禽流感血凝抗原(H5亚型,Re-6株)的制造试验

1材料和方法生产用毒种的繁殖。将毒种用灭菌生理盐水作1万倍稀释,尿囊腔内接种10日龄无特定病原(SPF)鸡胚,每胚0.1毫升,置36℃孵育,收获接种72小时的感染鸡胚液,装于灭菌容器内。将检验无菌且1%鸡红细胞悬液凝集(HA)效价≥10 log2的鸡胚液混合,定量分装,-70℃冷冻保存。     

禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原国家标准品的研制

按照国家一级标准物质的要求,研制了禽流感病毒H9亚型(株)血凝抑制试验抗原国家标准品.对标准品的物理性状、无菌、效价、特异性、水分、真空度、均一性、稳定性等进行测定,各项指标均符合要求。经过8家单位对其协作标定,并经统计学分析,该批抗原血凝效价为460?80,最终定值为400。该禽流感病毒H9亚型(株)血凝抑制试验抗原可以作为国家标准品,批号为200901。     

用于检测禽流感H5N1亚型Re-4、Re-5株免疫抗体血凝抑制试验试剂的分析

禽流感是由甲型流感病毒引起的一种常见禽类传染病,可分为低致病性禽流感（low pathogenic avian influenza,LPAI）和高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza,HPAI）。低致病性禽流感病毒病原体从禽类等储存宿主传播给鸡鸭等易感家禽后,再经若干次循环感染,就可能发生一系列突变而转变为具有严重致死性的高致病性禽流感病毒。该病的毒型众多、变异性极强、低致病性毒株能在短期内变成高致病性毒株（HPAIV）,从而给养禽业带来毁灭性打击。许多研究表明,     

重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型、Re-6株)在林下放养鸡群中的免疫效价跟踪测定

用血凝与血凝抑制试验方法对林下放养鸡群注射重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型、Re-6株)后的抗体效价进行跟踪检测,结果表明:(1)经20 d后能获得较高的免疫效价保护,在4~5周时获得最高值,而后开始以每2周4个百分点的速率下降;(2)禽流感二免加强免疫后不能在2周内使免疫效价提高,但在1个月后能重新获得较高的免疫效价,并保持比较均衡的状态。建议对种禽场所供禽苗实行强制母源抗体检测,以科学确立首次免疫时间。     

重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株)免疫抗体监测分析

为评估我省使用重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株)后的鸡群免疫效果,更好的开展禽流感防控工作,笔者对2014-2015年全省春、秋防及日常监测所采集的规模养鸡场及散养户样品进行了免疫抗体检测与分析.检测结果表明,江苏省H5亚型高致病性禽流感Re-6株平均免疫抗体合格率为96.84%;Re-7株平均免疫抗体合格率为95.95%.大部分地区的免疫抗体效价呈现较高的一致性.种鸡场的H5亚型禽流感免疫效果整体最好.2015年H5亚型高致病性禽流感Re-6株和Re-7株的免疫效果均高于2014年.     

新城疫、禽流感H5亚型(Re-5株)抗体水平监测

新城疫以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。目前出现的鸡新城疫发病率一般在10%～25%,死亡率在15%～35%,产蛋鸡产蛋率下降30%左右,是危害养禽业的一种主要传染病。禽流感(AI)则是由A型流感病毒引起的一种禽类急性、热性、败血性、高度接触性传染病,不仅给     

重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)免疫抗体监测与分析

为评估我省使用重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)以来的鸡群免疫效果,笔者对2016年全省春防、秋防、定点监测及日常监测所采集的规模养鸡场及散养户样品进行了免疫抗体检测与分析.检测结果表明,江苏省H5亚型高致病性禽流感Re-6株平均免疫抗体合格率为96.39%;Re-7株平均免疫抗体合格率为95.75%;Re-8株平均免疫抗体合格率为95.56%,均超过国家和我省规定的免疫要求.大部分地区的免疫抗体合格率呈现较高的一致性.在种鸡场、商品代饲养场(户)、散养户中,种鸡场的免疫效果最好.     

重组禽流感灭活疫苗（H5N1,Re-1株）免疫效果比较试验

选用2个厂家生产的重组禽流感灭活疫苗（H5N1,Re-1株）免疫慢大型鸡群,于1、7、13、16、18日龄采用HI血凝抑制试验测定其母源抗体水平,确定其首免时间为18日龄;于23、28、36、42、56、70日龄采用HI血凝抑制试验测定其免疫后抗体水平,结果表明：对慢大鸡产生的H5抗体效价,A、B组差异显著（P<0.05）; A、C组差异极显著（P<0.01）;B、C组差异极显著（P<0.01）;对慢大鸡产生的H9抗体效价,A、B组差异不显著（P>0.05）;A、C组差异显著（P<0.05）;B、C组差异极显著（P<0.01）,但在同等免疫剂量条件下,一定时间内,两个厂家生产的重组禽流感灭活疫苗（H5N1,Re-1株）对慢大型鸡均能产生较快、较高水平的H5抗体效价。     

H5亚型禽流感灭活疫苗免疫后鸡血凝抑制抗体动态变化观察

选择国家指定的两个厂家生产的禽流感灭活疫苗(H5亚型,N28株)进行无母源抗体来航鸡的免疫试验.通过鸡免疫后血凝抑制(HI)抗体的动态性检测,对两个疫苗的免疫效果进行了观察.研究结果表明,两个疫苗均具有良好的免疫效果,但也存在一定程度的差异;加强免疫可以明显提高抗体水平,延长免疫保护时间.     

两种禽流感H5N1亚型Re-5株灭活疫苗免疫效果的比较

为了解湖南省招标的两种禽流感H5N1亚型Re-5株疫苗免疫家禽后抗体消长规律,研究探讨禽流感疫苗合理使用的免疫程序,以期为今后有效指导禽流感防控实践提供科学依据,对鸡和鸭分别做了免疫试验.试验结果显示,两种禽流感灭活疫苗均能诱导机体产生良好的免疫应答,但在一次免疫的情况下,鸡产生的HI抗体滴度要比鸭的高,鸡的HI抗体滴...     

禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原国家参考品的研制

按照国家一级标准物质要求和禽流感病毒（H5亚型）血凝抑制试验抗原制造及检验规程规定的抗原制备方法,研制了一批禽流感病毒（H5亚型）血凝抑制抗原国家参考品,用于检测禽流感病毒（H5亚型）制品生物效价和血凝抑制操作过程中的校验。该批抗原经过8家单位对其协作标定后对结果进行统计学分析,确定该批禽流感抗原的血凝效价为1：80。另对所研制的禽流感抗原均一性、稳定性、无菌检验、剩余水分测定、真空度测定等各项指标进行检测,结果均符合禽流感病毒（H5亚型）血凝抑制试验抗原制造及检验规程和国家一级标准物质要求。说明该禽流感病毒（H5亚型）血凝抑制抗原可以作为国家参考品。     

重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗对鸡和鸭的免疫效果观察

H7N9流感变异毒株的出现给我国家禽养殖业造成了严重的疫情风险。为了解和评估新型重组禽流感H5+H7二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)的免疫效果和抗体消长规律,我们开展了鸡、鸭现场免疫试验。监测结果表明,该疫苗对蛋鸡和蛋鸭都具有良好的免疫效果,H5和H7亚型免疫抗体水平在免疫后2周均能达到100%的免疫合格率。对雏鸡也具有较好的免疫效果,免疫一次时H5和H7亚型抗体合格率分别在一免后3周和2周达到70%以上,并维持到一免后13周;进行二次免疫后,H5和H7亚型抗体合格率在二免后1周都达到100%。对雏鸭的免疫效果相对较差,一次免疫的H5亚型抗体水平不能达到70%的免疫合格标准,二免后1周H5和H7亚型抗体合格率均能达到80%以上,必须加强免疫一次才能达到满意的免疫效果。     

一例输入型H6N1亚型禽流感的检测分析

为确认进口食品中的禽流感病毒(AIV)携带状况,对从台湾地区进口的冻鸡食品进行了禽流感带毒情况检测,并对病毒进行了分离、全基因组测序和致病性试验。序列分析结果显示:分离的AIV为H6N1亚型病毒,与台湾本地流行的毒株同源性最高;分离株的HA裂解位点基序为PQIATR/G,符合低致病性禽流感病毒的分子特征;HA蛋白受体结合位点处第186、190、226和228位氨基酸残基分别为脯氨酸(P)、缬氨酸(V)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S),具有结合人样流感病毒受体的分子特征。SPF鸡试验结果显示,分离株的静脉致病指数(IVPI)为0,为低致病性AIV。Balb/c小鼠感染性结果显示:分离株可在小鼠下呼吸道和肺脏中复制;高剂量感染可使小鼠体重发生轻微变化,但未表现明显临床症状。检测结果表明,该H6N1亚型毒株虽然目前致病力较弱,但有突变为高致病性毒株风险,对人类和家禽存在潜在威胁。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒的遗传稳定性分析及滴度测定

研究表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒pAd-H5的遗传稳定性及重组病毒的滴度。将重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15和20代的重组病毒采用PCR方法扩增禽流感病毒HA基因,并进行基因序列分析;用标记为GFP的快速测定法计算出20代次时重组病毒的滴度。从各代重组病毒DNA中均扩增出了约1700bp的目的条带,与HA基因片段长度一致。基因序列分析表明:第5、10、15代重组病毒中的HA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有1处发生了点突变(即HA基因417位A→G),但其编码的氨基酸未发生变化(即同义突变),表明表达的目的蛋白抗原表位未发生变化;计算出的重组病毒滴度为108.875pfu/0.1mL。重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,具有良好的遗传稳定性,重组腺病毒的病毒滴度相对较高。     

Multiplication of the Recombinant Strain Re-7 of Avian Influenza Virus Subtype H5 in MDCK Cells

This study was conducted to explore the multiplication pattern of the recombinant strain Re-7 of avian influenza virus subtype H5 in Madin Darby Canine Kidney(MDCK) cells and to determine the optimal multiplicity of infection(MOI) and the optimal time for virus harvest. The recombinant strain Re-7 was inoculated at different MOIs into MDCK cells grown in serum-free medium in 100 L bioreactors for replication. Then,the hemagglutination(HA) titer, 50% tissue culture infectious dose(TCID50) and 50% embryo infectious dose(EID50) of culture medium were measured once every 12 h from 24 h after virus inoculation to determine the optimal MOI. After that, virus was inoculated at the optimal MOI deter-mined above into MDCK cells for large-scale virus replication to determine the optimal time for virus harvest. The results showed that the optimal MOI was 10~(-2), and the optimal time for virus harvest was 60 h after inoculation. Under these conditions, the HA titer, TCID_(50) per 1 m L and EID50 per 0.1 m L were increased to 1∶102 4, 10~(7.33) and 10~(6.83), respectively. This study provides relatively stable parameters for large-scale production of the recombinant strain Re-7 of avian influenza virus subtype H5.     

Pathogenicity of a Strain of H5N6 Subtype Avian Influenza Virus in Ducks and Mice

To investigate the pathogenicity of A/Hero/Guangdong/C1/2013(H5N6), an AIV strain isolated from Heron on ducks and mice, pathogenicity of this new virus strain and changing of histopathology as well as a preliminary study on its biological characteristics were studied by virus challenges test via intranasal and eye-drop and in chicken via jugular vein injection.Results showed that the EID₅₀ of this strain of virus was 10^-8.16/0.1 mL in embryonated chicken eggs and the intravenous inoculation of pathogenic index (IVPI) was 2.76.In ducks and mice, the 50% lethal doses (LD₅₀) of it were determined to be 10^-4.0/0.2 mL and 10^-4.67/0.05 mL, respectively.Symptoms of infection included loss of appetite, depression, swollen head and tears after being infected with 10⁶ EID₅₀ per duck by intranasal and eye-drop administration.Most of ducks died 4 to 7 days post-infection, liver, lung and kidney still eliminated toxicants at day 7 post-infection.Anatomy showed symptoms of pericardial effusion, pulmonary congestion and kidney enlargement, while pathological section showed pathological change like karyopycnosis and inflammatory cell infiltration in heart, liver, kidney and spleen.Mice developed symptoms of infection like loss of appetite, depression, shaggy coat and ruffled coat after being infected with 5×10⁵ EID₅₀ per mouse by intranasal and eye-drop administration.Most of the infected mice died 5 to 7 days post-infection and only liver still eliminated toxicants at day 7 post-infection.Although organ anatomy showed no obvious pathological changes, pathological section showed pathological changes like karyopycnosis and inflammatory cell infiltration in heart, kidney and lung.Our research demonstrated that this H5N6 subtype AIV had a strong pathogenicity and could be defined as a highly pathogenic AIV strain as its IVPI was greater than 1.2.Our work laid a theory foundation for study, prevention and control of H5N6 subtype AIV.     

一株H5N6亚型禽流感病毒对鸭和小鼠的致病性研究

为了研究一株从鹭中分离到的禽流感病毒(AIV)A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)对鸭和小鼠的致病力,本研究通过对鸭和小鼠滴鼻点眼和鸡的颈静脉注射进行攻毒试验,观察其致病力和组织病理学等变化,对其生物学特性进行初步研究。结果显示,该毒株的鸡胚半数感染量(EID₅₀)为10^-8.16/0.1 mL,静脉接种致病指数(IVPI)为2.76。对鸭的半数致死量(LD₅₀)为10^-4.0/0.2 mL,对小鼠的LD₅₀为10^-4.67/0.05 mL。以10⁶ EID₅₀/只滴鼻点眼感染鸭,主要表现为食欲下降、精神萎靡、肿头流泪等症状,大多数鸭在感染后4~7 d死亡,感染后第7 天肝脏、肺脏、肾脏仍在排毒,解剖可见心包积液、肺脏淤血、肾脏肿大等症状,病理切片可见心脏、肝脏、脾脏、肾脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。以5×10⁵ EID₅₀/只滴鼻感染小鼠,主要表现为食欲下降、精神萎靡、被毛粗乱、聚堆等症状,大部分小鼠在感染后5~7 d死亡,第7天时只有肺脏仍在排毒,各脏器解剖学病变不明显,病理切片可见心脏、肾脏、肺脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。研究结果表明,该H5N6亚型AIV毒株对鸭和小鼠具有很强的致病力,IVPI大于1.2,为高致病性AIV,本研究为H5N6亚型AIV研究和防控提供了理论基础。