表达二穗短柄草CBF2基因拟南芥抗旱性分析

以表达二穗短柄草(Brachypodium distachyon)CBF2基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,通过模拟干旱胁迫分析其种子和幼苗对甘露醇渗透胁迫的响应和成苗对盆栽条件下水分胁迫的响应。结果表明,渗透压为-0.62MPa时种子萌发率开始下降,转基因拟南芥种子萌发率略高于野生拟南芥,但差异不显著(P0.05)。以根的增长量作为评价幼苗抗旱性的主要标准,当渗透压小于-0.37 MPa时,根长增长量随着胁迫强度的增加而明显减小,转基因株系根长增长量始终显著高于野生型拟南芥(P0.05)。拟南芥成苗干旱胁迫至25d,野生拟南芥成活率为11.7%,转基因植株平均成活率为41.6%;随着干旱胁迫时间的延长,转基因拟南芥过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性均显著高于野生植株,丙二醛含量及相对电导率显著低于野生植株。结果表明,二穗短柄草CBF2基因提高了拟南芥幼苗及成苗的抗旱性。     

日本结缕草ZjZFN1基因对拟南芥的转化及其耐旱性分析

锌指蛋白在植物干旱胁迫中起重要作用,尽管已经在各种植物中克隆并鉴定了编码这些蛋白质的基因,但是它们在日本结缕草中的功能和潜在的转录机制还不清楚。通过花序侵染法将ZjZFN1基因及其启动子转化拟南芥,并通过草铵膦/潮霉素抗性筛选和PCR鉴定,获得转基因株系。ZjZFN1的启动子能够驱动GUS基因的表达,在甘露醇处理下的GUS基因表达水平显著高于对照;在拟南芥中过表达ZjZFN1降低了种子发芽率,减弱了植物对干旱胁迫的适应性和植物在干旱胁迫下的生长状况;干旱处理后,转基因植株中的丙二醛含量高于野生型植株,而脯氨酸含量显著低于野生型植株;实时荧光定量分析表明对过表达ZjZFN1的拟南芥进行干旱处理后,POD、SOD、P5CS、LEA的表达水平降低,而APX的表达水平升高。ZjZFN1基因的过表达可减弱植物的耐旱性,为进一步开发利用该基因奠定基础。     

日本结缕草ZjZFN1基因对拟南芥的转化及其耐旱性分析

锌指蛋白在植物干旱胁迫中起重要作用,尽管已经在各种植物中克隆并鉴定了编码这些蛋白质的基因,但是它们在日本结缕草中的功能和潜在的转录机制还不清楚。通过花序侵染法将ZjZFN1基因及其启动子转化拟南芥,并通过草铵膦/潮霉素抗性筛选和PCR鉴定,获得转基因株系。ZjZFN1的启动子能够驱动GUS基因的表达,在甘露醇处理下的GUS基因表达水平显著高于对照;在拟南芥中过表达ZjZFN1降低了种子发芽率,减弱了植物对干旱胁迫的适应性和植物在干旱胁迫下的生长状况;干旱处理后,转基因植株中的丙二醛含量高于野生型植株,而脯氨酸含量显著低于野生型植株;实时荧光定量分析表明对过表达ZjZFN1的拟南芥进行干旱处理后,POD、SOD、P5CS、LEA的表达水平降低,而APX的表达水平升高。ZjZFN1基因的过表达可减弱植物的耐旱性,为进一步开发利用该基因奠定基础。     

海雀稗PvCIPK9基因克隆及耐盐功能鉴定

盐生植物海雀稗(Paspalums vaginatium)是一种极其耐盐的多年生草本植物。本研究从海雀稗转录组数据中筛选对盐胁迫响应的PvCIPK9基因，克隆了PvCIPK9基因CDS序列全长，并对其表达模式、启动子元件等进行分析。为研究PvCIPK9基因的耐盐功能，构建了PvCIPK9过表达载体，采用农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),获得过表达PvCIPK9的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana),对转基因拟南芥的耐盐性进行鉴定。结果表明，盐胁迫条件下，转基因拟南芥的生长表型显著优于野生型，转基因拟南芥在盐胁迫下的种子萌发率及相对生长量均显著高于野生型；此外，盐处理后转基因拟南芥的抗氧化酶活性也显著高于野生型，以上结果初步说明过表达PvCIPK9基因增强了拟南芥对盐胁迫的抵抗能力。本研究为深入解析海雀稗PvCIPK9在植物耐盐性中的作用奠定了基础。     

唐古特白刺类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(NtUFGT)的克隆与功能分析

花青素是植物体内重要的黄酮类次生代谢产物,其强大的抗氧化能力对植物抵抗由各种非生物胁迫带来的氧化损伤发挥着重要的作用。本研究基于转录组数据,从唐古特白刺cDNA中克隆得到一个类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因,将其命名为NtUFGT。该基因开放阅读框长度为1407 bp,编码468个氨基酸,预测该基因编码的蛋白质相对分子质量为51.37 kDa。多重序列比对分析结果显示,其编码蛋白属于UDP-glycosyltransferases蛋白家族。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了该基因在唐古特白刺中的表达模式,发现该基因的表达具有组织特异性,由高到低依次为花果实茎叶根;同时该基因能被聚乙二醇(PEG)和脱落酸(ABA)等非生物胁迫强烈诱导表达。构建该基因的真核表达载体pPZP221:35S:NtUFGT,使用花序浸染法转化拟南芥并筛选至T_3代,RT-PCR验证表明,NtUFGT基因在转基因拟南芥3个株系中均明显表达。测定干旱胁迫条件下野生型(WT)和转基因拟南芥(OE株系)生长状况和抗逆相关生理生化指标,结果发现转基因拟南芥生长状况明显优于野生型,根长更长,鲜重和叶绿素含量更高,同时OE株系积累了更多的花青素和总黄酮。与表型一致,相较于WT,OE株系具有更高的抗氧化酶活性[超氧化物歧化酶(SOD);过氧化物酶(POD);过氧化氢酶(CAT)],积累了更多的还原性谷胱甘肽(GSH)和脯氨酸,同时其丙二醛(MDA)、过氧化氢(H_2O_2)含量显著低于WT;基因定量分析结果显示,OE株系拟南芥中抗逆相关基因AtCAT1、AtPOD1、AtRD29A及脯氨酸合成基因AtP5CS的表达量明显高于WT。以上结果说明,NtUFGT能有效提高转基因拟南芥中花青素和总黄酮含量,赋予植物更强的活性氧清除能力和渗透调节能力,从而增强了植物对干旱胁迫的耐受性。     

羊草LcCBF6基因的表达特性和功能研究

羊草是我国重要的牧草和生态草资源,具有耐盐碱、耐旱、耐低温等特性,是天然的抗逆基因资源库.CBF/DREB属于AP2转录因子家族,在植物抗逆中发挥着重要作用.本研究克隆得到羊草LcCBF6(Leymus chinensis C-repeat binding factor 6)基因,该基因含有AP2结构域,编码245个氨基酸.氨基酸序列比对发现,LcCBF6与蒙古冰草和黑麦的CBF6蛋白的同源性分别为92％和91％.组织特异性表达模式分析表明,LcCBF6基因在羊草根、叶、种子中均有表达,且受盐胁迫诱导表达.过表达LcCBF6能显著提高转基因拟南芥的抗盐性.在盐胁迫条件下,转基因株系的绿色子叶数、根长、植株生物量以及存活率等均明显高于野生型.上述结果表明羊草LcCBF6基因在提高植物盐胁迫抗性方面发挥了重要的作用,将为牧草及重要农作物抗逆分子育种提供优异的基因资源.     

转紫花苜蓿MsLEA2基因提高拟南芥耐铝毒性研究

MsLEA2基因是从紫花苜蓿中克隆到的胚胎晚期富集蛋白基因,属于LEA_2家族。以转基因拟南芥T_3代植株的3个株系为材料,从表型、生理和分子生物学三个方面研究铝胁迫下转MsLEA2基因拟南芥的耐铝毒性能。结果表明:铝胁迫下转基因株系的脯氨酸含量高于对照(野生型),丙二醛含量和电导率则低于对照且差异显著(P0.05),CAT、POD和SOD活性显著高于对照。初步证明转MsLEA2基因拟南芥的耐铝毒性能明显高于对照,紫花苜蓿的MsLEA2基因具有提高植物耐铝毒胁迫的能力。     

过量表达甘菊CBF1基因提高拟南芥抗旱耐盐能力

CBF是一类植物特异性、具有多种功能的转录因子。本研究将从甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)中分离的ClCBF1基因构建到植物表达载体pBI121上,并采用农杆菌介导的花序浸染法对拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行遗传转化,共获得4个转基因株系经过抗性筛选和RT-PCR验证,对其中表达量较高的3个转基因株系进行研究,结果表明:在150mmol·L~(-1)甘露醇培养基中转基因拟南芥的种子萌发率和根长平均为野生型的2.0倍和1.2倍,在150mmol·L~(-1) NaCl培养基中转基因拟南芥种子萌发率和根长平均为野生型的1.1倍和1.4倍;在干旱和盐胁迫条件下,转基因拟南芥幼苗的成活率高于野生型,并且超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性显著高于野生型(P0.05),丙二醛(MDA)含量及相对电导率显著低于野生型植株(P0.05)。说明ClCBF1基因在拟南芥受到干旱和盐胁迫过程中发挥一定作用。     

珍稀泌盐植物长叶红砂RtSOD基因的克隆及功能分析

长叶红砂是一种强旱生泌盐盐生植物,对盐渍荒漠环境具有极强的适应性。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)在植物抵御逆境胁迫过程中发挥着重要作用。本研究利用已有长叶红砂转录组数据库中SOD基因的已知序列设计引物,采用PCR方法克隆得到大小为663 bp、编码220个氨基酸的SOD基因的开放阅读框,并将其定名为RtSOD。预测该基因编码蛋白分子量为55.90 kDa,理论等电点5.11。多重序列比对分析结果显示该蛋白属于Cu/Zn SOD家族,与其他植物中SOD蛋白同源性较高。系统进化分析结果显示RtSOD基因与刚毛柽柳的SOD基因亲缘关系较近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果显示NaCl、4 ℃、PEG、H₂O₂及ABA处理均能诱导该基因表达。构建RtSOD真核表达载体,将其转化到拟南芥中,结果发现:盐、干旱胁迫条件下,转RtSOD基因拟南芥的生长状况明显优于野生型,转基因株系抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)和脯氨酸含量较野生型显著升高,H₂O₂及MDA含量较野生型显著降低。qRT-PCR检测发现转基因拟南芥中响应逆境胁迫相关基因的表达量均显著高于野生型。上述结果说明RtSOD基因的过表达可提高转基因植物的抗逆性,进一步说明RtSOD参与长叶红砂对非生物胁迫的响应,是该植物抗氧化系统中的重要元件。     

紫花苜蓿R2R3-MYB亚家族鉴定与干旱胁迫下的表达分析

MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)家族是最大的转录因子家族之一，R2R3-MYB亚家族在植物胁迫响应、次级代谢、生长和发育等过程发挥重要作用。本研究利用紫花苜蓿(Medicago sativa‘Zhongmu No.1’)基因组和转录组数据，通过生物信息学方法鉴定了R2R3-MYB转录因子，并对其序列特征、系统进化、染色体分布、基因结构、顺式作用元件及干旱胁迫下的表达模式进行分析。结果显示，紫花苜蓿中有121个R2R3-MYB亚家族成员，各成员均具有两个典型的MYB结构域，理化性质变化较大。系统进化分析将121个成员分为33个组，各成员无规律地定位在8条染色体上。基因结构和顺式作用元件分析发现，同一分组具有相同或相似的外显子数和顺式作用元件。响应干旱胁迫表达模式分析和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明干旱胁迫下MsMYB12,MsMYB45,MsMYB52,MsMYB73,MsMYB88,MsMYB124,MsMYB149,MsMYB189,MsMYB268基因的表达量显著上调，可作为后期紫花苜蓿响应干...     

白羊草种子脱绒技术初探

白羊草(Bothriochloa ischaemum)种子上的散发性簇状绒毛致使其相互粘连,严重影响了机械化播种。本研究采用H₂SO₄和NaOH对白羊草种子进行脱绒处理,探究两种化学试剂对白羊草种子的脱绒效果。结果表明:当NaOH的浓度在30%以上时对种子的脱绒产生了明显的效果,但随着NaOH的浓度和处理时间的增加,种子的发芽指数和种子活力显著降低;而以浓度60%的H₂SO₄处理10 min的方式可有效地脱去白羊草表面绒毛,并且对脱绒后的白羊草种子发芽指数和种子活力指数没有显著影响。综上所述,用浓度60%的H₂SO₄处理10 min,是白羊草种子脱绒处理的最优方案。     

白羊草NAC转录因子家族生物信息学分析

NAC转录因子家族是植物特有的一类重要转录因子,广泛参与植物生长、发育以及器官的建成、逆境胁迫应答等过程。为进一步研究白羊草（Bothriochloa ischaemum） NAC转录因子家族,本研究利用生物信息学方法对白羊草NAC基因所编码的蛋白理化性质、二级结构、保守基序、亚细胞定位、潜在磷酸化位点及系统进化关系进行了分析。结果显示,具有NAC结构域的21条白羊草氨基酸序列共分为10个亚家族,蛋白二级结构以无规则卷曲为主要组成部分,含有5个保守基序,大多数NAC蛋白定位于细胞核,均含有潜在的丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、和酪氨酸（Tyr）磷酸化位点。本研究将为白羊草NAC基因家族的进一步功能分析奠定重要的研究基础。     

白羊草R2R3-MYB转录因子的挖掘及对干旱胁迫反应的研究

本文以白羊草（Bothriochloa ischaemum）为材料，利用其目前已有的转录组序列，通过搜索、比对、功能域多态性分析、进化树构建和基因表达分析等手段，对白羊草R2R3-MYB型转录因子进行挖掘和干旱胁迫下的表达模式分析。结果从白羊草挖掘出43个R2R3-MYB转录因子，它们具有高度保守的[W]-X（19）-[W]-X（19）-[W]-X（n）-[W]-X（18）-[W]结构，主要参与生长发育、次生代谢和逆境响应等生物过程。通过进一步的分析，本研究筛选出8个可能参与干旱胁迫响应的R2R3-MYB转录因子。这为白羊草R2R3-MYB基因的功能研究和开发利用奠定了基础。     

黄土丘陵区草地群落多样性和优势种养分对氮添加的响应

为探究大气氮沉降对黄土丘陵区草地群落多样性及其优势种生长的影响,本研究以白羊草(Bothriochloa ischaemum, Bi)和达乌里胡枝子(Lespedeza davurica, Ld)为优势种的草地群落为研究对象,设置3个氮添加处理(N0,0 kg ·hm^-2·a^-1;N25,25 kg ·hm^-2·a^-1;N75,75 kg ·hm^-2·a^-1),测定并分析了白羊草和达乌里胡枝子的株高、盖度、地上生物量(Aboveground biomass,AGB),物种多样性和养分含量。结果表明：氮添加处理下,Bi和Ld群落的总AGB显著提高;Bi群落中,氮添加显著降低物种多样性指数,而显著提高白羊草的全氮含量和氮磷比;Ld群落中,氮添加显著增加物种多样性指数,而显著降低达乌里胡枝子的全氮含量和氮磷比;相关性分析表明,物种多样性与白羊草的盖度和生物量呈显著负相关关系,与达乌里胡枝子的高度、盖度和AGB呈显著正相关。综上,氮添加促进了白羊草生长但抑制达乌里胡枝子,其群落优势种的AGB对物种多样性影响更加重要。     

日本百脉根LjbHLH34基因克隆及耐旱功能鉴定

干旱是影响植物生长发育的重要环境因素。本研究分析了日本百脉根抗旱相关基因LjbHLH34的耐旱功能，初步解析其响应干旱胁迫的分子机制，以期为百脉根抗旱分子育种提供理论基础。本研究克隆得到的LjbHLH34基因大小为711 bp、编码236个氨基酸，属bHLH转录因子家族成员。系统进化树分析显示，LjbHLH34蛋白与拟南芥bHLHⅣ亚家族中AtbHLH34和AtbHLH104亲缘关系较近。实时荧光定量分析表明LjbHLH34在日本百脉根的根中表达量最高，叶中次之，茎中最少，暗示其在日本百脉根多个组织中发挥作用；同时LjbHLH34基因也受聚乙二醇(PEG)和脱落酸(ABA)诱导表达。在酵母中检测发现LjbHLH34具有转录激活活性；亚细胞定位试验表明LjbHLH34蛋白定位于细胞核中。将LjbHLH34基因转入拟南芥获得过表达株系。在200 mmol·L^-1甘露醇胁迫下，LjbHLH34转基因拟南芥的根长明显长于野生型。干旱处理后，野生型拟南芥比转基因拟南芥萎蔫程度更加明显，而转基因株系的相对含水量和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于野生型，丙二醛(MDA)积累...     

贮藏年限对不同居群白羊草种子活力的影响

[目的]探究贮藏年限对不同居群白羊草（Bothriochloa ischaemum）种子活力的影响。[方法]采用收获于2017年、2018年、2019年及2020年的5个居群（代县、平鲁、平定、柳林和太谷）白羊草种子进行发芽试验，分析其发芽率、发芽指数、平均发芽时间及幼苗活力指数随贮藏年限的变化规律，探讨不同居群白羊草种子的耐贮藏性差异。[结果]贮藏年限、居群及两者的交互作用对白羊草种子发芽率、发芽指数及幼苗活力指数存在极显著（P<0.01）影响。不同居群白羊草种子发芽率、发芽指数及幼苗活力指数随贮藏年限的增加均呈下降趋势。太谷居群白羊草种子收获当年以及贮藏1和2年的发芽率、发芽指数差异不显著（P>0.05），贮藏3年时显著（P<0.05）下降，幼苗活力指数随贮藏年限的增加无显著（P>0.05）变化；其他居群白羊草种子收获当年的发芽率、发芽指数及幼苗活力指数均显著（P<0.05）高于贮藏1、2、3年。柳林居群白羊草种子在收获当年的发芽指数、幼苗活力指数均高于其他居群，平均发芽时间低于其他居群，发芽率较高。贮藏年限对白羊草种子的平均发芽时间存在极显著（P<0.01）影响，平均发芽时间随贮藏年限的增加而延长，且居群对白羊草种子平均发芽时间也存在极显著（P<0.01）影响，但贮藏年限与居群的交互作用对白羊草种子平均发芽时间的影响不显著（P>0.05）。[结论]不同居群白羊草种子活力均在收获当年保持较高水平，其中，柳林居群白羊草种子活力水平最高。太谷居群白羊草种子活力在贮藏3年内保持较高水平，耐贮藏性最好；而其他居群均不适合长期贮藏。     

西藏野生垂穗披碱草EnCBL10基因的克隆与功能研究

钙调磷酸酶B类蛋白（Calcineurin B-Like Proteins，CBLs）是钙信号通路中重要成员，在植物应答多种非生物胁迫中具有重要的作用。本研究基于前期转录组数据，在西藏野生垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb.）中筛选EnCBL10基因，将其异源表达于烟草（Nicotiana tabacum）中，分析转基因植株EnCBL10在低温和干旱胁迫下的生长及生理响应。结果表明：EnCBL10开放阅读框为792 bp，编码263个氨基酸。EnCBL10蛋白的理论等电点为5.17，为疏水蛋白和非分泌蛋白。低温和干旱胁迫下，对比于野生型烟草，转基因烟草叶片的细胞膜稳定性显著增加，过氧化物酶（Peroxidase，POD），抗坏血酸过氧化物酶（Aseorbateperoxidase，APX）和谷胱甘肽还原酶（Gluathione reductase，GR）活性显著升高。低温胁迫下，两个转基因株系的脯氨酸含量分别提高了79.7%和70.8%（P<0.05）；在干旱胁迫下，野生型植株（WT）和过表达植株中脯氨酸含量均有所降低，但转基因植株比WT的下降幅度小。因此，EnCBL10基因可能在垂穗披碱草的耐寒和耐旱调控中发挥重要功能。     

过表达长穗偃麦草EeHKT1；4基因增强拟南芥抗旱耐盐性分析

植物高亲和性K⁺转运蛋白基因（HKT）编码K⁺、Na⁺转运或K⁺-Na⁺共转运质膜通道蛋白,在植物抗逆过程中发挥重要作用。为了研究长穗偃麦草EeHKT1;4（GenBank： KF956112.1）的功能作用,构建了EeHKT1;4过表达植物表达载体转化拟南芥,进行拟南芥转基因植株的抗旱耐盐性评价分析。结果显示,正常生长条件下野生型（WT）与转基因株系的主根长度无差异,NaCl与甘露醇处理下WT和转基因株系根的生长受到抑制,转基因株系根长度均大于同等胁迫条件下（WT）的根长;正常生长条件下WT与转基因株系表型无显著差异,但在NaCl与甘露醇处理下WT表现出叶片萎缩和植株枯黄,转基因株系仅部分植株表现出叶片萎缩,同一胁迫条件下转基因株系的植株存活率皆高于WT。硝基氮蓝四唑（NBT）与二氨基联苯胺（DAB）染色结果显示,正常生长条件下WT与转基因株系叶片染色相对较浅,随着NaCl与甘露醇浓度提高,所有叶片染色程度逐渐加深且同等胁迫下WT染色程度高于转基因株系。以正常生长条件下基因的表达量为对照,随着NaCl浓度的增加,AtSOS1基因在WT和转基因植株中逐渐上调且在转基因中的表达量高于WT;AtNHX1基因在NaCl处理下上调表达且转基因植株中表达量低于WT,除转基因株系L5外并未检测到WT和转基因株系自身因NaCl浓度的提高AtNHX1基因表达量发生改变;在甘露醇处理下,AtRD29B和AtP5CS1基因均上调表达且转基因植株中表达量高于WT。综上所述,EeHKT1;4过表达降低了逆境胁迫下拟南芥中超氧阴离子和H₂O₂的积累,诱导抗逆基因上调表达,增强拟南芥抗旱耐盐性。     

抗逆转录因子在百脉根中的功能分析

为提高豆科牧草百脉根抗旱方面的能力,从沙生植物胡杨和铃铛刺中克隆了4个抗逆转录因子基因并进行功能分析,从中筛选了2个具有抗旱特性的基因PeDREB2a和HhERF2,构建了以磷酸甘露糖异构酶为筛选标记的单、双价植物表达载体,转化百脉根Leo品种,结果表明,转录因子基因明显改善了百脉根的抗旱特性,经过抗旱复水试验证明转基因百脉根成活率达到100%。