非洲猪瘟的流行及防与控

正非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是目前全球养猪业三大重点疫病之一,也是目前热点动物疫病之一。它是由非洲猪瘟病毒(African swine fever Virus,ASFV)引起的一种截止到目前人类仅知的病毒基因组为DNA的虫媒型、强传染性、热性、高度接触性的动物传染病。其宿主范围囊括了所有的猪科动物;野猪和钝圆软蜱是ASFV感染的自然宿主,而家猪是最易感的宿主;在非洲成年疣猪只表现     

非洲猪瘟病毒 CP204L 基因的生物信息学分析、载体构建及蛋白表达

【目的】非洲猪瘟病(African swine fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)导致的,能引起猪高度致死的急性传染病。采用生物学手段制备检测试剂能更快、更有效地监测疫情,对ASF疫情的防控尤为重要。【方法】根据ASFV的CP204L基因CDS区序列设计特异性引物并进行PCR扩增,将目的基因片段与p EASY-T5连接构建克隆载体,利用生物信息学软件对蛋白进行生物信息学分析,用T_4连接酶构建重组载体pET-32a(+)-CP204L,将成功构建的重组表达载体质粒转入感受态Rosetta(DE3)中,用1 mmol/L IPTG、37 ℃诱导表达8 h后进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达。【结果】生物信息学分析结果表明,P30蛋白是一种主要由无规卷曲α螺旋和β折叠组成的亲水和稳定蛋白,PCR扩增及测序比对结果证明成功构建了重组表达载体,SDS-PAGE电泳验证了在24.3 ku处有潜在的P30蛋白表达。【结论】通过生物信息学软件在分子层面分析了P30蛋白的理化性质及蛋白结构,P30蛋白的表达为制备ASFV血清学诊断试剂及诊断技术奠定了基础。     

ASFV解旋酶D1133L蛋白表达和抗体检测方法的建立及初步应用

为了建立快速检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的血清学方法,本研究原核表达了ASFV的D1133L重组蛋白,并以其为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种快速检测ASFV的间接ELISA方法,并采用该方法检测了ASFV感染猪后D1133L的抗体应答情况.结果显示:成功表达纯...     

非洲猪瘟实时荧光RPA诊断方法建立及应用

[目的]非洲猪瘟(African swine fever,ASF)自2018年首次暴发于我国沈阳后,迅速扩散至全国,对我国养猪业造成了沉重打击.研究针对其病原非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)建立一种快速核酸检测技术,为及时发现、准确处理ASF疫情提供一种快速诊断方法.[方法]...     

基于疫苗研究的非洲猪瘟防控现状

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的猪的一种高度接触性、致死性传染病，病理特征明显，致死率高，对全世界养猪业和经济发展构成严重威胁。由于ASFV基因组庞大，免疫逃逸机制复杂，至今还没有研发出安全有效的商业化疫苗用于防控疫病。该综述分别介绍了ASF的流行背景、病原学特性、临床和实验室诊断方法以及相关防控措施。总结了6种ASF疫苗如灭活疫苗、减毒活疫苗、病毒活载体疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗以及单周期病毒疫苗的研究进展和免疫机理，并叙述了用于防控疫病的可行性。在此基础上，提出了纳米疫苗和抗病育种2个新的研究方向，归纳出了目前防控遇到的难题及解决办法，以期为后续疫病防控和ASF疫苗研究提供参考和新途径。     

广西举办非洲猪瘟防控科普报告会

正2019年8月3日,非洲猪瘟科普报告会在广西南宁举办,报告会是由广西科协、广西农业农村厅、广西图书馆主办,广西农学会、广西科普传播中心承办。非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是以非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)为病原所引起的急性、热性、高传染性、超高致死性的疾病。ASF在20世纪20年代首次发现于非洲的肯尼亚,于1957年首次传出非洲,1957年传入欧洲,1971年传入美洲,1980至     

基于E165R基因非洲猪瘟LAMP快速检测方法的建立

【目的】建立特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)快速检测方法，为非洲猪瘟的实时实地快速检测提供参考。【方法】通过对非洲猪瘟病毒多种基因型66个毒株的E165R基因多序列比对，选取相对保守区域设计LAMP引物，并对反应条件及反应体系进行优化。在获得的最优反应条件及体系下考察方法的检测特异性和灵敏性。【结果】选取的LAMP检测靶标235 bp(29～264 bp)在不同基因型ASFV毒株中保守性较好，序列相似度达94.46%～100%;LAMP反应的最佳温度为64℃、时间为35 min、Mg²⁺浓度为8 mmol/L、内外引物比为8︰1、Bst DNA聚合酶量为16 U。建立的ASFV环介导等温扩增检测方法最低检测限为50 copies/μL,较常规PCR检测提高1个数量级，且35 min即可完成扩增反应。LAMP检测方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PR...     

理化因素对非洲猪瘟病毒灭活效果的研究

【目的】了解我国非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的生物学特性及理化抗性，提高猪场生物安全水平以防控非洲猪瘟。【方法】通过红细胞吸附试验和qPCR试验验证不同理化因素(包括静置、温度、UVC照射、室内外干燥、阳光暴晒和消毒剂)对ASFV的灭活效果。【结果】UVC照射30 min即可灭活病毒，照射时间越长，ASFV核酸降解越严重；室内干燥2.5 d、室外干燥1.5 d、阳光暴晒30 min均可灭活ASFV，但不能降解ASFV核酸；常见消毒剂对ASFV的杀灭效果良好，各消毒剂按照推荐稀释浓度室温作用15或30 min，除碘酸混合溶液外均能使ASFV完全失活；温度升高(4、25和37℃)会增强消毒剂的消毒作用；有机物FBS的存在会削弱消毒剂的作用，且随FBS体积分数增加(0、10%和30%)消毒剂的消毒效果会降低。【结论】本文系统研究了常见的理化因素对ASFV灭活效果的影响，有助于全面了解ASFV生物学特性，对非洲猪瘟的防控具有重要指导意义。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达和多克隆抗体制备

[目的]非洲猪瘟(african swine fever,ASF)是一种以猪急性发病、高死亡率为典型特征的病毒病,其病原非洲猪瘟病毒(ASF virus,ASFV)在中国的暴发给中国养猪业造成重大损失.p72蛋白是ASFV的主要衣壳蛋白,能够有效诱导机体产生特异性抗体,常被利用于检测试剂盒的备成.[方法]构建了p72全...     

35株非洲猪瘟病毒全基因组序列的系统生物学分析

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)源于非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)感染所引起的烈性传染病,主要是以蜱和野猪为天然宿主。ASFV感染能够导致家猪及野猪直接死亡,死亡率近乎100%。目前在非洲、欧洲、亚洲等地区均出现大面积爆发,却尚未出现对该病毒进行预防的商业化疫苗。因此,需要对病毒基因组信息有更深入的了解。通过对不同地区发生的ASFV全基因组进行多序列比对、系统进化树构建、保守区域检测等,获得与ASFV毒力、进化等相关的基因片段,并研究这些基因片段在不同区域的病毒株中的关系。结果表明:Ⅶ与Ⅱ基因型相比较,后者出现很多大片段基因序列的增加,这些增加的片段主要出现在V110、360、505/530多基因家族中。其中,对多基因家族中MGF 505/530-7R、MGF360-1L基因研究分析表明,不同基因型之间由于这些基因的差异影响巨噬细胞的存活能力、病毒复制强弱与病毒变异和进化有关,结果为研究病毒进化及未来病毒疫苗研发提供新的方向。     

非洲猪瘟诊断技术发展现状与需求分析

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASF virus,ASFV)引起猪的一种出血性、高度接触性传染病,其临床症状与猪瘟极其相似。该病于2018年8月在我国辽宁省沈阳市首次发生,随后在31个省份爆发,造成直接经济损失达数百亿元。由于目前尚无有效的商品化疫苗,快速、灵敏、简便的诊断技术对于防控和根除该病至关重要。总结了目前应用的ASFV检测技术,比较分析了他们的性能,同时探讨了ASFV诊断技术未来的发展方向及趋势,旨在为我国ASF检测及综合防控提供技术参考。     

针对非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因的TaqMan荧光定量PCR的建立

【目的】建立一种以MGF360-13L基因为靶标的实时荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）的方法,为非洲猪瘟（African swine fever, ASF）的诊断、MGF360-13L基因缺失毒株鉴别、病毒分离鉴定、基因功能研究提供技术支持。【方法】首先,以ASFV中国流行毒株（GenBank: MK333180.1）的MGF360-13L基因序列为靶标设计并筛选了1对特异性引物和探针,建立其荧光定量PCR检测方法。设计引物13L-F/13L-R,扩增MGF360-13L,并将其克隆至pOK12载体,挑取阳性克隆并测序验证,构建重组质粒标准品。将重组质粒标准品连续10倍梯度稀释,以稀释后的各梯度质粒标准品为模板,配制反应体系和设置反应条件后进行荧光定量PCR检测,建立标准曲线,并对其敏感性和重复性进行评价;其次,以连续10倍梯度稀释的重组质粒标准品为模板,利用引物13L-F/13L-R进行常规PCR检测,以比较荧光定量PCR的敏感性。最后,运用本检测方法和本研究组已建立的针对ASFV p72的荧光定量PCR检测方法同时对黑龙江某猪场发生ASF时采集的30份临床样品进行检测,以比较两种检测方法的符合率。另外,应用该方法对感染原代巨噬细胞的ASFV野毒株和MGF基因缺失毒株进行鉴别检测。【结果】利用引物13L-F/13L-R可扩增出一条800 bp左右的特异性目的条带,而阴性对照无条带,成功构建出标准品。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法在质粒标准品为1.56×10¹-1.56×10⁸拷贝/μL时,呈现出良好的线性关系,线性回归方程为：y =-3.295 lg(x) + 45.995,线性相关系数R²为0.997,对ASFV核酸最低检测限为15.6拷贝/μL。在特异性检验中,除ASFV核酸外,猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型等病毒核酸均未出现扩增曲线,表明该方法的特异性良好。与最低检测限为1.56×10⁴拷贝/μL病毒核酸的常规PCR检测方法相比,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法高出其约3个数量级,具有较高的敏感性。在临床样品检测中,两种检测方法经过McNemar检验,P = 0.5>0.05,表明两种检测方法的结果无统计学差异;经过Kappa检验,Kappa = 0.867>0.75,P<0.001,提示两种检测方法符合率较好,能够有效区分ASFV野毒株和MGF360-13L基因缺失毒株。【结论】建立的TaqMan荧光定量PCR特异、敏感、重复性好,不仅丰富了ASFV现有检测靶标,也为后续MGF360-13L功能、MGF缺失毒株的鉴定及相应基因缺失疫苗株的鉴别诊断提供技术支持。     

ASFV解旋酶D1133L蛋白表达和抗体检测方法的建立及初步应用

为了建立快速检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的血清学方法,本研究原核表达了ASFV的D1133L重组蛋白,并以其为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种快速检测ASFV的间接ELISA方法,并采用该方法检测了ASFV感染猪后D1133L的抗体应答情况。结果显示:成功表达纯化了D1133L蛋白,以此为抗原建立了ELISA抗体检测方法,该方法特异性高,灵敏性强,其检测结果与市售试剂盒检测结果的符合率达100%。家猪在感染ASFV后,针对D1133L的抗体在第5天可被检测到,在第7天抗体水平达到顶峰。     

非洲猪瘟病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)快速、敏感的检测方法,根据GenBank中登录的中国流行株ASFV-SY18的P72基因,建立了SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对所建立方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,所建立的非洲猪瘟病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法能有效扩增1.0～1.0×10~9 copies·μL~(-1)的ASFV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0 copies·μL~(-1);对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数小于1%,重复性良好。     

从病理组织特点看非洲猪瘟病毒的细胞嗜性

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是猪的一种急性、高度接触传染性和高致死性传染病。ASFV的分子基础与机体组织细胞相互作用的机制仍不甚清楚。通过观察多例非洲猪瘟病理组织学变化和免疫组织化学阳性物质沉着部位,结合前人的报道和临床特点,发现免疫器官病变严重程度依次为:脾腹股沟淋巴结肠淋巴结颌下淋巴结扁桃体;其它脏器病变严重程度:肠道肾肝肺心;肠绒毛乳糜管内呈现棕黄色ASFV阳性物质。提示ASFV可能通过呼吸道和消化道入侵机体。所有组织出血部位、淤血血管内红细胞ASF免疫组化染色均呈阳性反应,说明ASFV易与红细胞结合。推断非洲猪瘟病毒的致病机制或为:ASFV通过呼吸道和消化道入侵猪体后,被机体扁桃体、颌下淋巴结或肺脏的巨噬细胞和机体内皮细胞吞噬,介导ASFV接触红细胞并结合,破坏红细胞系统,导致机体大量、广泛出血。     

非洲猪瘟流行特点与防控措施

正非洲猪瘟(African Swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus,ASFV)感染家猪或野猪引起的一种传染性强、传播速度快、死亡率极高、内脏器官广泛出血的动物传染病,是当前严重威胁生猪产业健康发展的重大动物疫病之一。本文就该病的流行特点,病理变化及临床特征等,阐述如何做好该病的防控。1非洲猪瘟(ASF)的发病情况1.1非洲猪瘟(ASF)在国外流行发病情况非洲猪瘟(ASF)首次于1921年在非洲东部国家肯尼亚被确诊发现,近30来年,该病一直流行于非洲以南的国家。     

基于PMA-qPCR方法检测兽用消毒剂对非洲猪瘟病毒的灭活效率

为评估规模化猪场生物安全防控水平,拟建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染性检测方法,并利用该方法检测兽用消毒剂对病毒的灭活效果。使用不同种类的消毒剂处理ASFV,通过PMA-qPCR评估消毒剂对ASFV的灭活效果和筛选消毒剂的最佳处理方式。PMA-qPCR结果显示,ASFV对不同类型的消毒剂表现出不同的敏感性,对过硫酸氢钾复合物溶液敏感性最高,该消毒剂按0.5%稀释,20 min内即可有效灭活ASFV。研究结果对生物安全的消毒环节具有一定的参考意义。     

非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性纳米抗体的筛选与鉴定

【目的】利用噬菌体展示技术筛选非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)K205R蛋白的特异性纳米抗体。【方法】将原核表达、纯化的ASFV K205R蛋白免疫双峰驼，采集全血，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA并反转录，巢式PCR扩增VHH基因，构建VHH噬菌体文库，利用噬菌体展示技术筛选K205R特异性纳米抗体。【结果】成功构建库容量为5×10⁸的VHH噬菌体文库，然后利用噬菌体展示技术经过3轮淘选，特异性VHH噬菌体得到明显富集，氨基酸序列比对显示共筛选出5株K205R蛋白的特异性纳米抗体，分别为ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb14、ASFV-K205R-Nb35、ASFV-K205R-Nb64和ASFV-K205R-Nb82。【结论】筛选的5株纳米抗体均具有良好的特异性，其中ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb35和ASFV-K205R-Nb82具有更好的亲和力，为以纳米抗体作为灵敏探针建立的特异性强、灵敏度高、成本低的新型ASFV血清学诊断方法提供依据。     

病毒调控应激颗粒形成的策略及应激颗粒对病毒复制的影响

病毒严格在细胞内寄生,其依赖于宿主细胞的翻译系统进行复制增殖.近年多项研究发现,细胞内核糖核蛋白(RNP)聚集形成的应激颗粒(SG)具有调控病毒复制的功能.病毒感染细胞后,一方面,诱导真核起始因子2α(eIF2α)磷酸化并形成SG,SG通过内部翻译停滞的mRNA抑制病毒蛋白的翻译,或通过内部模式识别受体(PRR)激活宿...     

非洲猪瘟病毒P30-54融合蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及反应原性研究

【目的】非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种严重危害猪养殖业的急性烈性传染病。【方法】为了制备特异性强、敏感性高的ASFV血清学诊断用抗原,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了ASFV P30-54融合蛋白基因。将P30-54融合蛋白基因克隆入杆状病毒转座载体质粒pFastBac1中,构建重组质粒pFastBac-P30-54;将重组质粒转化DH10 Bac感受态细菌进行重组,经抗性与蓝白斑筛选得到杆状病毒重组质粒Bacmid-P30-54;将reBacmid-P30-54转染sf9细胞,获得重组杆状病毒reAcMNPV-P30-54。将获得的reAcMNPV-P30-54接种sf9细胞,待细胞出现CPE时收集细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)和SDS-PAGE进行分析重组蛋白的表达情况;通过Western blot检测重组蛋白的反应原性。【结果】在重组杆状病毒中成功表达P30-54蛋白,该重组蛋白可与ASFV多克隆抗体发生免疫学反应。【结论】证实该重组蛋白具有良好的反应原性。