中华稻蝗几丁质酶基因10（OcCht10）的分子特性及功能

【目的】获得中华稻蝗（Oxya chinensis）几丁质酶基因10（OcCht10）的cDNA序列,预测其功能域,并做聚类分析明确该基因的系统发育关系。绘制OcCht10在5龄若虫不同组织部位和发育时间的表达图谱,研究其在中华稻蝗蜕皮过程中的生物学功能,为害虫防治提供高效安全的候选基因。【方法】从中华稻蝗转录组数据库搜索OcCht10 cDNA片段,经过blast分析、比对、拼接后,翻译为氨基酸序列,预测其功能域,并与其他昆虫几丁质酶家族基因进行聚类分析,进一步确认该基因的系统发育关系并进行准确命名;选取中华稻蝗5龄第6天不同组织部位及5龄若虫不同天数表皮样本,总RNA提取后反转录为cDNA模板,采用Real-time quantitative PCR（qPCR）方法获得OcCht10在5龄稻蝗若虫不同组织部位和不同发育阶段的表达谱;设计OcCht10 dsRNA引物,用试剂盒体外合成dsOcCht10,采用注射法进行RNA干扰;取注射24 h稻蝗表皮样本,用qPCR方法检测OcCht10基因沉默效率;并仔细观察dsRNA注射后稻蝗表型,统计其死亡率。【结果】经对中华稻蝗转录组数据库的搜索,获得OcCht10 cDNA片段长度为9 318 bp,开放阅读框为8 613 bp,编码2 870个氨基酸;其3′非编码区为705 bp,推测OcCht10 5'端有500多碱基尚未获得;预测其氨基酸序列具有多个结构域,包含有5个几丁质酶催化域和6个几丁质结合域;与其他昆虫几丁质酶基因聚类分析结果显示OcCht10属于昆虫几丁质酶家族基因Ⅱ组,该组基因与昆虫蜕皮相关;5龄若虫组织特异性分析表明该基因主要在表皮、前肠和后肠等外胚层发育而成的组织器官中表达,提示OcCht10可能参与表皮几丁质代谢;发育时间表达图谱表明该基因在5龄第6-7天,即蜕皮前的表皮中高表达,表明OcCht10可能负责蜕皮时表皮几丁质降解;5龄若虫第2天注射该基因的dsRNA,24 h后取表皮检测其干扰效率,结果显示该基因被沉默70%;与注射dsGFP的对照组相比,注射dsOcCht10 5龄若虫表现为龄期延长,旧表皮无法开裂,蜕皮受阻,昆虫无法正常活动导致死亡,死亡率达到100%。【结论】获得OcCht10的部分cDNA序列,该基因在昆虫蜕皮前表皮中高表达;OcCht10参与中华稻蝗的蜕皮发育,注射dsOcCht10可有效沉默靶基因,并导致试虫无法完成正常蜕皮而死亡。     

飞蝗几丁质合成酶2基因的表达特性、功能及调控

【目的】几丁质合成酶（chitin synthase,CHS）是昆虫几丁质合成过程中的关键酶之一,由于高等动物不存在该酶,而被认为是设计安全高效杀虫剂的潜在靶标。论文在已克隆得到飞蝗几丁质合成酶2基因cDNA序列（LmCHS2,GenBank登录号：GU067731）的基础上,进一步深入探讨该基因在不同发育时期的表达特性、功能及调控,为基于RNA干扰技术的飞蝗有效控制提供科学依据。【方法】根据已知LmCHS2 基因核苷酸序列,设计特异性表达引物,运用RT-qPCR技术研究该基因在卵、若虫及成虫期的表达特性;体外合成LmCHS2的dsRNA后,分别注射至成虫期第1天的雌虫和雄虫,收集第5天的中肠样本提取RNA,反转录成cDNA后,采用RT-qPCR方法检测LmCHS2沉默效果。解剖飞蝗整个肠道后,观察中肠的形态变化及围食膜的完整性,探讨该基因在成虫期的生物学功能;饥饿处理飞蝗不同时间后,再重新进食,观察试虫肠道的变化,进一步运用RT-qPCR技术检测LmCHS2的表达。【结果】LmCHS2在飞蝗卵发育的前期和中期几乎没有可检测到的表达,卵发育后期表达量急剧上升,在4龄、5龄若虫和成虫期稳定表达;分别对羽化后第1天的雌、雄成虫注射dsCHS2,与对照组相比,处理组试虫LmCHS2表达量均显著下降,且取食量明显减少,雌虫和雄虫死亡率分别达78%和85%;解剖消化道后发现,注射dsCHS2后飞蝗中肠几乎不含有食物,中肠和胃盲囊长度显著缩短;对中肠的组织学观察结果表明对照组飞蝗围食膜发育完整,而注射dsCHS2后围食膜被严重破坏甚至缺失;饥饿处理飞蝗48 h后,与对照组相比,饥饿组中肠几乎不含有食物,长度亦显著缩短。H&E染色结果表明,饥饿组围食膜被严重破坏,对照组围食膜结构完整,与RNAi的结果非常相似;重新进食后围食膜发育良好;饥饿处理24 h和48 h后LmCHS2的表达被显著抑制,重新进食0.5 h后,其表达量快速上调,表明进食影响LmCHS2的表达。【结论】LmCHS2参与中肠围食膜的形成,对飞蝗的生长发育至关重要,该基因的沉默影响中肠围食膜的完整性,使飞蝗对食物的消化吸收困难,最终因饥饿而死亡;此外,该基因的表达受飞蝗进食的调控。     

东亚飞蝗Toll-9受体基因及组织定位

采用RT-PCR争RACE方法获得了东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)Toll-9受体基因(Lm Toll-9)的部分cDNA序列(GeneBank登录号:EU573213),分析了该基因的组织表达特征.获得的cDNA包括3'端,长1231 bp,含一个长918 bp的开放阅读框,编码305个氨基酸,推测的氨基酸序列与其它昆虫的Toll-9受体基因有较高的相似性.东亚飞蝗Toll-9受体具有昆虫Toll受体家族的典型结构,包括胞内的TIR结构域和跨膜区域.半定量RT-PCR研究表明,LmToll-9基因只在东亚飞蝗的中肠组织中表达,而在东亚飞蝗的头部、脂肪体、后腿和血细胞中均没有发现LmToll-9基因的转录.     

中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶2基因的分子特性和生物学功能

【目的】研究中华稻蝗（Oxya chinensis）几丁质脱乙酰基酶（chitin deacetylase,CDA）基因的分子特性和生物学功能,为新型农药靶标筛选提供科学依据。【方法】采用生物信息学方法在稻蝗转录组数据库中搜索获得几丁质脱乙酰基酶基因cDNA序列,对其进行保守区域分析,选取赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、果蝇（Drosophila melanogaster）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、家蚕（Bombyx mori）和云杉卷叶蛾（Choristoneura fumiferana）等昆虫物种的同源序列与中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列进行聚类分析,进一步构建系统发育树;运用real-time PCR方法检测几丁质脱乙酰基酶基因在中华稻蝗5龄若虫不同组织部位和不同发育天数表皮中的表达特性;进一步采用RNA干扰（RNAi）技术研究该基因对中华稻蝗蜕皮发育的影响。【结果】在中华稻蝗转录组数据库中搜索获得2条几丁质脱乙酰基酶基因的cDNA全长序列,生物学软件分析其氨基酸,发现2条序列均具有信号肽,开放阅读框包含3个几丁质脱乙酰基酶保守区域：几丁质结合区（ChBD）、低密度脂蛋白受体区（LDLa）和几丁质脱乙酰基催化结合域（CDA）。聚类分析表明2条序列分别与所选用的5种昆虫CDA2聚为一支。剪切子聚类分析发现2条序列分别与5种昆虫CDA2a和CDA2b相聚为一支,综合序列分析和聚类结果,认为所获得的序列属于几丁质脱乙酰基酶2基因的2个不同剪切子,分别命名为OcCDA2a和OcCDA2b。定量PCR分析表明OcCDA2a和OcCDA2b均在中华稻蝗表皮、前肠和后肠中高表达;在5龄第1天的表皮中表达量较高,之后逐步下降,蜕皮前又略有上升;RNAi研究发现5龄第2天的若虫注射dsOcCDA2a或dsOcCDA2b 24 h后,与注射dsGFP的对照相比,目的基因表达量显著降低,沉默效率分别为96.72%和80.43%;进一步观察试虫的表型,与对照组相比,注射dsOcCDA2和dsOcCDA2a的大多数虫体出现龄期延长,脊线开裂,旧表皮不能顺利剥离而导致虫体扭曲,最终死亡。少数若虫在蜕皮前死亡,未出现异常表型,部分若虫虽蜕至成虫,但四肢无力,行动缓慢。死亡率分别达到87.5%和94.4%;注射dsOcCDA2b的试虫无可见表型,可正常蜕皮发育至成虫。【结论】中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶2基因具有2个剪切子,分别为OcCDA2a和OcCDA2b。OcCDA2a参与虫体蜕皮,对其生长发育起着重要的作用,该基因的沉默导致中华稻蝗因蜕皮困难而死亡,而OcCDA2b对中华稻蝗的生长发育没有影响。     

转Bt基因水稻对东亚飞蝗抗寒性的影响

为了探究转 Bt基因水稻对东亚飞蝗抗寒性的影响,在室内条件下以转 Bt基因水稻和非转基因水稻分别喂养东亚飞蝗3代,用过冷却点仪测定东亚飞蝗的过冷却点和冰点。结果表明,转 Bt基因水稻饲养的东亚飞蝗的4龄、5龄幼虫、成虫(雌和雄)的过冷却点分别为-5.89、-7.59、-6.64和-6.79,与对照组无显著差异。     

中华稻蝗几丁质合成酶1基因的mRNA表达及功能

【目的】研究中华稻蝗（Oxya chinensis（Thunberg））几丁质合成酶1（CHS1）基因的表达特性及其在生长发育过程中的作用,从而为实现基于RNAi的蝗虫有效控制提供理论依据。【方法】根据已知中华稻蝗几丁质合成酶1基因（OcCHS1）保守区域部分cDNA序列（GenBank登录号：HM214491）设计特异性表达引物,运用RT-PCR和qPCR研究时空表达特性;采用RNA干扰技术研究其生物学功能。【结果】OcCHS1在中华稻蝗各龄期都有表达,其体表为高表达,其次是气管,其它组织部位表达量低。RNA干扰试验发现,4龄第4天若虫注射OcCHS1的双链RNA（dsRNA）后,与对照组相比,OcCHS1 mRNA表达量被沉默了70.8%,稻蝗出现蜕皮时间延迟、不能完成蜕皮或腹部皱缩死亡等现象,注射dsOcCHS1组死亡率为85.2%,与对照组（7.4%）相比差异显著。【结论】几丁质合成酶1对中华稻蝗的生长发育具有重要作用,其主要参与体表和气管几丁质的合成。采用RNA干扰技术使该基因沉默后可导致中华稻蝗死亡。     

东亚飞蝗不同食料笼养试验研究

在东亚飞蝗示范试验区内笼养试验结果表明,东亚飞蝗喜食芦苇、稗草等禾本科和莎草科植物,不喜食苜蓿和香花槐等豆科植物,在东亚飞蝗灾区推广种植这两种植物可控制东亚飞蝗的发生。     

东亚飞蝗数值预测研究初报

采用１９８３～１９９２年平山县库区东亚飞蝗的观测值及水库脱水面积、气象因素等数值,利用微机分析了飞蝗的消长因素,进行定性定量数值预测,经７年回报,应用效果良好。     

苦瓜几丁质酶基因的克隆、表达及酶学特性分析

采用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),以苦瓜幼叶为材料克隆几丁质酶基因的cDNA序列,序列分析表明其包含了基因完整的编码序列,编码由333个氨基酸组成的几丁质酶,对所克隆的基因进行了原核表达和纯化.纯化的几丁质酶具有分解几丁质的生物活性.当底物质量浓度在100～400 mg·L-1时,几丁质酶分解底物的能力随底物浓度增加而增大;大于400 mg·L-1时,几丁质酶分解底物的能力反而降低;当底物质量浓度固定时,几丁质酶分解底物的量随反应时间延长而增多.苦瓜几丁质酶基因的克隆和表达将为研究其结构和生物学功能奠定基础.     

东亚飞蝗蝗蝻不同体色的AFLP分析

应用AFLP技术对来自不同种群的东亚飞蝗5龄蝗蝻的9种体色类型进行分析,结果表明:在东亚飞蝗不同体色的蝗蝻中,浅绿色、黄色、红色、黑色种群与散居型相关的绿色关系较近,而赤褐色、红绿色、灰色种群与群居型相关的褐色关系较近.     

东亚飞蝗烟雾载药防治技术

以海南西部甘蔗地与宿根甘蔗撩荒地的东亚飞蝗为对象,应用烟雾载药技术进行田间防治试验,施药量1500～3000mL.hm-2,采用样框法和目数法相结合调查药效,以罩笼法试验作旁证。罩笼结果表明,第3天虫口减退率达92.75%～100%;田间小区试验表明,在施药1d后蝗虫种群急剧减少,第7天虫口减退率达62.51%～95.87%,第15天校正防效维持在61.00%～82.61%之间,高于常规喷雾的40.32%～46.23%。在田间小区试验成功后,进行了1700hm2的大田推广试验,在1500～3000mL.hm-2施药量条件下,药后7d虫口减退率达78.27%～97.52%。烟雾载药技术可用于甘蔗地和宿根甘蔗撩荒地东亚飞蝗大发生时地面应急防控。     

海南东亚飞蝗的发生与防治

根据多年对海南东亚飞蝗的防治经验,总结了其在海南的发生特点,提出了可行的综合防治方法。     

温度对不同发育阶段东亚飞蝗酚氧化酶活性的影响

为比较昆虫发育时期免疫防御能力的强弱,对不同发育时期东亚飞蝗体外酚氧化酶活性的动态变化进行了测定和比较分析。结果显示:从东亚飞蝗不同发育时期看,1~5龄蝗蝻及雄成虫25℃时酚氧化酶活性达到峰值,雌成虫30℃时酚氧化酶活性达到峰值,雌虫酶活性高于雄虫;不同温度作用下,1~5龄蝗蝻在15~45℃温度变化中变化规律相似,1龄蝗蝻酶活性最低,2~4龄蝗蝻时期酶活性升高,5龄蝗蝻时酶活性达到峰值,成虫酶活性在30℃和45℃时,雌虫酶活性高于雄虫(P<0.05)。东亚飞蝗不同发育时期、不同温度作用下酚氧化酶活性动态变化显示了其免疫能力的强弱差异。     

不同提取方法对东亚飞蝗酚氧化酶活性的测定与比较

[目的]研究东亚飞蝗酚氧化酶活性及动态变化。[方法]通过不同抽提方法制备虫体体液和淋巴液,测定不同位点酚氧化酶活性及动态变化。[结果]血淋巴中酚氧化酶活性显著高于虫体体液中酚氧化酶活性,且雌虫酶活性显著高于雄虫;虫体体液内酚氧化酶活性随着体外放置时间的延长而显著增强;成虫血淋巴内酚氧化酶活性随着时间的延长而显著增强。[结论]酚氧化酶一部分存在于东亚飞蝗组织和细胞中参与虫体发育和构建,一部分存在于血淋巴中参与免疫防御作用。酚氧化酶稳定性非常强,是昆虫宽泛适应能力和强大免疫能力的有效保障。     

柳州市东亚飞蝗发生因子分析及防控对策

介绍了近年来柳州市东亚飞蝗的发生情况及发生演变态势,指出该市东亚飞蝗的暴发与当地的气候、环境、食料、天敌及人为因素有关。提出加强政府领导,蝗灾发生后及时启动蝗虫防控应急预案;开展蝗虫普查和监测工作,及时掌握虫情;开展宣传和技术培训,增强农民防蝗意识;加强药物防治等防控对策。     

碱法提取东亚飞蝗蛋白质的工艺条件

采用稀碱法对东亚飞蝗蛋白质的提取条件进行了研究,主要讨论了碱浓度、料液比、粒度、浸提时间、沉淀pH、沉淀时间等条件对蛋白质提取率的影响.单因素试验结果表明,较优的提取工艺条件为稀碱浓度1.5%(W/V),浸提时间2 h,虫粉粒度80目,料液比1:20,沉淀pH值4.5,沉淀时间1 h.     

东亚飞蝗储存蛋白基因LmiHex-2的克隆与表达分析

昆虫储存蛋白是在昆虫体内普遍存在的一种特异性淋巴蛋白,在昆虫的生长发育过程中发挥着重要作用。为分析东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis储存蛋白基因Lmi Hex-2的结构和时空表达特性,通过RACE技术获得了Lmi Hex-2基因2 171 bp全长c DNA序列,其中开放阅读框2 022 bp,编码673个氨基酸,预测分子量78.79 k Da。序列比对结果显示Lmi Hex-2基因c DNA序列与直翅目蝗总科储存蛋白基因c DNA序列的相似性达到82%~89%。RT-PCR结果显示Lmi Hex-2基因在东亚飞蝗卵和若虫阶段均有表达,5龄6 d时表达量最大;成虫中脂肪体表达量最高。通过贝叶斯法构建的系统发育树显示直翅目储存蛋白为单系群,昆虫血蓝蛋白与昆虫储存蛋白聚为姐妹群,二者均由甲壳纲血蓝蛋白进化而来。     

土壤含水量对飞蝗越冬卵孵化影响初探

春季土壤含水量可因各种原因发生变化,从而使东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensis）自然越冬的卵在春季处于不同含水量土壤的孵化环境中。关于春季不同土壤含水量变化对自然越冬蝗卵孵化情况影响的详细报道尚未见到。试验选取2008年4月5日、12日、17日和21日4个不同时期,对田间挖取的蝗卵用不同含水量的土壤（10％-26.5％）进行处理,以比较不同含水量土壤对春季自然越冬蝗卵在孵化方面的影响。结果表明,处理的越冬蝗卵在孵化率、卵孵化期持续天数、卵处理日期至孵化日期之间间隔天数（或孵化日期早晚）上的差别与不同含水量土壤处理有明显关系,与处理卵的日期早晚无明显关系。