虾夷马粪海胆筏式人工养殖研究

报道了由日本北海道引种的虾夷马粪海胆大连海区进行筏式人工养殖的试验情况，结果表明：（１）采用扇贝笼、鲍鱼笼放塑料筐在大连近海水域进行筏式效果良好，虾夷马粪海胆在该海区可正常生长、并达性成熟；（２）饵料以海带，裙带菜等为主，间或投喂马尾藻、石莼等；（３）海区水温在－１．０－２５．２℃范围内，该海胆均可正常生活；（４）在大连海胆的生长速度比原分布区快一倍左右；（５）养殖１．５－２．０年壳径可达５．０di     

虾夷马粪海胆TLR基因cDNA克隆及表达分析

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增（ RACE）技术克隆获得一条虾夷马粪海胆Strongylocentrotus in-termedius TLR基因的全长cDNA序列SiTLR-1（GenBank： HQ259110）,并采用实时定量PCR技术分析了其在组织中的分布以及在致病弧菌Vibrio fortis、β-D葡聚糖和dsRNA刺激后的表达情况。结果表明： SiTLR-1全长序列为3637 bp,形成16个α螺旋、33个β折叠; SiTLR-1蛋白有两个跨膜区段,在725-750位有跨膜区,发现1个信号肽（1-32aa）、1个亮氨酸重复富集区（LRR）; SiTLR-1在检测的各组织中均有表达,在体腔液中表达量显著高于围口膜、管足和齿间肌（ P〈0.05）;经V. fortis、β-D-葡聚糖刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达量显著上升,刺激后12 h达到最高值;经dsRNA刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达变化较小,仅在3 h 时略有升高。研究表明, TLR 基因参与虾夷马粪海胆的免疫应答,克隆获得的SiTLR-1可特异性识别细菌和β-D-葡聚糖。     

虾夷马粪海胆反季节繁育技术的研究

对虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius的反季节繁育技术以及繁育过程中亲胆的生殖调控、夏季高温对策等进行了研究.结果表明:当积温达到880℃·d时,亲胆性腺部分成熟;当积温达到1 950℃·d时,亲胆性腺成熟并可自然排放精、卵.利用反季节繁育技术可以使海胆繁殖期提早5个月,且受精卵孵化率≥98%,幼虫平均附着变态率为15.1%.对海水采用多次过滤加药物处理的新方法防除桡足类,效率可提高35%,采用海藻诱导法剥离稚胆,成活率可提高14%.     

虾夷马粪海胆CYP17基因的克隆及其表达差异

采用分子生物学方法成功克隆了虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius CYP17基因。该基因的cDNA全长为1 570 bp,其中开放阅读框1 482 bp,编码493个氨基酸;CYP17蛋白的相对分子质量约为55 540,等电点为8.068,信号肽断裂位点位于第18和第19个氨基酸残基之间;虾夷马粪海胆的CYP17氨基酸序列与紫球海胆S.purpuratus的同源性为97%,与光棘球海胆S.nudus的同源性为96%。用RT-PCR技术对CYP17基因在虾夷马粪海胆生殖腺不同发育时期的表达差异进行了分析。结果表明:在虾夷马粪海胆3个家系的雄性个体生殖腺中,CYP17基因在1-3家系的表达量最高,依次为10-3家系、6-2家系,而在雌性个体生殖腺中,CYP17基因在10-3家系的表达量最高,依次为1-3家系、6-2家系;在4-1家系海胆3个不同发育时期,CYP17基因在雄海胆性腺中的表达量随着日龄的增加而增加,而雌海胆性腺在发育第430天到第447天时表达量略有增加,发育到第512天时表达量明显增加。本研究表明,CYP17基因在海胆雌、雄个体生殖腺中转录水平上的表达差异明显,雄性的表达量明显高于雌性。     

虾夷马粪海胆NLR家族基因片段的克隆及表达特征分析

采用同源克隆和半定量RT-PCR方法,对虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius NLR家族基因片段进行了克隆和组织表达特征分析。将紫球海胆S. purpuratus的9组NLR家族聚类的编码区序列进行比对后,根据保守区域设计引物扩增虾夷马粪海胆中相应的基因,通过测序获得了9组不同NLR聚类基因片段,每组各10个测序结果,通过基因序列及氨基酸序列比对分析,发现存在长度及序列结果上的差异,这说明每组NLR家族聚类都存在多个家族成员。同时选取虾夷马粪海胆的不同组织提取RNA,反转录后使用同样的引物进行半定量RT-PCR分析,结果表明, NLR基因在虾夷马粪海胆的管足、肠、围口膜、体腔细胞、性腺中存在高效表达,且在围口膜及性腺中表达量最高,表明NLR基因在虾夷马粪海胆中普遍表达,并存在表达差异。研究表明, NLR基因在海胆免疫过程中起着重要作用。     

虾夷马粪海胆CYP51基因cDNA的克隆及其SNPs分析

采用RT-PCR、PCR-SSCP等分子生物学技术和关联分析等方法对虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius CYP51基因的cDNA序列进行了克隆和单核苷酸多态性分析.结果表明:虾夷马粪海胆的CYP51基因包括一个1491 bp的开放阅读框,编码496个氨基酸;其开放阅读框的第161个核苷酸处存在1个单核苷酸多态性,即核苷酸发生了A→G突变.关联分析结果表明,该单核苷酸多态性与虾夷马粪海胆的体质量、性腺质量之间存在显著相关性(P＜0.05).本研究中首次克隆了虾夷马粪海胆CYP51基因的cDNA序列并进行了SNPs分析,研究结果可为虾夷马粪海胆的分子标记辅助育种提供参考.     

虾夷马粪海胆溶菌酶基因SNP标记的开发及多态性分析

采用高分辨率熔解曲线分析技术（HRM）对虾夷马粪海胆溶菌酶基因进行突变扫描,筛选出26个SNP候选位点。其中,碱基置换类型位点16个,占位点总数的61.54%;碱基插入或缺失的位点6个,缺失的碱基数为1~4个不等,占位点总数的23.08%;碱基置换类型模糊以及三态位点4个,占位点总数的1538%。SNP在虾夷马粪海胆溶菌酶基因的cDNA中的分布频率约为2.85%,位于编码区的位点有18个,其中2个为错义突变。应用小扩增子基因分型法对5个SNP位点在2个不同地域群体的60个样本中进行分型分析,结果显示：5个SNP位点均含有2个等位基因,次等位基因频率分布范围为0.150 0~0.500 0,位点SILyz-7、SILyz-15和SILyz-20在两个群体间的次等位基因频率相差较大。研究结果表明,HRM是一种高效便捷的SNP分析方法,所筛选出的SNP标记可用于虾夷马粪海胆遗传育种的研究。     

虾夷马粪海胆及其铒料中无机元素和蛋白质的初步研究

报道了对虾夷马粪海胆（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）生殖腺、壳及铒料中无机元素（Ｃａ,Ｍｇ,Ｆｅ,Ｚｎ,Ｍｎ,Ｃｕ）和蛋白质含量的测定结果。结果表明：生殖腺中常量元素镁的质量分数高于钙,微量元素质量分数依次为ｗ（Ｚｎ）〉ｗ（Ｆｅ）〉ｗ（Ｃｕ）〉ｗ（Ｍｎ）;壳中钙的质量分数约为镁的２０倍,微量元素的质量分数依此为ｗ（Ｆｅ）〉ｗ（Ｚｎ）〉ｗ（Ｍｎ）〉ｗ（Ｃｕ）生殖腺和壳     

虾夷马粪海胆不同肠道中菌群组成及其PCR-DGGE图谱分析

利用细菌16S rDNA PCR-DGGE指纹图谱技术,对虾夷马粪海胆不同肠道的微生物菌群组成进行分析,结果表明:海胆小肠与大肠样品分别得到14条与13条条带,其中,共有条带为10条,优势条带分别为7条与5条,特异性条带分别为4条与3条;经后续条带比较分析和DGGE图谱割胶测序后发现,小肠与大肠样品中微生物主要来源于外界海水环境,其菌群构成存在差异与虾夷马粪海胆消化巨藻存在不同有关。     

虾夷马粪海胆及其饵料中无机元素和蛋白质的初步研究

报道了对虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius )生殖腺、壳及饵料中无机元素(Ca,Mg,Fe,Zn,Mn,Cu)和蛋白质含量的测定结果.结果表明:生殖腺中常量元素镁的质量分数高于钙,微量元素质量分数依次为w(Zn)>w(Fe)>w(Cu)>w(Mn);壳中钙的质量分数约为镁的20倍,微量元素的质量分数依此为w(Fe)>w(Zn)>w(Mn)>w(Cu).生殖腺和壳中无机元素的质量分数与饵料中相应元素的质量分数之间无明显相关性.此外,发现配合饵料在促进生殖腺发育方面明显优于海带,海带则在促进壳生长方面优于配合饵料.     

中间球海胆性别性状的微卫星分析

针对中间球海胆Strongylocentrotus interm edius育苗生产中很难进行活体性别鉴定这一特点,采用组织切片法和微卫星标记分析法对海胆进行观察分析。试验用样品由大连太平洋海珍品有限公司提供,共31只。采用组织切片法鉴别雌、雄个体,发现17只个体为雌性,14只个体为雄性。同时,将31只个体分为雌、雄两个群体,提取性腺组织基因组DNA,利用已经筛选好的11对引物对雌、雄两个群体进行微卫星分析。结果表明,两个群体的遗传多样性没有显著差异;发现INST09-A,INST10-A,INST10-B三个等位基因的频率在两个群体间存在极显著差异(P<0.01),位点INST10在雌、雄两个群体中的基因型频率存在极显著差异(P<0.01)。初步说明这些位点及相应等位基因可能与性别决定位点存在一定的连锁关系。     

镉对中间球海胆精子发生的影响

研究了不同浓度镉离子(0.005、0.1、0.5、1.0 mg/L)对中间球海胆Strongylocentrotus interm edius精子发生的影响。结果显示:在光镜下观察,染毒第6、18 d后,各浓度组中间球海胆滤泡结构完好,生殖细胞发育情况同对照组基本一样;染毒第42 d后,0.5、1.0 mg/L Cd2 浓度组生精细胞排列混乱,滤泡膜破损;染毒第54 d后,各浓度组海胆性腺均出现滤泡解体现象。对染Cd2 54 d的0.5、1.0 mg/L组海胆精巢进行超薄切片观察,可见各级生精细胞亚显微结构变化明显,主要表现为核染色质异常凝集,核膜结构损伤,线粒体空泡化,精子形态畸形等。说明镉能影响中间球海胆的精子发生,导致精子质量下降。     

中间球海胆精子超低温冷冻损伤的研究

应用透射电镜技术研究了超低温冷冻保存对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子超微结构的影响。结果表明：不加抗冻剂的情况下,精子线粒体和顶体结构不完整,质膜、鞭毛破损。加入保护剂后,多数精子结构完好,部分精子细胞器受损,表现为质膜褶皱或膨胀举起,与核膜的间隙明显增大;顶体肿胀、破裂或脱落;线粒体嵴间隙增大,内部出现空泡,甚至线粒体内膜破损,内嵴减少,呈弥散状;鞭毛被膜肿胀,呈波浪状,＂9＋2＂型结构模糊;细胞核结构没有明显变化。应用单细胞凝胶电泳技术研究了精子冷冻保存前后DNA的损伤。结果表明,不加抗冻剂的冷冻组及添加抗冻剂的试验组精子DNA损伤情况与鲜精相比均无显著差异（P〉0.05）,冷冻对精子结构的损伤是造成精子活力及受精率下降的主要原因。     

黑嘴病病原菌人工感染对中间球海胆吞噬作用相关免疫指标的影响

为探讨黑嘴病病原菌感染对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius吞噬作用相关免疫指标的影响,选用壳径约2 cm的中间球海胆108只,用注射器针头刺入海胆体腔,再用浓度102 CFU/mL的黑嘴病病原菌液浸泡,经病原菌胁迫后0、1、6、12、24、48 h时测定各体腔细胞密度、细胞凋亡率、细...     

中间球海胆精子超低温冷冻保存方法的研究

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子的超低温保存技术进行了研究。以煮沸消毒海水为基础液,添加体积分数为10%的DMSO、体积分数为6%的甘油以及25 mmol/L海藻糖配制成冷冻保护液,与鲜精液按体积比以1∶1混合,在4℃下平衡15 min,于液氮面上方15、3 cm处分别停留3 min和5 min,然后浸入液氮保存。结果表明：用此方法保存的精子解冻后其存活率可达58.2%,受精率达24.7%;解冻后精子受精时,在受精海水中分别添加0、28、56、112、280 mmol/L的葡萄糖,56 mmol/L组的受精率高于其他组,受精率达26%;精子解冻后受精时,在受精海水中添加适量葡萄糖有助于提高受精率。本试验表明,冷冻过程中降温方式、冷冻保护液、平衡时间对精子的冷冻保存效果均有较大影响,各个因素通过优化组合可以大大提高解冻后精子的存活率和受精率。     

中间球海胆雌核发育单倍体胚胎的初步研究

采用不同剂量(30～330mJ／cm^2)的紫外线对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子进行照射失活,获得了雌核发育的单倍体胚胎。测定了照射组与对照组的受精率、单倍体诱导率、2～4细胞期的畸形率和破膜囊胚成活率,探明了精子灭活的紫外线适宜剂量为270mJ／cm^2;并进行了早期胚胎地衣红压片观察和早期囊胚染色体数分析,观察到照射组早期胚胎的精核具有DCB小体,对照组早期囊胚的染色体数为2n=42,照射组雌核发育单倍体胚胎的染色体数为n=21。     

近交对中间球海胆受精率、孵化率和幼体发育的影响

通过构建不同近交水平的海胆群组,即半同胞近交组(H组,F=0.125)、全同胞近交组(F组,F=0.25)和对照组(C组,F=0),研究了近交对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius受精、孵化和幼体发育阶段的影响。结果表明:近交对海胆的受精率、孵化率和四腕幼体的畸形率均无显著影响(P>0.05);不同近交水平的四腕、六腕和八腕幼体体长均表现为H组>C组>F组,体宽表现为无规律性;六腕幼体的胃长和胃宽均为F组>C组>H组,八腕幼体的胃长和胃宽均为C组>H组>F组。研究表明,一定近交水平(F=0.25)的中间球海胆的受精、孵化,以及变态前幼体的体长、体宽均没有出现明显的近交衰退,但幼体胃长和胃宽的近交衰退现象比较明显。