菲律宾蛤仔凝集素的分离纯化及抑菌活性研究

采用Cellulose DE52离子交换层析、Sephadex G- 100分子筛层析及TSK G3000PWXL凝胶色谱柱HPLC从菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum中分离纯化出具有N-乙酰半乳糖酰胺(N- acetyl- D- galactosamine,GaINAc)和猪胃黏蛋白(Mucin from porcine stomach,PSM)特异性的菲律宾蛤仔凝集素(简称为MCL-T).SDS-PAGE分析结果表明,MCL-T的相对分子量为148000,含有62000和36000的亚基.抑菌试验结果表明,MCL-T对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis有较高的抑菌活性.对MCL-T中Trp残基、-S-S-、-SH以及Tyr残基进行化学修饰后,MCL-T对金黄色葡萄球菌的抑菌活性丧失;对其-S-S-进行化学修饰后,MCL-T对枯草芽孢杆菌的抑菌活性影响不大,而对其-SH、Trp残基和Tyr残基进行化学修饰后,MCL-T对枯草芽孢杆菌的抑菌活性丧失.研究表明,MCL-T 肽链上的氨基酸残基状态与其抑菌活性有关.     

非洲山毛豆种子凝集素性质的研究

以非洲山毛豆种子为材料,通过热稳定性试验、酸碱稳定性试验、糖专一性试验及金属离子试验对其凝集素的性质进行研究。结果表明:当温度大于70℃,凝集素活性全部丧失;凝集素在pH5.8~9.1范围内具有凝集活性;凝集素的抑制糖主要是乳糖、蔗糖,而D-半乳糖、海藻糖和麦芽糖对其完全没有抑制效果;山毛豆种子凝集素凝集兔红细胞的活性依赖于Ca2+和Mg2+,Mn2+对山毛豆种子凝集素凝集兔红细胞的活性无影响。     

烟夜蛾幼虫血淋巴凝集素的理化特性研究

为了明确烟夜蛾Helicoverpa assulta幼虫血淋巴凝集素的理化性质,采用糖抑制试验和血凝法检测,分别测定了凝集素与不同糖类的结合特性和不同因素对其凝集活性的影响.糖抑制试验结果表明,在选用13种糖类中,不同糖类对凝集素凝集活性的抑制作用不同,其中乳糖、D-半乳糖和L-鼠李糖具有完全抑制作用,说明烟夜蛾幼虫血淋巴凝集素与这3种糖类有专一结合特性.血凝法检测结果表明,不同因素对凝集活性的影响不同,其中烟夜蛾血淋巴凝集素凝集活性依赖于Ca2+,属C型凝集素;反复冻融对凝集素的活性没有影响;但随处理温度的升高或持续时间的延长,其凝集活性下降,在60℃处理15 min后凝集活性完全丧失;凝集素在p H 7.17时活性最高;凝集素对经胰蛋白酶修饰后的鸭血红细胞的凝集活性明显增强;血淋巴中酚氧化酶引起的黑化未对其凝集活性产生影响,说明同为体液免疫因子的凝集素与酶氧化酶在昆虫免疫防御中的协同性.     

一种可降解黄原胶的鞘氨醇单胞菌的凝集活性

采用血凝测试及血凝活性糖抑制测试方法,测定了一种可降解黄原胶的鞘氨醇单胞菌XT-11Sphingom onassp.对红细胞的凝集活性及糖抑制专一性,同时进行了温度、pH及Ca2 对红细胞凝集活性影响的试验。结果表明:XT-11菌悬液能凝集家兔、家鸡两种红细胞,其凝集效价分别为26和24;菌悬液对兔红细胞的凝集作用可以被肝素所抑制;鞘氨醇单胞菌的凝集活性不依赖于Ca2 ,且在pH为6.0~10.0时较稳定,在温度为60℃时完全丧失凝集活性。这说明该菌含有能凝集红细胞的活性物质。     

刀豆凝集素的血凝活性及其性质研究

[目的]为进一步研究刀豆凝集素提供依据。[方法]从豆科植物刀豆属(Canavalia)中Canavalia ensiformis(L.)DC的干燥成熟种子中提取刀豆凝集素(Concanavalin A,简称ConA),进行血凝活性测定,并对其部分性质作了初步研究。[结果]结果表明:采用胰蛋白酶修饰人血(A型)红细胞来检测ConA凝集活性时,发现其活性提高了8倍。ConA对人A、B、O、AB型及供血动物(兔,鸡,鸭,鸽,鲤、鲫鱼)的血红细胞都具有一定程度的凝集活性,无供体细胞专一性或血型专一性;D-葡萄糖和D-甘露糖是ConA的专一性结合糖。ConA是一种对热较稳定的凝集素,40℃以下时ConA很稳定,80℃以上保温20 min后,血凝活性完全丧失。在pH值范围5.8~8.3,ConA的凝集活性较高,在pH>11.9时,凝集活性完全丧失。变性剂脲浓度达到0.4 mol/L以上时,ConA的凝集活性可完全丧失。[结论]该研究对今后系统阐明其生物学作用,扩大应用范围具有重要意义。     

薄荷蔗糖酶的化学修饰

采用NBS、 PMSF、 IAc、 BrAc、 SUAN、 TNBS、 PCMB、 DTT以及金属离子和相关试剂在一定条件下选择性修饰蔗糖酶. 结果表明 0.5 mmol/L的PMSF使酶活性丧失95%, 10 μmol/L的NBS使酶活性丧失93%, 0.5 mmol/L的PCMB使酶活性降至12%, 酶修饰呈一级反应, 推测Trp、 Ser的残基可能是薄荷叶片蔗糖酶的活性必需基团, 而His、 Lys的残基不在薄荷蔗糖酶的活性中心.     

小麦巯基蛋白酶抑制剂的分子修饰与其生理活性研究

 用N-溴代丁烯二酰亚胺修饰小麦巯基蛋白酶抑制剂（CPI），计算出CPI分子内有一个色氨酸残基被修饰，修饰的CPI对木瓜蛋白酶的抑制活性全部丧失，表明色氨酸对CPI的活性非常重要，是分子保持抑制活性所必需的；用N-乙基顺丁烯二酰亚胺修饰CPI分子的巯基，计算出CPI分子中含有17个巯基，这些巯基被修饰后，CPI仍保持100%的抑制活性；用二硫苏糖醇和碘乙酸处理小麦CPI分子内的巯基后，其抑制活性无变化，表明CPI的抑制活性不需巯基参与。用小麦CPI对赤霉病菌的生长进行抑制实验，结果表明，小麦CPI对赤霉病菌的生长有强抑制作用，当CPI的用量为40μg时（即0.308nmol/L）,就可对赤霉菌发生抑制作用。     

嗜热真菌耐热木聚糖酶的活性中心

应用NBS ,WRK ,DTNB ,PMSF ,Phenylgloxalhydrate,DEPC等化学修饰剂对嗜热真菌所产的耐热木聚糖酶进行了化学修饰。分别作用于色氨酸残基和谷氨酸 (或天冬氨酸 )残基的NBS和WRK可使耐热木聚糖酶活性显著降低 ,而其他几种修饰剂无明显作用。木聚糖对NBS的修饰有抑制作用 ,3 0mg·mL-1的桦木木聚糖底物可完全阻止NBS对耐热木聚糖酶的修饰作用 ,但木聚糖底物不能阻止WRK对耐热木聚糖酶的失活作用。实验结果表明 ,色氨酸残基和谷氨酸 (或天冬氨酸 )残基位于酶的活性中心 ,且色氨酸残基位于酶的底物结合中心 ,而谷氨酸(或天冬氨酸 )残基可能位于酶的催化中心。     

罗非鱼碱性磷酸酶的化学修饰

采用PMSF、PCMB、NBS、TNBS、SUAN、DTT、IAc、BrAc等化学修饰剂在一定的条件下选择性修饰罗非鱼ALP,研究罗非鱼ALP分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系.结果表明:PMSF、NBS等两种化学修饰剂能显著抑制酶的活力,而PCMB、TNBS、SUAN、DTT、IAc、BrAc等对酶的活力影响不大.说明对丝氨酸残基、色氨酸残基的化学修饰后对酶的活力影响很大,而酶分子中的其他功能基团不在酶的活性中心,修饰后对酶的活力影响不大.     

薄荷蔗糖酶的化学修饰

采用NBS、PMSF、IAc、BrAc、SUAN、TNBS、PCMB、DTT以及金属离子和相关试剂在一定条件下选择性修饰蔗糖酶．结果表明：0．5mmol／L的PMSF使酶活性丧失95％,10／μmol／L的NBS使酶活性丧失93％0．5mmol／LNPCMB使酶活性降至12％,酶修饰呈一级反应,推测Trp、Ser的残基可能是薄荷叶片蔗糖酶的活啦必需基团,而His、Lys的残基不在薄荷蔗糖酶的活性中心．     

理化因素对白芸豆凝集素生物学活性影响

[目的]研究物理与化学因子对白芸豆凝集素生物学活性的影响,为白芸豆凝集素开发利用奠定理论基础和提供技术参考.[方法]白芸豆（Phaseolus vulgarisL）种子经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换和Sephadex G-100凝胶柱层析得到凝集素（PVL）;然后以不同温度和pH梯度、不同金属离子、不同变性剂处理样品,通过倍比稀释法测定凝集素的生物学活性.[结果]白芸豆凝集素能使兔血红细胞发生凝集,在20～70℃红细胞凝集活性不受影响,当温度达到80℃时凝集素样品仅有25％凝血活性,85℃加热30 min凝血活性全部消失.用EDTA溶液处理后,白芸豆凝集素失去凝血活性,金属离子Mg2＋和K＋能恢复凝血活性,Mn2＋能完全恢复凝血活性,Ba2＋、Cu2＋、Fe3＋、Ca2＋不能使凝血活性恢复.白芸豆凝集素在缓冲液pH低于4.0时凝血活性逐步降低,在pH 3.0时,活性仅有45％;在缓冲液pH高于7.2时活性逐步降低,pH 9.0时凝血活性仅有44％.3种变性剂变性试验中,脲能使凝集素凝血活性降低70％,盐酸胍能降低30％,SDS能降低18％.[结论]白芸豆凝集素具很强的热稳定性和广谱酸碱度适应能力;凝血活性依赖Mn2＋等金属离子,且仅能被变性剂6 mol/L脲部分抑制.在实际应用中,可根据适宜条件控制其物理和化学因素,防止凝集素变性失活.     

条斑紫菜凝集素的提取及其性质研究(摘要)(英文)

[目的]研究条斑紫菜(Porphyra yezoensis)凝集素的提取及分离纯化条件,并测定凝集素的性质。[方法]以比活力为指标,研究了缓冲体系、固液比、温度及时间等条件对条斑紫菜凝集素提取效果的影响。采用DEAE-Sepharose FF离子交换层析技术进行分离,确定了分离的最佳条件。以血凝集活性为指标,测定了凝集素的糖专一性、二价阳离子依赖性、温度及酸碱稳定性等性质。[结果]固液比为1∶5的Tris-HCl(25mmol/L,pH值7.5)缓冲液在40℃条件下提取20h得到的提取液具有最高的比活力。条斑紫菜凝集素在50℃条件下加热30min后活性保持不变,表现出一定的热稳定性,最适作用pH值为7～9。该凝集素能够与麦芽糖、半乳糖、阿拉伯糖及木糖结合,其中与麦芽糖的结合最强,凝集活性依赖Ca2+、Mg2+等二价阳离子。[结论]该研究为阐明条斑紫菜的免疫机制及其高效综合利用提供了理论依据。     

Hemagglutinating Activity of Duck Tembusu Virus

【Objective】 The objective of this paper was to study the hemagglutinating activity of duck Tembusu virus (DTMUV). 【Method】The DTMUV was inoculated intracerebrally in the 1-3-day-old sucking mice of BALB/c in different dilution to observe the morbidity. The brains of sucking mice were collected and purified according to the referenced methods. The purified virus fluid was inactivated by suitable inactivator, followed by the inactivated inspection in 6-day-old SPF chicken embryo. The virus fluid was evaluated the hemagglutinating activity with the erythrocyte suspension of chicken, duck, goose, pigeon and swine. The concentration of the erythrocyte suspension used in the hemagglutination test was compared to select the proper concentration. The pH value of the reaction system between 6.0-7.0 and the reaction temperature including 4℃, room temperature and 37℃ were compared. 【Result】 In the 6 day after inoculation , the sucking mice inoculated with 1:10 dilution appeared severe clinical symptoms including twitch, paralysis, and most of them were in agonal stage, while the symptoms of the sucking mice inoculated with 1:50 and 1:100 dilution were slighter. The purified DTMUV fluid was pinkey and clarified. It could be inactivated by formaldehyde but not β-propiolactone that would produce lots of flocks and change the property of the fluid. The DTMUV could hemagglutinate with the erythrocyte suspension of chicken, duck, goose, pigeon and swine, and the agglutination graphics was clear and stable when the concentration of the erythrocyte suspension was 0.33%. The hemagglutinating activity of DTMUV could be showed when the reaction system pH value was 6.0-6.8, while the highest hemagglutination titer appeared during the pH 6.0-6.2. Furthermore, the hemagglutinating activity could be appeared at 4℃, room temperature and 37℃, respectively, although the time required for hemagglutination at 4℃ was much longer. 【Conclusion】The DTMUV proliferated in the sucking mice of BALB/c had a broad spectrum of hemagglutinating activity that could hemagglutinate with the erythrocyte suspension of chicken, duck, goose, pigeon and swine. The hemagglutinating activity was stable and could hemagglutinate with the goose erythrocyte at 4℃, room temperature and 37℃. The suitable reaction conditions were 0.33% concentration of the erythrocyte suspension and pH 6.0-6.2 of the reaction system.     

百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存体系建立及遗传稳定性分析

采用单因素随机区组试验及多因素、多水平正交试验方案建立了百子莲胚性愈伤组织(embryogenic callus,ECs)玻璃化法超低温保存体系。将由花梗诱导的胚性愈伤组织接种至预培养基(MS+0.5mol/L蔗糖+1%琼脂)上,在4℃下预培养2d后,在室温下加入装载液(MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L丙三醇+10mmol/L KNO3)处理60min;利用改良后的PVS 2玻璃化溶液(MS+0.4mol/L蔗糖+30%丙三醇+15%乙二醇+15%DMSO)在0℃下处理40min,将含有ECs的冻存管投入液氮中冻存1h;在40℃水浴中快速解冻90s;用洗涤液(MS+1.2mol/L蔗糖+10mmol/L KNO3)处理30min,每10min换1次新鲜的洗涤液;洗涤后,接种到胚性愈伤组织增殖培养基上恢复培养24h后,相对成活率分别达56.9%(TTC法)和43.3%(Evans blue法)。恢复培养55d的百子莲胚性愈伤组织经过AFLP多态性检测后未发现基因组变异,证明该方法可用于百子莲种质资源的超低温保存。     

利用单因子和正交设计双重实验法优化鹧鸪茶RAPD-PCR反应体系

为了建立鹧鸪茶RAPD-PCR的优化反应体系,首先通过单因素试验选定其各影响因子比较适宜的浓度范围,再利用正交试验设计方法,对影响鹧鸪茶RAPD-PCR反应的5种因素进行四水平优化试验。并运用SAS软件对试验结果进行了分析,最后确定优化的RAPD-PCR反应体系为：10×Buffer缓冲液2.5 μL+Mg2+ 2.5 mmol/L + dNTPs 0.2 mmol/L + TaqDNA聚合酶1.5 U + S28引物0.48 mmol/L + 80 ng模板,定容至25 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4 min,然后按94℃变性30 s,38℃退火45 s,72℃延伸120 s,进行45个循环,最后72℃延伸10 min;16℃保存。该优化的RAPD-PCR反应体系具有良好的稳定性和重现性,可应用于鹧鸪茶不同居群间亲缘关系和遗传多样性分析。     

裙带菜凝集素的分离及性质研究

裙带菜（Undaria pinnatifida)经Tris-HCl缓冲液粗抽提，然后进行硫酸铵分级实验，测定盐析范围为50％硫酸铵饱和度，经50％硫酸铵饱和度分级后，裙带菜凝集素（UPL）纯化倍数为7．7，总活力回收为167％，UPL粗抽提液中糖的质量分数为5．72％。该凝集素在pH为4．0－10．14时均为活性，但在pH为5．0－9．51时活性较高，pH等于4．0时活力保留25％，pH等于10．14时活力保留50％，该凝集素不被D－果糖，葡萄糖，γ－球蛋白所抑制。     

金属离子对红白锦鲤肠及肝胰脏蛋白酶活性的影响（摘要）（英文）

[目的]研究金属离子对红白锦鲤消化组织蛋白酶活性的影响。[方法]以酶学分析方法研究4种金属离子（Na＋、K＋、Ca2 ＋、Mg2 ＋分别来源于NaCl、KCl、CaCl2.2H2O、MgCl2.6H2O,浓度梯度均设置为25、50、75、100、125、150 mmol/L）对红白锦鲤肝胰脏、前肠、中肠、后肠蛋白酶活性的影响。蛋白酶活性的测定采用福林-酚显色法,用Thermo紫外分光光度计,根据OD680计算蛋白酶活性,以1 min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位,记为μg/（min.g）。[结果]在设定的浓度范围内（25 ～150 mmol/L）,4种金属离子对蛋白酶活性影响不同。K＋对肝胰脏和后肠的蛋白酶活性有不同程度的促进作用,其中K＋对中肠表现为低浓度促进,高浓度抑制的作用,对前肠蛋白酶表现为抑制作用;Na＋对肝胰脏、前肠和后肠的蛋白酶表现为不同程度促进作用,对中肠表现为抑制作用。Mg2 ＋、Ca2 ＋对肠及肝胰脏的蛋白酶均表现为不同程度的抑制作用。试验所选用的K＋、Na＋、Mg2 ＋、Ca2 ＋均属矿物元素,其中添加浓度25 mmol/LK＋对锦鲤肠蛋白酶活性促进作用最大;浓度150 mmol/L Na＋显著提高后肠和肝胰脏蛋白酶活性。这些浓度可作为饲料添加剂中的参考用量。Mg2 ＋、Ca2 ＋对锦鲤各消化器官（中肠除外）的抑制作用随浓度的增加蛋白酶活性降低,但考虑该元素系水产动物生长发育所必需,因此可选用低浓度或螯合物进行添加,以提高酶的生物学效价,提高饲料中蛋白的利用率,降低饵料系数,节约蛋白。[结论]该研究可为红白锦鲤消化生理的研究以及配合饲料的开发、优化提供基础数据和理论依据。     

Hg^2＋胁迫对小麦幼苗生长及其POD·淀粉酶活性的影响

[目的]研究Hg^2＋对小麦种子萌发和幼苗生长的影响。[方法]以郑州9023为供试材料,采用室内水培方法,研究不同浓度（0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500mmol/L）Hg^2＋溶液浸种处理后,对小麦发芽率及幼苗苗高、根长、苗鲜重及叶片、根和萌发种胚中过氧化物酶（POD）、淀粉酶活性等影响。[结果]低浓度Hg^2＋（≤0.100mmol/L）对小麦种子萌发、幼苗苗高、根长和苗鲜重的影响较小。在Hg^2＋浓度〉0.100mmol/L时,对小麦种子萌发和幼苗的正常生长有明显抑制作用。低浓度Hg^2＋（≥0.025mmol/L）可诱导小麦幼苗叶片、根和萌发种胚中POD酶活性明显升高,而抑制淀粉酶活性使之明显的下降,并且这种影响随着Hg^2＋浓度的增大而增强。[结论]Hg^2＋胁迫可以改变小麦幼苗叶片、根和萌发种胚中POD和淀粉酶活性,从而影响其膜脂氧化正常代谢及生长所需的能量和底物的供应不足,最终抑制了幼苗的生长。     

条斑紫菜凝集素的提取及其性质研究

[目的]研究条斑紫菜（Porphyra yezoensis）凝集素的提取及分离纯化条件,并测定凝集素的性质。[方法]以比活力为指标,研究了缓冲体系、固液比、温度及时间等条件对条斑紫菜凝集素提取效果的影响。采用DEAE-Sepharose FF离子交换层析技术进行分离,确定了分离的最佳条件。以血凝集活性为指标,测定了凝集素的糖专一性、2价阳离子依赖性、温度及酸碱稳定性等性质。[结果]固液比为1∶5的Tris-HCl（25 mmol/L,pH值7.5）缓冲液在40℃条件下提取20 h得到的提取液具有最高比活力。条斑紫菜凝集素在50℃条件下加热30 min后活性保持不变,表现出一定的热稳定性,最适作用pH值为7～9。该凝集素能够与麦芽糖、半乳糖、阿拉伯糖及木糖结合,其中与麦芽糖的结合最强,凝集活性依赖Ca2＋、Mg2＋等2价阳离子。[结论]为阐明条斑紫菜的免疫机制及其高效综合利用提供了理论依据。