BPI基因生物信息学分析及其在不同 猪群体中的遗传变异情况

[目的]明确猪杀菌性/通透性增加蛋白(BPI)基因中可能存在的SNP位点,并探讨BPI基因外显子10在上海地区5个猪群体中的多态性及其与抗病相关的优势基因型,为揭示BPI基因在仔猪腹泻抗病机制中的作用及开展猪抗病育种提供理论依据.[方法]采用在线生物信息学软件分别从碱基序列、SNP位点和蛋白氨基酸序列等角度比对分析猪BPI基因全长cDNA序列与电子克隆序列的差异,采用PCR-RFLP检测分析猪BPI基因外显子10的多态性,并检测BPI基因外显子10在杜洛克、长白、大白、申农和梅山猪群体中的基因型及基因频率.[结果]猪BPI基因电子克隆编码区(CDS)序列长度1452 bp,编码483个氨基酸,存在44个SNP位点,其中22个为同义SNP位点、22个为非同义SNP位点.猪BPI基因全长cDNA序列(EF436278.1和FJ810853.1)与电子克隆序列相比存在14处碱基差异,而对应的翻译蛋白序列存在4处氨基酸差异.猪BPI基因外显子10存在AA、BB和AB 3种基因型,各基因型在杜洛克猪、长白猪、大白猪、申农猪和梅山猪群体中的分布情况各不相同.在杜洛克猪群体中AA基因型和AB基因型呈中度多态分布(0.404和0.416),BB基因型检出比例较低(0.180);在长白猪和申农猪群体中均未检测出AA基因型,BB基因型检出比例较高,而AB基因型检出比例较低;在大白猪和梅山猪群体中均以BB基因型检出比例较高,AB基因型次之,AA基因型检出比例最低.总体来看,除了杜洛克猪群体的A等位基因频率较高外,其他4个猪群体均以B等位基因频率较高.[结论]猪BPI基因外显子10 AA基因型频率在杜洛克猪群体中最高,在大白猪和梅山群体中较低,在长白猪和申农猪群体中未检出,即AA基因型在杜洛克猪群体中比例高与其仔猪腹泻发病率低的情况一致.因此,在大白猪和梅山猪育种过程中需提高AA基因型比例,而在长白猪和申农猪育种过程中需引进AA基因型个体,降低BB和AB基因型比例,以增加仔猪的抗病能力.     

草鱼BPI/LBP基因的克隆及特征研究

【目的】克隆草鱼杀菌通透性增加蛋白/脂多糖结合蛋白（Bactericidal permeability-increasing protein/LPSbinding protein,BPI/LBP）基因的cDNA全长,分析其结构特征,研究其表达规律,为进一步探明其功能奠定基础。【方法】首先用同源克隆及快速扩增cDNA末端技术(RACE),克隆草鱼BPI/LBP基因的cDNA全长,然后用生物信息学方法分析BPI/LBP基因的结构特征,最后用半定量RT-PCR检测BPI/LBP基因在草鱼不同组织（血、脑、眼睛、前肠、中肠、后肠、鳔、鳃、头肾、中肾、心脏、肝胰脏、肌肉、皮肤和脾脏）中的表达模式。【结果】草鱼BPI/LBP cDNA全长1 568 bp,编码473个氨基酸,其中包括18个氨基酸组成的信号肽、BPI1结构域（BPI/LBP/CETP N-terminal domain）和BPI2结构域（BPI/LBP/CETP C-terminal domain）。该蛋白的分子质量为51 551 u,等电点为8.69。氨基酸序列同源性分析结果显示,草鱼与鲤鱼BPI/LBP的同源性最高（90%）,其次为虹鳟（73%）、斑点叉尾鮰（73%）、香鱼（72%）等。在系统进化树中,草鱼BPI/LBP首先与鲤科的鲤鱼聚为一类。通过半定量RT-PCR分析可知,草鱼BPI/LBP基因在被检测的15个组织中都有表达,其中在鳃中的表达量最高,其次为头肾、中肾等。【结论】成功克隆了草鱼BPI/LBP基因的cDNA全长,该基因在草鱼体内不同组织中广泛表达。     

草鱼BPI/LBP基因的克隆及特征研究

【目的】克隆草鱼杀菌通透性增加蛋白/脂多糖结合蛋白(Bactericidal permeability-increasing pro-tein/LPS-binding protein,BPI/LBP)基因的cDNA全长,分析其结构特征,研究其表达规律,为进一步探明其功能奠定基础。【方法】首先用同源克隆及快速扩增cDNA末端技术(RACE),克隆草鱼BPI/LBP基因的cDNA全长,然后用生物信息学方法分析BPI/LBP基因的结构特征,最后用半定量RT-PCR检测BPI/LBP基因在草鱼不同组织(血、脑、眼睛、前肠、中肠、后肠、鳔、鳃、头肾、中肾、心脏、肝胰脏、肌肉、皮肤和脾脏)中的表达模式。【结果】草鱼BPI/LBPcDNA全长1 568 bp,编码473个氨基酸,其中包括18个氨基酸组成的信号肽、BPI1结构域(BPI/LBP/CETP N-ter-minal domain)和BPI2结构域(BPI/LBP/CETP C-terminal domain)。该蛋白的分子质量为51 551 u,等电点为8.69。氨基酸序列同源性分析结果显示,草鱼与鲤鱼BPI/LBP的同源性最高(90%),其次为虹鳟(73%)、斑点叉尾鮰(73%)、香鱼(72%)等。在系统进化树中,草鱼BPI/LBP首先与鲤科的鲤鱼聚为一类。通过半定量RT-PCR分析可知,草鱼BPI/LBP基因在被检测的15个组织中都有表达,其中在鳃中的表达量最高,其次为头肾、中肾等。【结论】成功克隆了草鱼BPI/LBP基因的cDNA全长,该基因在草鱼体内不同组织中广泛表达。     

巴什拜羊重组BPI蛋白的体外功能检测

研究巴什拜羊重组杀菌性/通透性增加蛋白(recombinant bectericidal/permeability increasing protein,rBPI)的体外生物学特性。向体外培养的鼠脑内皮细胞MBECs(mouse brain endothelial cell)中加入rBPI,利用Annexin V FITC/PI染色法在荧光显微镜下鉴定凋亡细胞,再用琼脂糖凝胶电泳观察DNA ladder,以检测rBPI诱导MBECs凋亡的作用;在体外培养的绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)中加入rBPI,利用real-time PCR技术检测rBPI对MO的抑制作用;在体外培养的大肠杆菌中加入rBPI,利用微量肉汤稀释法检测rBPI的抑菌作用;在体外培养的绵羊中性粒细胞中加入MO,利用real-time PCR技术检测BPI mRNA的表达水平。结果表明,Annexin V FITC/PI染色法可观察到凋亡早期细胞呈绿色,凋亡晚期或死亡细胞呈红色,在540nmol/L rBPI浓度诱导作用下可见清晰的DNA ladder条带;rBPI作用于MO3h时,MO16SrRNA表达水平显著低于对照组(P0.05);20、40和80mg/L的rBPI与阳性对照组相比均能够显著抑制大肠杆菌的生长(P0.05);绵羊中性粒细胞受到MO感染后3h和4h时表达BPI mRNA的水平均显著高于对照组(P0.05)。     

黄瓜花叶病毒强毒株外壳蛋白基因克隆和序列分析

在辣椒上分离到一株黄瓜花叶病毒分离物CP310，对其进行14种寄主植物生物学反应测定，发现CP310在心叶烟、克里夫兰烟等植物上表现致死症状，在番茄、烟草表现为植株明显矮化。根据已报道的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因序列合成引物，采用常规RT-PCR方法对其外壳蛋白基因进行扩增并克隆，序列分析结果显示：该分离物外壳蛋白基因全长657个核苷酸，编码218个氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列与所比较的CMV亚组I的分离物有很高的同源性，分别为91．0％～94．7％和96．0％～98．2％．与CMV亚组Ⅱ的同源性分别仅为76．6％～78．0％和76．0％～78．9％。     

hNIS和hTPO-1基因的同时克隆及测序

目的同时克隆人钠/碘同转运体(hNIS)和甲状腺过氧化物酶(hTPO-1)基因,为下一步共同转染肿瘤细胞介导放射性碘的摄取与有机化,延长放射性碘的停留时间,为治疗未分化甲状腺癌和非甲状腺癌提供更为有效的方法。方法运用反转录聚合酶链反应(RT-PCR),从人甲状腺组织总RNA中,同时全长扩增出hNIS和hTPO-1基因cDNA序列,并将它们分别克隆到pUCm-T载体上。结果与结论hNIS和hTPO-1基因cDNA,可同时成功克隆和测序。     

NtGNL2基因克隆及蛋白结构分析

ARF-GEFs家族基因是近年来极性生长研究的热点。该家族有多个亚家族,而在植物中以GBF亚家族为典型代表。NtGNL2(Nicotiana tabacum GNOM-Like2)是通过同源克隆,并结合3'Race技术在烟草中克隆获得的GBF家族成员,在植物上报道的GBF家族成员并不多,然而,该亚家族成员的蛋白序列及功能都高度保守。为了验证新获得的Nt GNL2基因的保守性,通过同源比对和系统发生关系分析了NtGNL2与其他多个植物GBF家族成员的亲缘关系;同时对NtGNL2基因各个保守结构域进行了蛋白序列的分析。结果表明,NtGNL2与其他植物GBF成员高度保守。     

鸡大肠杆菌1型菌毛fimH蛋白结构基因克隆及序列测定

根据已发表的大肠杆菌1型菌毛fimH基因序列,以产1型菌毛菌株MG2(O11)、YR5(O78)、MG12(O18)基因组DNA为模板,对大肠杆菌1型菌毛fimH基因进行扩增并与国外同源菌株基因序列进行比对。结果表明:核酸同源性分别为97.8%、99.7%、97.8%,氨基酸序列的相似性分别达到98.7%、99.3%、98.0%。运用DNA-STAR软件对fimH蛋白抗原决定簇进行预测分析,发现它们的抗原决定簇基本相似,这说明fimH基因序列及氨基酸序列的变异并未对fimH蛋白的抗原结构产生明显影响。     

鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的克隆及序列测定

根据IBV病毒的已报道基因序列设计了用于扩增鸡传染性支气管炎病毒M41株S1基因和T株核衣壳蛋白基因(N)的引物。经RT-PCR得到了预期大小的扩增产物；将目的条带纯化并回收以后，克隆到pMD18-T质粒载体中，对插入片段进行序列测定。并与已发表的IBV S1、N基因序列进行了比较和分析，表明具有高度同源性。证明我们克隆了IBV S1和N结构蛋白基因。     

三黄鸡STING胞外区基因克隆及原核表达

[目的]克隆鸡干扰素基因刺激蛋白(STING)胞外区基因并进行原核表达,为了解STING蛋白的生物学功能及探讨禽类的固有免疫机制打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增鸡STING胞外区基因,与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组表达质粒,再转化BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行12% SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析.[结果]三黄鸡STING胞外区基因全长951 bp,与原核表达载体pGEX-4T-1可成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-STING,转化BL21 (DE3)感受态细胞后经1.0 mmol/L IPTG诱导表达4h,12% SDS-PAGE电泳检测得到一个带GST标签约62 ku的融合蛋白,采用抗GST多克隆抗体进行Western blotting鉴定,约在62 ku处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明目的蛋白原核表达正确,且特异性较高.[结论]从三黄鸡外周血淋巴细胞中克隆获得的STING胞外区基因片段可在原核细胞中高效表达,且纯化后的融合蛋白可用于制备鸡STING多克隆抗体.     

新疆巴什拜羊BPI基因cDNA全长的克隆及序列分析

【目的】克隆巴什拜羊杀菌/通透性增强蛋白(BPI)的cDNA序列,为研究该蛋白的结构和功能奠定基础。【方法】采集巴什拜羊外周血液,从中分离得到中性粒细胞后提取RNA。根据GenBank中牛BPI基因的cDNA序列设计兼并引物,用RT-PCR方法扩增巴什拜羊BPI基因部分序列,再根据已知的巴什拜羊BPI基因部分序列设计RACE引物,分别扩增出5′和3′端目的片段,分别回收克隆的目的基因片段,再与pMD18-T载体连接,分别转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后进行拼接,获得巴什拜羊BPI基因全长cDNA序列,并对序列进行分析。【结果】克隆的巴什拜羊BPI基因cDNA序列全长1 922bp,其中开放阅读框为1 452bp,共编码483个氨基酸;BLAST分析表明,巴什拜羊BPI基因的核苷酸序列与绵羊、牛、虎鲸、野猪、猕猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾核苷酸的一致性分别为99%,91%,78%,74%,64%,61%,58%,53%和50%;氨基酸进化分析显示,巴什拜羊首先与绵羊聚为一类,其次与牛聚为一类,该聚类分析结果与生物学分类结果表现一致。【结论】通过RACE方法成功地克隆了1 922bp的巴什拜羊BPI基因cDNA全长序列,且基因进化树聚类结果与生物学分类结果相一致。     

三化螟蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的克隆和序列分析

利用RACE技术,根据已有的三化螟转录组数据,设计特异引物对三化螟的蜕皮激素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)基因进行克隆,获得了三化螟EcR和USP基因的全长序列。EcR基因全长2857bp,氨基酸序列包括545个氨基酸。USP基因全长共2082bp,氨基酸序列包括408个氨基酸。序列比对后发现,三化螟EcR和USP基因的氨基酸序列与已报道的鳞翅目昆虫EcR和USP基因的氨基酸序列具有很高的同源性,其中与二化螟的相似性分别达到94%和97%。序列分析表明,三化螟EcR和USP序列具有昆虫EcR和USP基因的特征结构:DNA结合域和2个锌指结构。     

弓形虫自然弱毒株棒状蛋白2基因克隆及序列分析

应用PCR法从弓形虫QHO株速殖子基因组DNA中扩增ROP2的基因片断,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经酶切及PCR鉴定后进行测序,并进行序列分析.结果表明,自然弱毒株的开放阅读框架(ORF)与ROP2基因已知序列(Z36906)的ORF具有97%的同源性,氨基酸序列具有95%的同源性.     

大黄鱼热激蛋白cDNA克隆及系统发育分析

根据已报道的HSP基因序列（EMB登录号：AF506290）,设计出特异引物,PCR扩增后测序,获得1．7kh大小的大黄鱼热激蛋白cDNA基因序列。HSP氨基酸序列的系统进化分析表明：不同物种编码的HSP存在一些明显相关的群体,高等动物编码的HSP在进化上紧密相关,形成一个显著群体,大黄鱼编码的HSP蛋白位于高等动物群体中,这与大黄鱼的亲缘关系大致吻合,其中与非洲爪蟾的同源性最高（92．3％）,也间接印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。通过大黄鱼HSP基因的提取和分析,可为以后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因、构建基因文库等研究工作奠定基础,同时对大黄鱼的品质改良和良种的选育有重要意义。     

大黄鱼热激蛋白cDNA克隆及系统发育分析

根据已报道的HSP基因序列（EMB登录号：AF506290），设计出特异引物，PCR扩增后测序，获得1．7kh大小的大黄鱼热激蛋白cDNA基因序列。HSP氨基酸序列的系统进化分析表明：不同物种编码的HSP存在一些明显相关的群体，高等动物编码的HSP在进化上紧密相关，形成一个显著群体，大黄鱼编码的HSP蛋白位于高等动物群体中，这与大黄鱼的亲缘关系大致吻合，其中与非洲爪蟾的同源性最高（92．3％），也间接印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。通过大黄鱼HSP基因的提取和分析，可为以后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因、构建基因文库等研究工作奠定基础，同时对大黄鱼的品质改良和良种的选育有重要意义。     

针对人蛋白激酶CK2α亚基的shRNA表达质粒的构建与鉴定

目的:构建针对人蛋白激酶CK 2α亚基的shRNA表达质粒。方法:以mU 6pro为载体,化学合成shRNA表达模板,并定向克隆到载体的U 6启动子下游,琼脂糖凝胶电泳法筛选阳性克隆,基因测序法检测插入模板序列的正确性。结果:获得了正确的重组质粒,插入的转录模板序列完全正确。结论:成功构建了针对人蛋白激酶CK 2α亚基的RNA i体系。     

大豆铁结合蛋白基因的克隆及其推定蛋白结构分析

根据GeneBank数据库中大豆类铁结合蛋白序列设计引物,通过反转录方法从豫豆8号中克隆到cDNA片段,测序结果表明,该基因cDNA全长752 bp,编码250氨基酸.利用DNAMAN软件进行序列比对分析发现,该cDNA的氨基酸序列与大豆(M64337.1)铁结合蛋白同源性高达98%以上.运用生物信息学软件及相关网站对其功能位点、结构功能域分析,结果显示,该基因具有1个FER-RITIN-LIKE功能域、2个铁结合蛋白基因家族铁结合区域的信号序列、6个磷酸化位点等重要功能位点.     

中国实验小型猪朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已发表的猪朊蛋白基因（PRNP）序列设计特异性引物，进行PCR直接扩增，得到了中国实验小型猪（CEMP）的朊蛋白基因（PRNP），将其克隆到pGEM-TEasy载体中。序列分析表明上述CEMP的PRNP基因ORF区全长为774bp，编码257个氨基酸的前体蛋白，分子质量约为28．3ku，其PRNP序列与已发表的猪PRNP序列（L07623）差异微小，仅在第4位氨基酸残基处有变异（Ser→Asn）；绘制CEMP与其他15种属动物朊蛋白的氨基酸序列进化树发现，CEMP与多种哺乳动物朊蛋白的氨基酸序列遗传距离比较接近，与水貂最近。而与禽类朊蛋白氨基酸的遗传距离较远。