乙二醇(PEG)、NaCl、CdCl₂和高温逆境及6-苄基腺嘌呤(6-BA)和脱落酸(ABA)等激素处理显著抑制了叶片中LpPIL5基因表达,而在根中,LpPIL5基因的相对表达量在处理的12 h后明显增加,处理24 h时,显著高于对照。     

解淀粉芽孢杆菌DGL1促燕麦生长分子机制及代谢通路探究

分离自青海大格勒干旱沙地的解淀粉芽孢杆菌DGL1(Bacillus.amyloliquefaciens)被证实能够促进青海本地燕麦(Avena sativa)品种‘青燕1号’的生长。为了揭示DGL1促进燕麦生长的分子机制,本研究通过Illumina高通量转录组测序技术分析燕麦根部与菌株DGL1菌悬液分别互作2h,4h,8h,12h的处理组与对照组(CK)间的转录组差异表达基因,并通过GO富集、KEGG Pathway富集分析燕麦地上部分差异表达基因的相关代谢通路及关键基因。结果表明：燕麦根部与DGL1菌悬液互作2h,4h,8h和12h,燕麦叶部分别有1894,6130,8033和12215个差异表达基因,显著富集在氨基酸代谢、植物光合作用、次级产物代谢通路和与燕麦生长发育调控等相关代谢途径;通过KEGG富集分析发现IAA合成的色氨酸代谢途径中生长素早期响应蛋白编码基因AUXI、茉莉酸信号途径中核心受体编码基因COI1,铵转运蛋白编码基因AMT等基因显著上调,推测菌株DGL1对燕麦的促生机制是通过促进燕麦光合作用、激素代谢、次生代谢物合成、氨基酸代谢等多个途径相互协调的结果。     

蒺藜苜蓿耐酸铝性状的全基因组关联分析

铝毒害是酸性土壤耕种的主要限制因素,每年造成大量作物减产。蒺藜苜蓿是紫花苜蓿的一年生近缘种,广泛分布于世界各地,是紫花苜蓿遗传改良的重要基因资源。本研究利用蒺藜苜蓿群体的耐酸铝性状差异,进行全基因组关联分析,筛选蒺藜苜蓿耐酸铝性状相关的遗传位点,共得到58个与蒺藜苜蓿耐酸铝性状相关的SNP标记。对其周围基因进行功能注释分析,发现这些SNP位点主要参与苜蓿的细胞壁、脂质代谢、环境胁迫响应过程、氧化还原反应过程以及小分子转运等过程。最后,通过基因组选择方法将发掘SNP标记应用到蒺藜苜蓿耐酸铝性状的预测,预测准确性达到0.80,这说明本研究发掘的SNP标记可以用于蒺藜苜蓿及其近缘物种紫花苜蓿耐酸铝性状的遗传改良。     

紫花苜蓿配子体发育遗传调控的研究进展

紫花苜蓿种子的实际产量远低于潜在产量,胚珠败育是导致这一现象的主要因素,而胚珠败育从本质上讲就是雌、雄配子体发育不正常。所以,紫花苜蓿的配子体发育与其产量具有极为重要的关系。紫花苜蓿的雄蕊和心皮分别属于第三、四轮花器官。这2个组织生成的雄、雌配子体是紫花苜蓿完成有性生殖所必需的。本研究在总结拟南芥、水稻和玉米等模式植物配子体遗传调控的基础上,紧密结合豆科模式植物蒺藜苜蓿等配子体的发育,从遗传学、分子生物学和细胞学等角度详细地总结了紫花苜蓿有性生殖中雌配子体、雄配子体发生和发育的研究进展。