鹅褪黑素受体Mel1c基因的组织表达特征

采用qRT-PCR等技术探究了Mel1c在鹅不同器官组织(心脏、肝脏、肾脏、肺脏、胰脏、脾脏、卵巢、大脑、胸肌及F1、F2、F3、F4、F5卵泡)中的表达分布。结果表明,Mel1c mRNA在鹅的心脏、肝脏、肾脏、肺脏、胰脏、脾脏、卵巢、大脑、胸肌及各级卵泡中均有表达;其表达量在各组织中存在差异,且以胰脏、脾脏、肾脏、卵巢中表达量较高,肺脏次之,心脏、胸肌、大脑水平相当,肝脏中最少。而在卵泡组织中,F4级卵泡中最高,其次为F5级卵泡,F1级卵泡中表达量最少。Mel1c在鹅各组织中普遍表达分布,进一步说明了褪黑素在机体中有着广泛的生物学作用,特别是对卵泡发育的影响。     

纤维源组成对浙东白鹅生长性能和消化功能的影响

为探讨稻壳和麦麸作为饲粮纤维源养殖浙东白鹅的效果及适当比例,将180只28日龄浙东白鹅随机分为3组,分别饲喂稻壳与麦麸添加比例为(5∶9)、(5∶1)和100%稻壳的饲粮,并测定各组生长性能、消化器官质量与消化酶活性、食糜p H以及饲粮营养成分的表观消化率。结果显示:当饲粮中稻壳与麦麸添加比例由(5∶9)增加至100%稻壳时,浙东白鹅的体质量与料重比均显著增加;肌胃和胰腺的质量有增加趋势,肌胃食糜p H有降低趋势,但处理间差异均不显著;胰腺中碱性磷酸酶活性显著降低,胆碱酯酶活性显著升高。当稻壳与麦麸添加比例增加至(5∶1)时,浙东白鹅苏氨酸、赖氨酸和组氨酸等必需氨基酸以及总磷的表观利用率显著降低。综上,4—8周龄浙东白鹅饲粮中稻壳与麦麸的添加比例为(5∶1)—100%稻壳时,其生产性能与经济效益综合效果最佳。     

牛LncRNA-133a对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

【目的】 探讨长链非编码RNA LncRNA-133a对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化过程的影响。【方法】 利用测序样品3、6、9月龄胎牛及24月龄成年和牛骨骼肌肌肉组织,qRT-PCR法检测LncRNA-133a的组织时序表达谱。构建牛骨骼肌卫星细胞的体外成肌诱导分化模型,模拟牛骨骼肌的生长发育过程,qRT-PCR法检测LncRNA-133a和肌细胞分化标记因子MyoG、MHC的细胞时序表达谱。利用过表达LncRNA-133载体（pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a） 或LncRNA-133a抑制物（si-LncRNA 133a） 转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法检测转染效率以及各转染处理组LncRNA-133a、MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表达水平,Western blotting检测MHC 基因的蛋白表达水平;同时,通过EdU细胞增殖检测、免疫荧光蛋白染色技术检测牛骨骼肌卫星细胞增殖阶段的细胞增殖量和分化阶段的肌管融合程度。【结果】 组织表达谱分析发现LncRNA-133a在3月龄胎牛肌肉组织中表达量最高,6月龄胎牛肌肉组织中次之,9月龄胎牛及成年牛肌肉组织中表达量最低,时序表达呈下降趋势;利用成功构建的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导分化模型,进行LncRNA-133a、MyoG、MHC的细胞时序表达谱分析,结果发现在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中（D0-D3）,肌分化标记因子MyoG、MHC的表达水平逐渐升高,LncRNA-133a的表达在分化阶段呈上升趋势,且分化48 h时（D2）表达量最高;成功构建的过表达LncRNA-133a或抑制LncRNA-133a的牛骨骼肌卫星细胞模型,在增殖期（D0）：与对照组相比,过表达LncRNA-133a处理组EdU增殖染色检测得到EdU阳性细胞数显著增加（P<0.01）,而LncRNA-133a抑制处理组EdU阳性细胞数显著减少（P<0.01）;在分化48 h时（D2）：与对照组相比,LncRNA-133a过表达处理组肌细胞分化标记因子MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,Western blotting检测MHC蛋白表达量显著增加（P<0.01）,且MHC蛋白的免疫荧光蛋白染色检测观察到融合肌管的体积占比更大;而LncRNA-133a抑制处理组MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平均降低,其中MyoG显著降低（P<0.05）, MHC蛋白表达量显著减少（P<0.01）,同时MHC蛋白融合肌管的体积占比也降低。【结论】 研究证实LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的作用,为进一步挖掘LncRNA-133a调节牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控网络机制奠定了基础。     

高效毛细管电泳法测定金针菇提取物中β-烟酰胺单核苷酸含量的初步研究

金针菇既是一种美味食品,又是较好的保健食品,营养成分十分丰富,建立了金针菇提取液中β-烟酰胺单核苷酸（β?-nicotinamide mononucleotide,NMN）的高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis,HPCE-DAD）含量测定方法。试验结果表明,检测波长218 nm,运行缓冲液30 mmol·L^-1硼砂缓冲液和10 mmol·L^-1磷酸二氢钠缓冲液（pH 9.2）,分离电压25 kV,进样时间为5 s时,该方法能够检测到金针菇提取液中的β-烟酰胺单核苷酸,检测限为0.17 μg·mL^-1,并在0.03~2.00 mg·mL^-1范围内呈较好的线性关系,利用标准曲线获得回归方程y=2E+6x-345.69,R²=0.999 4,将金针菇图谱中的相应β-烟酰胺单核苷酸（NMN）峰面积带入回归方程,计算得β-烟酰胺单核苷酸含量为27.57 μg·mL^-1。方法学考察结果表明β-烟酰胺单核苷酸标准品迁移时间和峰面积相对偏差为0.68%和1.44%;且样品8 h内的迁移时间和峰面积的相对偏差分别为1.26%和2.82%;β-烟酰胺单核苷酸在金针菇样品中的回收率为89%~94%。结果表明该方法适用于金针菇提取液中β-烟酰胺单核苷酸的测定,为食用菌中β-烟酰胺单核苷酸含量的测定提供了新的方法。     

浙东白鹅屠宰性能的主成分分析

以浙东白鹅为试验材料测定其屠宰性能,取屠宰率(x_1)、全净膛率(x_2)、腹脂率(x_3)、胸肌率(x_4)和腿肌率(x_5)5个性状作主成分分析。结果表明:5个指标综合成4个主成分,累计贡献率达94.5143%,基本反映了原指标所提供的信息。     

生长期浙东白鹅血清中几种生长相关激素水平的变化

对浙东白鹅生长期血清中甲状腺激素(T3,T4)、胰岛素、胰高血糖素水平进行测定分析.结果表明:刚出雏时鹅血清中T3水平较高,为7.49±0.14 ng/mL,此后显著下降,至70日龄时又回升;而T4水平在出雏时较低,28日龄时显著升高(P<0.05),于42日龄达最高水平;血清胰岛素和胰高血糖素水平的发育性变化模式相似:出雏时较高,分别为10.80±0.84 IU/mL,407.8±15.2 IU/mL,14日龄时均显著下降,此后呈阶段性变化,分别在70日龄和42日龄时出现较高水平.浙东白鹅的增重速度变化与血清中T3、胰岛素水平的变化一致,而与T4、胰高血糖素水平的变化关系不显著.     

鹅PRL基因克隆及在繁殖相关组织中的表达规律

以浙东白鹅为研究对象,采用克隆、测序技术获得浙东白鹅PRL基因789 bp的cDNA序列,包括了690 bp的编码区,编码229个氨基酸。并与其他物种进行同源性比较,发现该基因序列与其他鹅 PRL序列相比发生了A170G、T315C、C316A、C318T、T516C、G617A突变;其中A170G发生了氨基酸H→R的变化,C318T处发生了氨基酸H→N 的变化,G617A发生了氨基酸R→H的变化。与禽类PRL基因核苷酸和氨基酸序列同源性均在92．9％以上,与人和哺乳动物同源性在51．8％～77．2％之间。利用实时荧光定量PCR技术检测鹅产蛋期到就巢期PRL基因在相关组织中的表达变化。在产蛋期和就巢期,垂体中PRL基因表达量显著高于其他3个组织,下丘脑、卵巢、输卵管3个组织之间PRL基因mRNA表达量没有显著性差异。就巢期组织中 PRL基因表达量极显著高于产蛋期同一组织中mRNA 表达量。     

葡萄糖对鹅原代肝细胞增殖的影响

【目的】探讨葡萄糖对鹅肝细胞增殖能力的影响。【方法】以四川白鹅为供试动物,采用半原位二步胶原酶灌注法采集鹅的肝细胞,之后用含不同浓度(0(对照组,CK),5,20,35mmol/L)葡萄糖的培养基培养鹅原代肝细胞,培养48h后用BrdU免疫荧光染色检测BrdU阳性细胞率,BrdU-ELISA法检测肝细胞DNA含量,ELISA法检测Cyclin D1蛋白质量浓度。反转录聚合酶链式反应检测细胞增殖相关基因(Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin D3)的mRNA表达水平。【结果】与对照组比较,20和35mmol/L葡萄糖可以显著增加BrdU阳性细胞率,并可以明显提高原代肝细胞的DNA含量;5和20mmol/L葡萄糖对Cyclin D1蛋白质量浓度影响不显著,而35mmol/L葡萄糖对Cyclin D1蛋白质量浓度有显著促进作用。Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin D3的mRNA表达水平随着葡萄糖浓度的增加而升高,其中35mmol/L葡萄糖的促进作用明显大于其他处理。【结论】葡萄糖能够促进鹅原代肝细胞的增殖。     

PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究蛋白酶体β5亚基(proteasome subunit beta type-5, PSMB5)对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNAsi-RNA-PSMB5 (si-PSMB5),构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5(pcDNA-PSMB5),采用(Lipofectamine)3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分...     

提高养鹅效益的技术措施

1.品种选择鹅的品种较多,在实际生产中,如果以肉用为主,应选用饲料消耗少、生长速度快、产肉率高的中型鹅种,如浙东白鹅、太湖鹅等;如果以产肥肝为主,则应选择朗德鹅、广东狮头鹅等;如果以产蛋为主,则应选养山东莱阳"豁眼鹅"(年产蛋量     

小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定

采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞,应用差速贴壁法进行纯化,并利用RT-PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。结果显示:分离出的肌卫星细胞生长状态良好,RT-PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达,诱导分化形成肌管后,分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞,并具有很好的体外分化能力,可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。     

北京油鸡骨骼肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及成肌诱导分化的研究

【目的】探讨体外培养条件下北京油鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定的方法,建立适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,为今后进一步研究北京油鸡骨骼肌卫星细胞提供技术平台。【方法】以15日龄的鸡胚胸肌为材料,采用联合酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化细胞,使用Pax7、Desmin、Myod等骨骼肌卫星细胞的特异性标志对所得细胞进行免疫荧光鉴定,随后进行成肌诱导分化,并比较了3种培养体系对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。【结果】细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,证实所培养的细胞为北京油鸡骨骼肌卫星细胞;成肌诱导后,细胞相互融合形成多核的肌管,成肌特异性标志MHC表达呈阳性;对不同扩增培养体系比较,结果表明,培养体系DMEM/F12+15%FBS+2.5ng·mL-1bFG最有利于北京油鸡骨骼肌卫星细胞的增殖。【结论】该试验成功地分离并鉴定了北京油鸡骨骼肌卫星细胞,建立了适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,同时成功地进行了成肌诱导分化,为今后研究北京油鸡骨骼肌生长和发育的机理提供了技术平台。     

Effect of MSTN Propeptide and shRNA Co-expression Vector on Proliferation of Skeletal Muscle Satellite Cells

Myostatin(MSTN)is a negative regulator of skeletal muscle growth,in order to study the effect of inhibition MSTN expression on the proliferation of bovine skeletal muscle satellite cells,we constructed co-expression vector pcDNA3.1-ProMSTNshRNA,transfected it into muscle satellite cells by Liposome 2000,and detected cell proliferation changes by CCK-8 method and flow cytometry after 48 h.The expressions of P21 and CDK2 were detected by Western blot and real-time PCR.The results showed that the cell vitality of experimental groups significantly increased than that of the negative control,and cells in S phase also increased significantly(P<0.05).After knocked down MSTN gene,P21 expression decreased(P<0.05),but CDK2 gene expression increased(P<0.05).These results indicated that MSTN gene expression was associated with P21 and CDK2,the proliferation of skeletal muscle satellite cells could be promoted while MSTN was inhibited,which provided a theoretical basis for the study on transgenic cattle.     

TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制

【目的】卵泡抑素（Follistatin）能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积,可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组 Follistatin处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞,阐明TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化14 d的鸭胚为试验材料,采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞,待细胞长到70%-80%时,将培养基换成含有浓度分别为0、1、10、100 ng·mL^-1的Follistatin培养基,继续培养36 h后,采用CCK-8检测骨骼肌卫星细胞增殖情况;使用抗pax7抗体染色,DAPI染核,鉴定骨骼肌卫星细胞;采用real-time qPCR方法检测Follistatin对骨骼肌卫星细胞增殖过程中的标记基因PCNA、生肌因子基因MyoD和TGF-β信号通路中TGF-β、Smad2和Smad3的表达的影响。【结果】在倒置显微镜下观察,传代培养12 h鸭骨骼肌细胞一部分未贴壁呈圆形,一部分贴壁呈梭形。24 h后细胞全部贴壁,细胞略有变长。2 d后细胞继续增多,且呈长梭形。3 d后细胞数目增加,个别细胞融合。4 d后细胞数目进一步增加,细胞变粗,个别细胞融合。5 d后有少量细胞开始分化,细胞进一步融合。Pax7免疫荧光染色分析显示,95%以上的细胞中Pax7呈阳性表达;CCK-8检测细胞增殖分析表明,不同浓度的Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞后,各处理组细胞增殖均显著高于对照组(P＜0.01),且10 ng·mL^-1 Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞增殖效果最明显,为最佳处理浓度;与对照组相比,10 ng·mL^-1 Follistatin处理组的MyoD基因表达量显著下降(P＜0.05),PCNA基因表达量显著升高(P＜0.05),Myf5基因表达量显著升高,TGF-β和Smad2基因表达显著升高(P＜0.05),且Smad3基因表达量极限著升高(P＜0.01);Western blotting检测蛋白表达水平结果表明,与对照组相比,TGF-β、Smad2 和Smad3磷酸化水平也显著升高。【结论】10 ng·mL^-1 Follistatin能显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,这一过程可通过TGF-β/Smad信号通路实现。使用最佳Follistatin处理浓度能够显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,该研究为鸭骨骼肌生长发育调控机理研究奠定分子基础。     

IL-15过表达对猪骨骼肌细胞成肌分化的影响

【目的】研究肌肉因子IL-15（interleukin 15）对猪骨骼肌成肌细胞增殖与凋亡的影响,为进一步研究IL-15在动物肌肉品质调控和骨骼肌疾病治疗提供依据。【方法】构建IL-15过表达慢病毒载体GV-492-IL-15,体外无菌分离培养猪骨骼肌卫星细胞,诱导分化,并通过免疫荧光染色进行成肌细胞验证。将成肌细胞转染IL-15过表达重组慢病毒载体,试验分别设置空白对照组（Control）、转染阴性对照病毒组（IL-15-）和转染GV-492-IL-15（IL-15+）慢病毒试验组（n=3）。培养72 h后,收集细胞和培养上清液。分别采用实时定量PCR（qRT-PCR）和Western Blot技术分析目的基因和蛋白的表达情况,采用ELISA试剂盒分析培养液中IL-15含量,采用CCK-8试剂盒分析成肌细胞活力,采用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡,采用Western Blot技术检测与细胞凋亡密切相关的caspase-3蛋白表达水平的变化。【结果】（1）经鉴定后的质粒转染293T细胞,细胞内可观察到明显的绿色荧光,经Western Blot检测,可以观察到20 kD附近处有特征条带;（2）分离培养的猪骨骼肌卫星细胞呈梭形或纺锤形,诱导后可分化为呈管状的成肌细胞。将分化后的成肌细胞,进行α-SMA单克隆抗体免疫荧光染色,视野中90%的细胞呈阳性反应,胞浆染成红色,表明细胞为骨骼肌成肌细胞。（3）转染GV-492-IL-15慢病毒后,与对照细胞组相比,成肌细胞内IL-15 mRNA和蛋白相对表达量均极显著升高（P<0.001）,但培养液中IL-15蛋白水平变化不大（P>0.05）。CCK-8结果显示,过表达IL-15可增强细胞的增殖能力（P<0.05）。与对照组相比,转染GV-492-IL-15慢病毒的细胞早期凋亡率差异不显著（P>0.05）,但细胞晚期凋亡率显著下降（P<0.05）。与对照组相比,转染慢病毒组细胞中caspase-3蛋白有下降的趋势,但差异不显著（P>0.05）。此外,转染IL-15过表达慢病毒可使G1期细胞比例显著下降,S期和G2/M期细胞比例显著升高（P<0.05）。【结论】在正常生理条件下,IL-15是定位在细胞内并发挥作用的,IL-15过表达对猪骨骼肌成肌细胞早期凋亡没有显著影响,但可以抑制其晚期凋亡,并促进细胞增殖。这一研究将为IL-15正向调控猪骨骼肌肌肉品质和治疗相关肌肉疾病提供技术和理论依据。     

骨骼肌卫星细胞生物学特性及在肌肉损伤修复中的应用前景

卫星细胞是生肌干细胞的唯一来源.卫星细胞在骨骼肌受到损伤后的修复过程中起着超乎寻常的作用.综述了骨骼肌卫星细胞的生物学特性以及其在在肌肉损伤中的修复作用,并对其在临床应用中的前景进行了展望.     

Effects of Soybean Isoflavones on In vitro Antioxidative Capacity of Satellite Cells of Porcine Skeletal Muscles

A synthetic isoflavone (ISO-S) or genistein was added in culture medium at different concentrations (0,10,20,30,40,and 80 pmol L-1) to investigate the effects of soybean isoflavones on antioxidative capacity of porcine skeletal muscle satellite cells.After 48 h incubation,the suspension was cryopreserved for the determination of superoxide dismutase (SOD),catalase (CAT),glutathione peroxidase (GSH-Px) activities,and malondialdehyde (MDA) content.The mRNA levels of SOD,CAT,and GSH-Px gene in cells were detected with Taqman fluorescent probe method.The results showed that the content of MDA and the activities and the mRNA levels of SOD of porcine skeletal muscle satellite cells were influenced by supplemented soybean isoflavone (P<0.05) when adding 10-80 gmol L-1 ISO-S or genistein in the medium.The MDA contents,SOD and CAT activities and their mRNA expression levels of porcine skeletal muscle cells responded quadratically P(<0.05) as the level of ISO-S or genistein increased.Pre-incubation of porcine skeletal muscle satellite cells with ISO-Sor genistein at 10-40 pmol L-t elevated the activities and the mRNA expression levels of SOD and CAT in cells concurrently and decreased the cellular content of MDA (P<0.05).The results indicated that pre-incubation of ISO-S or genistein at 10-40 pmol L-1 could improve the antioxidative capacity of porcine skeletal muscle satellite cells.