双峰驼肝微粒体的制备及CYP1A酶活性检测

为研究双峰驼细胞色素氧化酶1A(CYP1A)的体外活性,首先采用差速离心法制备双峰驼肝微粒体,并用BCA法测定其蛋白浓度;然后采用CO还原差示光谱法分别测定CYP总酶含量和细胞色素b5含量;最后通过CYP1A酶对7-乙氧基香豆素的脱羟基作用评价其体外活性。结果表明,所制备的双峰驼肝微粒体悬液蛋白浓度为1.652mg/g±0.341mg/g,CYP总酶含量为0.08nmol/mg±0.014nmol/mg,细胞色素b5(Cybts)含量为0.113nmol/mg±0.036nmol/mg,且CYP1A酶具有降解其特异性底物-7-乙氧基香豆素的活性。说明所制备的双峰驼肝微粒体悬液蛋白浓度、CYP总酶和Cytb5含量以及CYP1A酶活性等基本参数均能满足后续的双峰驼CYP1A酶体外活性研究基本要求。     

双峰驼CYP2D6酶体外孵育体系的建立与优化

为了研究双峰驼CYP2D6酶体外活性,建立双峰驼肝微粒体孵育体系并对孵育体系中探针底物浓度、肝微粒体蛋白浓度和孵育时间等进行优化研究。首先采用改良差速离心法制备双峰驼肝微粒体、BCA法测定双峰驼肝微粒体蛋白浓度、CO还原差示光谱法检测CYP总酶含量,然后采用HPLC法跟踪检测孵育体系中CYP2D6酶特异性底物的主要代谢产物去甲右美沙芬含量进而优化孵育条件。结果表明,双峰驼肝微粒体蛋白浓度为5.565 0mg/mL±0.519 7mg/mL,CYP总酶含量为0.177 7nmol/mg±0.050 3nmol/mg;肝微粒体孵育体系的最适底物浓度为250μg/mL,肝微粒体蛋白浓度为5.565 0mg/mL,最适孵育时间为40min。所制备的双峰驼肝微粒体各项指标和优化后的肝微粒体孵育条件均能满足后续对双峰驼CYP2D6酶体外活性研究的基本要求。     

应用特异性探针药物分析双峰驼CYP2D6酶体外活性

动物CYP酶是代谢药物、外源性化学物质和内源性化合物的超家族酶系,其中CYP2D6亚酶虽然只占动物肝CYP酶系的2%,却承担着约20%左右的药物代谢。作者旨在较为系统地研究双峰驼CYP2D6酶的体外活性及其对特异性抑制剂的敏感性。采用差速离心法制备双峰驼肝微粒体,借助BCA法和CO还原差示光谱法测定肝微粒体蛋白浓度和CYP总酶含量。并在优化肝微粒体孵育体系及建立CYP2D6酶的特异性底物氢溴酸右美沙芬及其活性代谢产物去甲右美沙芬高效液相色谱法的基础上,研究双峰驼CYP2D6酶的动力学特征、底物代谢率及特异性抑制剂奎尼丁对该酶的抑制作用。结果表明,双峰驼肝微粒体蛋白浓度、CYP总酶含量均能满足试验要求。建立的测定酶底物和产物的HPLC法灵敏度高、稳定性好,且各成分分离完全、峰形良好、无干扰。双峰驼CYP2D6酶的Vmax值为(0.141 6±0.052 7)nmol·(min·mg)-1,Km值为(12.986 0±0.357 2)μmol·L-1。奎尼丁对双峰驼CYP2D6酶的半数抑制浓度IC50为(2.779 0±0.063 9)μmol·L-1。因此,该试验不仅为深入研究双峰驼CYP2D6酶体外活性成功建立并优化了反应体系,而且得出了双峰驼CYP2D6酶动力学参数和特异性抑制剂的IC50值,填补了该领域的空白。     

大蒜辣素对肉鸡肝组织中CYP1A2 mRNA表达及其酶动力学的影响

大蒜辣素(allicin)具有较好的抗菌、抗氧化等活性，有望作为一种抗生素替代品用于畜禽养殖业，但其对肝药物代谢酶的影响尚不清楚。本研究旨在探究大蒜辣素对肉鸡CYP1A2酶活性、编码基因的mRNA表达和酶动力学的影响，为其在生产实践中的合理使用提供参考。90只1日龄AA肉鸡适应性饲养4 d后随机分为对照组(基础日粮组)、大蒜辣素低剂量组(40 mg·kg^-1)和高剂量组(80 mg·kg^-1),处理组每天2次、连续42 d于饲料中添加大蒜辣素。给药后第14、28和42天时每组分别随机采集10只鸡肝组织，钙离子沉淀法提取肝微粒体，检测大蒜辣素对CYP1A2酶活性的影响；采用real time RT-PCR方法检测大蒜辣素对CYP1A2和核受体CXR mRNA表达的影响；进一步采用体外探针药物法测定了大蒜辣素对CYP1A2酶的抑制动力学参数。添加不同浓度大蒜辣素第14和28天，肉鸡肝微粒体中CYP1A2酶活性分别显著增加为对照组的1.2倍和1.4倍(P<0.05);而在第42天时低剂量和高剂量大蒜辣素分别使CYP1A2酶活性极显著减少至对照...     

细胞色素P4503A酶与双峰驼物质代谢的特性

细胞色素P4503A(CYP3A)是细胞色素P450(CYP)酶超家族在动物肝脏中最主要的功能形式,约占肝脏总CYP酶含量的30%,参与45%~60%常用药物在体内的代谢转化过程。人们对各种CYP3A酶开展较为系统的研究,包括CYP3A酶分子结构、遗传多样性、体内外活性及其影响因素等。论文从CYP3A亚家族的生物学特性、对内源性化合物和外源性化学物质代谢的意义、CYP3A基因的表达与调控、CYP3A酶的诱导与抑制及双峰驼CYP3A酶研究进展等方面加以综述。     

阿司匹林丁香酚酯对肝脏主要药物代谢酶活性的影响

采用SD大鼠和C57小鼠研究阿司匹林丁香酚酯(AEE)对肝脏主要药物代谢酶活性的影响。首先把研磨的AEE混悬在0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，配制成20 g/L的AEE混悬液。将SD大鼠随机分为2组，试验组每日灌喂1次AEE(54 mg/kg),空白对照组每日灌喂1次等量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。连续3周后随机处死一半，取其肝脏，制备肝匀浆液；剩余一半的SD大鼠，停药2周处死，取其肝脏，制备肝匀浆液。采用ELISA考察AEE对肝脏细胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP450)的影响。研究AEE对C57小鼠肝脏主要药物代谢酶活性的影响，方法同SD大鼠方法。结果显示，SD大鼠连续灌药3周后，AEE对CYP3A4、CYP2C19、CYP1A2的活性有一定的抑制作用(P<0.05),对CYP2C8的活性有一定的诱导作用(P<0.05);CYP2D6、CYP2C9无显著性差异(P>0.05);停药2周后，发现只有CYP2C19的活性没有恢复，而其余药酶活性都有一定的恢复，与正常组无显著性差异(P>0.05)。C57小鼠连续灌药3周后，AEE对CYP3...     

泰妙菌素对人CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6酶活性的影响

本研究通过建立人肝微粒体体外孵育试验,考察泰妙菌素对4种CYP450亚酶的探针底物睾酮、非那西丁、氯唑沙宗、氢溴酸右美沙芬代谢的影响,以反映泰妙菌素对人CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6酶活性的作用。试验分为3组:药物试验组、阳性对照组(不含NADPH)、阴性对照组(不含CYP450抑制剂),孵育体系为100μL,孵育试验在96孔板中进行。终止反应后使用高效液相色谱串联质谱仪(LC-MS/MS),以内标法检测96孔板中孵育液的剩余探针底物浓度。根据药物试验组与阴性对照组的探针药物代谢浓度之比,计算药物试验组的探针药物代谢率。使用Graphpad Prism 6.0软件,以药物试验组相对代谢率为纵坐标,药物浓度对数值为横坐标作图,计算试验组药物IC_(50)值。针对泰妙菌素与CYP3A4的孵育试验设置多个孵育时间点观察孵育时间对IC_(50)值的影响。试验结果显示,酮康唑对CYP3A4的IC_(50)值为0.044μmol/L,α-萘黄酮对CYP1A2的IC_(50)值为0.030μmol/L、4-甲基吡唑对CYP2E1的IC_(50)值为0.022μmol/L、奎尼丁对CYP2D6的IC_(50)值为0.096μmol/L。泰妙菌素对CYP1A2及CYP2D6的IC_(50)值均大于50μmol/L,对CYP2E1的IC_(50)值为0.045μmol/L,对CYP3A4的IC_(50)值为1.609μmol/L。延长泰妙菌素与CYP3A4的孵育时间(10～50 min)后,泰妙菌素对CYP3A4的IC_(50)值由1.609μmol/L增加至8.657μmol/L。本研究中4种亚酶常用抑制剂的IC_(50)值与参照值相近,表明所建立人肝微粒体体外孵育试验方法可靠。以IC_(50)值为指标显示泰妙菌素对CYP1A2和CYP2D6无抑制作用,对CYP2E1和CYP3A4存在强抑制作用,泰妙菌素可能是CYP3A4的可逆性抑制剂。     

硒对氟中毒雏鸡肝脏细胞色素P450酶系主要亚型的影响

本试验旨在研究硒对氟中毒雏鸡肝脏细胞色素P450酶系主要亚型活性(含量)的影响及CYP3A37基因转录情况.选取180羽7日龄健康雏鸡,随机分为3组,分别为正常组、氟中毒组和加硒组.正常组饲喂全价日粮;氟中毒组在正常日粮中添加氟化钠(NaF),使日粮中氟含量为1 000 mg·kg-1;加硒组在氟中毒组日粮基础上添加亚硒酸钠(Na2SeO3),使日粮中硒含量为4 mg·kg-1.分别在第30、60、90天从各组随机选取20羽鸡,采用比色法测定P450酶系主要亚型活性(含量),利用RT-PCR方法测定CYP3A37 mRNA转录水平的变化.在添加氟化钠后第30天,氟中毒组除细胞色素P450含量和氨基比林-N-脱甲基酶(AND)活性低于正常组外,其余各酶活性(含量)较正常组均有增加(P<0.05);在加硒组中,除NADPH-细胞色素C还原酶和苯胺-4-羟化酶活性低于氟中毒组外,其余各哑型酶活性(含量)均高于氟中毒组(P<0.05).第60天时,氟中毒组酶活性(含量)均极显著高于正常组(P<0.01);在加硒组中,除NADPH-细胞色素C还原酶和氨基比林-N-脱甲基酶活性略高于氟中毒组外(P>0.05),其余各亚型酶活性(含量)均极显著低于氟中毒组(P<0.01).第90天时,氟中毒组除细胞色素P450含量略高于正常组外(P>0.05),其余各亚型酶活性(含量)均极显著低于正常组(P<0.01);加硒组中细胞色素P450含量和NADPH-细胞色素C还原酶活性略低于氟中毒组,其余各亚型酶活性(含量)均高于氟中毒组.在各时间点氟中毒组CYP3A37 mRNA转录水平均明显高于正常组(P<0.01);加硒组中mRNA转录水平介于氟中毒组和正常组之间.结果提示,饲料中添加氟化钠和亚硒酸钠可使鸡肝脏细胞色素P450酶系各亚型活性(含量)及CYP3A37 mRNA转录水平发生明显变化.     

双峰驼CYP基因家族的比较研究

为探讨双峰驼(Camelus bactrianus)物质代谢途径的特殊性和独特的解毒能力是否与其CYP基因家族的特殊性有关,本试验在对双峰驼全基因组测序数据进行系统分析的基础上,采用基因注释及比较基因组学研究方法,对双峰驼CYP基因家族进行了分析。结果显示,在双峰驼基因组中首次发现63个CYP基因拷贝,分别属于17个CYP家族和38个亚家族;其中,有9个为多基因家族,且CYP2、CYP3和CYP4分别有27、6和7个成员,分别占双峰驼全部CYP基因的43%、10%和11%。与牛、马、鸡和人的CYP基因相比,双峰驼CYP基因亚家族的分布明显不同,在拷贝数上拥有较多的CYP2J和CYP3A。因此,双峰驼特有的某些生物学特性和代谢途径与其高拷贝数的CYP2J和CYP3A基因有一定关系,分析结果为进一步揭示双峰驼耐高盐和独特的解毒能力奠定了基础。     

双峰驼部分重要CYP酶研究进展

双峰驼之所以受大家瞩目是因为其拥有着与众不同的生物学特性,其在干旱、高温、荒漠草原等极端恶劣的环境条件下仍可保持正常的生理状态,在摄入比其他家畜高达8倍之多的盐碱情况下仍不患盐敏感性高血压。双峰驼的这些特点与其CYP酶系特殊性有一定的关系,因CYP酶系可参与机体多种内源性物质和外源性物质代谢过程,调节血管活性、调节炎症和应激反应等。论文结合新近的研究结果和相关文献,对双峰驼CYP酶系中CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2J和CYP3A等在肝脏微粒体中含量较高,而且对动物内源性和外源性物质代谢发挥关键作用的重点酶研究进展进行综述。     

矢车菊素上调CYP7A1表达促进脂肪变性L02细胞内胆固醇降解

为了研究矢车菊素对肝细胞胆固醇代谢的影响,以人肝细胞系L02为研究对象,采用软脂酸建立肝细胞脂肪变性模型并通过不同浓度矢车菊素处理,采用ELISA检测细胞内胆固醇及胆汁酸浓度,RT—PCR和Westernblot检测胆固醇降解限速酶CYP7A11i3．RNA及蛋白表达水平。结果显示：与空白组相比,10g／L和30g／L软脂酸组L02细胞内胆固醇水平随软脂酸浓度增加而升高（P〈0．05）,而胆汁酸水平没有明显变化,此过程伴随cYP7A1蛋白表达上调（P〈0．05）。舍有30g／L软脂酸的模型细胞组内添加5mg／L以上矢车菊素可显著降低细胞内胆固醇水平并同时增加胆汁酸浓度（P〈0．05）,此过程伴随CYP7A1mRNA及蛋白的显著上调（P〈0．05）;当矢车菊素添加剂量为20mg／L时,与模型组相比CYP7A1蛋白极显著上调（P〈0．01）。结果提示,矢车菊素能够通过促进L02细胞CYP7A1蛋白表达,实现促进脂肪变性肝细胞胆固醇代谢的调节作用。     

武夷岩茶茶多酚抑菌作用的研究

用纸片法测定了1.0、2.5、5.0、10mg/mL 4种浓度的武夷岩茶茶多酚对大肠杆菌、致病性大肠杆菌、李斯特氏沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等4种菌的抑菌效果。实验结果表明,茶多酚对4种菌均有明显的抑菌作用,其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强（P〈0.01）,4种浓度的抑菌圈分别为1.82±0.44～3.34±0.18（cm）;对李斯特氏沙门氏菌、大肠杆菌、致病性大肠杆菌的抑菌作用次之,抑菌圈分别为1.73±0.18～2.05±0.14（cm）;1.46±0.33～1.85±0.32（cm）;1.1±0.14～1.61±0.25（cm）。1mg/mL的茶多酚对4种菌的抑菌作用均小于同剂量的青霉素和庆大霉素（P〈0.01）。     

复方盐酸头孢噻呋混悬剂的药代动力学研究

利用药物动力学的方法考察复方盐酸头孢噻呋混悬剂是否具备缓释长效的特点,同时研究鱼腥草油对头孢噻呋药代动力学的影响。36只SPF大鼠随机平均分成三组:A组单剂量注射复方盐酸头孢噻呋混悬剂,B组单剂量注射盐酸头孢噻呋混悬剂,C组单剂量注射头孢噻呋钠粉针;三组注射剂量均为50 mg/(kg.bw)。采用反相高效液相色谱内标法测定血浆药物浓度,并以DAS2.0药动学程序和SPSS(11.0)统计软件对所得数据进行分析。A、B、C组药时数据均符合一级吸收二室模型(权重=1/cc),主要动力学参数如下:A组:T1/2Ka=(1.253±0.100)h,Tpeak=(2.000±0.000)h,Cmax=(35.203±5.732)mg/L,AUC=(229.51±18.278)mg.h/L;B组:T1/2Ka=(0.341±0.090)h,Tpeak=(1.000±0.000)h,Cmax=(43.919±1.51)mg/L,AUC=(188.488±9.611)mg.h/L;C组:T1/2Ka=(0.044±0.012)h,Tpeak=(0.167±0.000)h,Cmax=(159.091±19.971)mg/L,AUC=(128.554±6.625)mg.h/L。实验数据表明,复方盐酸头孢噻呋混悬剂肌肉注射后,其药物动力学特征表现为吸收缓慢,血药浓度平稳,消除半衰期延长,生物利用度高等特点,在临床上注射1次,连用3 d,可以维持有效血液浓度。     

Long-lasting enhancement of CYP activity after discontinuation of repeated administration of phenobarbital in dogs

We investigated how long in vivo hepatic cytochrome P450 (CYP) activity is enhanced even after discontinuation of repeated oral administration of phenobarbital (PB) in dogs using antipyrine clearance, which reflects hepatic CYP activity. A single antipyrine (5 mg/kg) was administered intravenously before and 34 days after the repeated oral administration of PB (5 mg/kg, bid) and 2, 4, 6, and 8 weeks after the discontinuation of PB in 5 dogs. Antipyrine clearance was increased by the repeated administration of PB, and remained increased 2 and 4, but not 6 and 8 weeks after the discontinuation of PB. The result suggests that hepatic CYP activity was enhanced by the repeated administration of PB, and this enhancement may last for at least 4 weeks even after its discontinuation.     

氟苯尼考磺酸盐在肉鸡体内的药物动力学初步研究

研究氟苯尼考磺酸盐在肉鸡体内的血药浓度及药动学特征。将12只健康三黄肉鸡,单次肌肉注射推荐治疗剂量（20mg／kg）的自制2％氟苯尼考磺酸盐。采用高效液相色谱法测定血浆药物浓度,所得数据用3P97药动软件进行分析后发现,血药浓度和时间关系符合一级吸收一室模型,选择的权重为1／C。主要药动学参数为T1／2kα：（0．28±0．04）h,T1/2Ke：（2．06±0．06）h,Cmax：（4．17±0．12）μg／mL,Tmax：（0．92±0．09）h,AUC：（16．89±0,35）μg／mL,V／F（c）：（3．52±0．13）L／kg,CL／F（s）：（1．19±0．03）L／（kg·h）,Ke：（0．34±0．01）／h,kα：（2．57±0．37）／h,A：（6．56±0．38）μg／mL。结果提示,氟苯尼考磺酸盐在肉鸡体内具有吸收迅速,分布广泛、峰浓度较高以及消除较快的动力学特征。     

盐酸小檗碱在鸡体内的药动学研究

探讨盐酸小檗碱在鸡体内的药动学特征。鸡以3mg／kg和50mg／kg剂量静脉注射和口服给药,采用HPLC法测定血浆中盐酸小檗碱的质量浓度。血药浓度-时间数据经DAS药代动力学分析软件处理,计算出药动学参数。结果表明：盐酸小檗碱静脉注射药时曲线符合三室开放模型,主要药动学参数分别为：t1／2β为（0．41±0．24）h,t1／2γ为（3．66±1．06）h,Vc为（25．49±21．77）L·kg^-1,CL为（43．20±16．21）L·h^-1·kg^-1,AUC为（78．92±30．58）μg·L^-1·h。盐酸小檗碱口服给药的药时曲线符合二室开放模型,主要药动学参数分别为：t1／2α为（1．87±0．76）h,t1／2β为（4．18±3.14）h,t1／2ka为（0．89±0．46）h,Tmax为（2．64±0．63）h,Cmax为（4．09±0．11）μg·L^-1,AUC为（26．18±10．73）μg·L^-1·h,绝对生物利用度为2．03％。鸡口服盐酸小檗碱的生物利用度低,消除较快。     

In vitro cytochrome P450-mediated hepatic activities for five substrates in specific pathogen free chickens

Total hepatic microsomal cytochrome P450 (CYP) content as well as in vitro CYP mediated activities for five substrates [bufuralol 1-hydroxylation, ethoxyresorufin O-deethylation, S-mephenytoin 4-hydroxylation, testosterone 6beta-hydroxylation, and tolbutamide hydroxylation] were measured in specific pathogen free male Japanese leghorn chickens and male beagle dogs. The Vmax, Km and intrinsic clearance (Vmax/Km) for these substrates were calculated and compared between animal species in order to evaluate the drug catalytic activity in chicken liver. The total CYP content in chicken (0.296 +/- 0.04 nmol/mg microsomal protein) was close to levels reported for other species including humans, cats, pigs and some nonmammalian vertebrates (e.g. snakes, frogs and trout fish), but was lower than levels measured in dogs (1.11 +/- 0.22) or recorded in guinea-pigs, hamsters, monkeys, mice, rabbits, rats, horse and ruminants. Bufuralol 1-hydroxylation, ethoxyresorufin O-deethylation, S-mephenytoin 4-hydroxylation, and testosterone 6beta-hydroxylation were lower in chickens than in dogs based on intrinsic clearance. On the other hand, tolbutamide hydroxylation was markedly higher in chickens than in dogs.     

氟氯苯菊酯在犬体内的药动学初步研究

研究自制1%氟氯苯菊酯浇泼剂在健康家犬体内的药代动力学特征。选用6条健康犬,以2mg/kg单剂量沿背中线浇泼,采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定犬血浆中氟氯苯菊酯浓度,用3P97药动软件处理药时数据,计算药代动力学参数。氟氯苯菊酯的药时数据符合一级吸收二室开放模型,主要药动学参数为:T1/2α为(3.622±1.079)h,T1/2β为(22.654±0.417)h,T1/2Ka为(1.684±0.240)h,AUC为(47.385±1.709)μg.mL-1.h,Tpeak为(4.165±0.187)h,Cmax为(1.902±0.064)μg/mL,Lagtime为(0.489±0.002)h。健康家犬单次给予氟氯苯菊酯浇泼剂后,吸收、消除均缓慢,药物在动物体内作用时间较长。