甘薯羽状斑驳病毒O株系和RC株系中国分离物全基因组 序列分析及其遗传特征

【目的】对甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）O株系中国分离物（SPFMV-O-Ch1）和RC株系中国分离物（SPFMV-RC-Ch1）的基因组全序列进行克隆,明确SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的基因组结构特征及其遗传变异情况,为研究甘薯羽状斑驳病毒的致病机制打下基础。【方法】根据GenBank中登录的SPFMV基因组全序列设计2对简并引物和3对特异性引物,利用RT-PCR方法,从感染SPFMV的甘薯叶片中扩增SPFMV O株系和RC株系中国分离物的基因组全长序列,将目的片段分别克隆到pMD19-T载体上,经序列测定、分析和拼接,获得SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的全序列,利用DNAMAN和MEGA7对SPFMV基因组全序列及不同编码区序列进行遗传变异和系统进化树分析,利用RDP软件分析SPFMV基因组重组情况。【结果】经序列测定和拼接,结果表明SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1基因组分别包含10 922和10 851 nt,均包含一个开放阅读框,分别由10 557和10 482 nt组成,编码一个多聚蛋白,分别由3 518和3 493个氨基酸残基组成。两个分离物均在P1蛋白内编码一个P1N-PISPO蛋白,在P3蛋白内编码一个P3N-PIPO蛋白。基因组全序列核苷酸一致性分析表明,SPFMV-O-Ch1与SPFMV-RC-Ch1的一致性为87.3%,与GenBank登录的其他分离物基因组全序列一致性为86.0%—95.8%,与Ruk73分离物的一致性最高,为95.8%,与11-1分离物的一致性最低,为86.0%。SPFMV-RC-Ch1与GenBank登录的其他分离物基因组全序列一致性为85.9%—98.7%,与IS90分离物的一致性最高,为98.7%,与Aus1-2B分离物的一致性最低,为85.9%。基于多聚蛋白基因核苷酸序列的遗传进化树分析表明,SPFMV-O-Ch1与Ordinary、10-O和17-O等O株系的分离物形成一个分支,SPFMV-RC-Ch1与S、IS90和CW137等RC株系的分离物形成一个分支。重组分析结果表明,O-Ch1分离物中发现3个重组事件,分别发生在7 731—9 710、135—10 012和4 825—6 948 nt,RC-Ch1没有发现重组事件。【结论】我国的SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1分离物的基因组结构与其他分离物相同,O-Ch1与O株系分离物一致性较高,RC-Ch1与RC株系分离物一致性较高,O-Ch1分离物检测到3个重组事件,RC-Ch1未发现重组事件。     

Complete genome sequences of four isolates of Citrus leaf blotch virus from citrus in China

Citrus leaf blotch virus (CLBV) is a member of the genus Citrivirus, in the family Betaflexiviridae. It has been reported CLBV could infect kiwi, citrus and sweet cherry in China. Of 289 citrus samples from six regions of China, 15 were detected to be infected with CLBV in this study. The complete genome of four isolates of CLBV was obtained from Reikou in Sichuan (CLBV-LH), Yura Wase in Zhejiang (CLBV-YL), Bingtangcheng in Hunan (CLBV-BT), Fengjie 72-1 in Chongqing (CLBV-FJ), respectively. While they all represented 8 747 nucleotides in monopartite size, excluding the poly(A) tail, each of the isolates coded three open reading frames (ORFs). Identity of the four isolates ranged from 98.9 to 99.8% to each other and from 96.8 to 98.1% to the citrus references in GenBank by multiple alignment of genomes. A phylogenetic tree based on the genome sequences of available CLBV isolates indicated that the four isolates were clustered together, suggesting that CLBV isolates from citrus in China did not have obvious variation. This is the first report of the complete nucleotide sequences of CLBV isolates infecting citrus in China.     

甘薯卷叶病毒江苏分离物基因组全长序列测定及其外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

为了制备甘薯卷叶病毒(SPLCV)的特异性抗体,克隆了甘薯卷叶病毒江苏分离物SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全长基因,并对其基因结构及分子变异情况进行分析,同时对外壳蛋白(CP)基因进行了克隆和表达。利用PCR方法扩增并克隆了SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全基因组,测序分析表明,SPLCV(JS∶XZ∶3-2)基因组全长为2 834bp,含有6个开放阅读框架,与已发表的SPLCV其他分离物相比,全基因组核苷酸序列相似性为82.7%～94.4%。其中,CP基因由765个核苷酸组成,共编码254个氨基酸残基。SPLCV CP基因核苷酸序列与其他分离物的相似性在89.2%～90.6%,其中与SPLCV美国分离物(HQ333135)的相似性最高,为90.6%;与日本分离物(AB433788)的相似性最低,为89.2%;与中国大陆分离物(FJ515896)CP基因的核苷酸序列相似性为90.2%。将SPLCV CP基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-3上,获得重组质粒,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE分析得到了大小约为54.3kD的融合蛋白条带,说明CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

山东地区樱桃绿环斑驳病毒(CGRMV)的RT-PCR检测及外壳蛋白基因的克隆

为调查我省甜樱桃感染樱桃绿环斑驳病毒(Cherry Green Ring Mottle Virus,CGRMV)情况,本研究以甜樱桃(Prunus avium L.)品种"红灯"叶片总RNA为模板,根据CGRMV基因组序列设计特异引物,对山东地区37份甜樱桃"红灯"样品进行RT-PCR检测,共检测出19份阳性样品。利用CGRMV外壳蛋白基因序列引物,从阳性植物样本中分离到约800 bp的目的片段,克隆测序,序列分析显示该片段全长807 bp,编码268个氨基酸,与GenBank中已登录的CGRMV分离物的外壳蛋白基因序列一致性为87%～97%,氨基酸序列相似性为95%～99%。该结果表明山东地区甜樱桃生产园中感染CGRMV的病例较为普遍。     

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3 的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT-PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV-PE）全长RNA3.经核苷酸序列测定，明确PE分离物 RNA3全长2216 nt，含有2个开放阅读框（ORF），其中5'端的ORF（121-963 nt）编码279 aa的3a蛋白，3'端ORF（1260-1916 nt ）编码218 aa的CP蛋白.5'端非编码区（NR）长120 nt,基因间隔区（IR）长296 nt，3'端NR区含301个碱基.PE分离物编码的3a蛋白中最明显的特征是在136-141位有一个独特的VWCLSS区域.将CMV-PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关.     

猪圆环病毒2型北京株全基因组的克隆与序列分析

为探索近年来北京地区猪圆环病毒2型（PCV2）的流行病学和变异规律,用PCR技术从北京不同猪场的临床发病猪和死亡猪病变组织中分别扩增和克隆获得4株PCV2分离株全基因组序列,并进行测定和分析。结果显示,4株PCV2基因组全长均为1767nt,其核苷酸同源性高达99％,与其他北京分离株的同源性也达98％以上,与国内外其他地区PCV2的核苷酸同源性也在95％以上。由此表明,各个PCV2分离株在进化方面存在地域相关性。     

甜樱桃DFR基因内含子2和内含子3的多态性

【目的】研究70个甜樱桃品种DFR基因多态性与果皮颜色的相关性。【方法】通过DNA序列分析,以不同果皮颜色的10个甜樱桃品种（Prunus avium L.）为材料,检测DFR基因的多态性。根据多态性出现的位点设计特异引物,通过PCR扩增检测70个甜樱桃品种DFR基因的多态性。【结果】获得甜樱桃DFR基因约1 kb的片段,测序结果用BLAST分析发现,其核苷酸序列与樱桃李（Prunus cerasifera）的核苷酸相似性为80 %,预测的氨基酸序列与已知的甜樱桃（P. avium）DFR氨基酸序列相似性达99 %。该片段由3个外显子和3个内含子组成,2个多态性位点分别在内含子2和内含子3上。在黄色、黄底红晕和红色果皮3个组的70个甜樱桃品种中发现3个单倍型,共5种单倍型组合。通过SAS 9.0软件分析发现,所检测到的DFR基因的等位基因频率在黄底红晕果皮品种组和红色品种果皮组中的分布无显著差异。【结论】本研究在甜樱桃DFR基因座上得到2个差异位点,分别在内含子2和内含子3内,其优势基因频率依次为：0.864和0.679;但未发现DFR基因内含子2和内含子3的多态性与果皮颜色之间存在直接关系。     

Genetic Evolution Analysis on Wild Isolates of Citrus Tristeza Virus Originated in China Based on Coat Protein Genes Sequences

The coat protein （CP） genes were cloned and sequenced from viral particles of 11 isolates of citrus tristeza virus （CTV） collected from wild citrus plants in China and 4 Chinese isolates from cultivated sweet orange and pummelo varieties, respectively. By analyzing and comparing the nucleotide and amino acid sequences of CP genes, the 11 wild CTV isolates were found over 92% identical with 4 Chinese CTV isolates and 21 exotic CTV isolates from cultivated citrus. From 91 to 100% of the CTV CP gene sequences in wild type citrus plants were generally well conserved. Genetic evolution analysis indicated that the GC% of the CP gene was less than AT%, and more transition were found in the CP genes than transversion with the transition/transversion ratio ranging from 6.3 to 7.0 among species. The substitution frequency was the highest at the third codon, followed by the first and second codon. The ratio of non-synonymous mutations （du） to synonymous mutations （ds） was far lower than 1, suggesting that the CP gene might have experienced purifying selection in the evolution. Phylogenetic analysis revealed that the 11 CTV isolates in Chinese wild type citrus belonged to different phylogenetic clusters, and shared higher homology and closer relationships with other cultivated citrus CTV isolates from different countries, which indicated complicated genetic relationships among the CTV isolates. In addition, CTV isolates with similar biological characteristics usually located into the same clusters. Therefore, the conclusion was drawn that pathogenicity was critical to evolution and origin of CTV.     

A/Grganey/SanJiang/160/2006(H5N2)分离株HA基因克隆及序列分析

应用RT-PCR方法,对从一只野生白眉鸭(Anas querquedula)中分离出的禽流感病毒分离株A/Grganey/SanJiang/160/2006(H5N2)的HA基因进行了序列的克隆和测定.测序结果显示,克隆的HA基因全长为1 731 bp,共编码565个氨基酸.核苷酸和氨基酸的最大同源性比较结果表明,该毒株的HA基因与其它31株H5N2亚型禽流感病毒HA基因的同源性为71.0%～98.2%,氨基酸序列同源性为84.0%～98.2%;遗传进化关系表明,该毒株属于欧亚群系.通过血凝素裂解位点的氨基酸序列分析可知,该毒株的HA切割位点上未见到典型的高致病力毒株H5、H7所具有的一系列碱性氨基酸,符合低致病力禽流感毒株的分子特征.     

侵染中国甘蔗和玉米的SCMV CP基因序列多样性分析

【目的】揭示侵染中国甘蔗及玉米的甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV）的遗传多样性，为抗病品种培育及病害综合防治提供依据。【方法】以病株叶组织总RNA抽提物为模板，通过RT-PCR扩增及扩增产物直接测序获得了华南地区SCMV 26个甘蔗及玉米田间分离物的近全长CP基因序列，结合GenBank中已公布的部分相应序列，采用序列比对及分子系统进化树重建方法，对SCMV CP基因序列的变异性进行分析。【结果】中国SCMV可分为3个分子组群，各组群分别对应于各自来源的寄主，即杂种甘蔗(糖用甘蔗, Saccharum interspecific hybrids)、玉米(Zea mays)和高贵甘蔗（果用甘蔗,Saccharum officinarum）。CP基因核苷酸同一性，不同组群之间为78%～84%，同一组群内部各分离物之间大于91%。在分子系统进化树中，这3个分子组群各自聚集成簇，前两个组群分别隶属于Alegria等（2003）建立的甘蔗组（sugarcane group，SCE 组）和玉米组（maize group，MZ组），第3个组群为本研究首次发现，命名为高贵甘蔗组（noble sugarcane group，NSCE组）。侵染杂种甘蔗的SEC组不存在明显的地域分化，而侵染玉米和高贵甘蔗的MZ组和NSEC组则可对应地理来源分为若干亚组，前者可分为华东华中亚组、西北西南亚组及华南亚组，后者至少包括华南亚组和浙江亚组。在玉米、杂种甘蔗及高贵甘蔗混栽区，不同作物上的SCMV可以通过蚜虫传播而交叉侵染，但各组群间依寄主种类存在相对隔离现象。本研究还发现中国华南地区，SCMV可自然侵染甘蔗近缘属杂草河八王（Narenga sp.）和芒（Miscanthus sp.）。【结论】在中国，SCMV存在丰富的遗传多样性，其分化与寄主类型密切相关，可分为杂种甘蔗组、玉米组和高贵甘蔗组，其中玉米组和高贵甘蔗组又可根据地理来源分为若干亚组。在抗病品种的选育及病害综合防治中，必须充分考虑到病毒的这种分化现象。     

猪圆环病毒2型广东株全基因的克隆与序列分析

根据GenBank中发表的已知猪圆环病毒2型(Porcine Circovims-2,PCV-2)全基因序列,自行设计2对特异性引物,从2株接种疑似断乳仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning muhisystemic wasting syndrome,PMWS)仔猪病料的PK-15细胞中提取基因组DNA,以此为模板,用PCR方法分2段扩增2个PCV-2广东株(GZ株和ZS株)的全基因序列．应用序列分析软件DNAstar,对所测2组PCV-2序列与GenBank中的国内外PCV-2毒株进行同源性比较,并绘制系统进化发生树,进行了序列分析．结果表明,2个PCV-2广东株全基因组皆为1767bp,2个毒株间全基因序列核苷酸同源性为77．0％,第一开放阅读框(ORF1)间的核苷酸同源性仅为57．7％,而第二开放阅读框(ORF2)间的核苷酸同源性却高达99．1％．ZS株和GenBank中国内外其他的PCV-2参考毒株序列的核苷酸同源性在95．7％-99．5％之间;而GZ株和其他PCV-2参考毒株序列的核苷酸同源性仅在74．2％-77．1％之间．     

水稻条纹病毒外壳蛋白基因和病害特异性蛋白基因的克隆和序列分析

水稻条纹病毒编码的外壳蛋白 (CP)和病害特异性蛋白 (SP)是两种与症状密切相关的蛋白 .本文对我国云南 YL分离物的 CP基因和 SP基因进行了克隆和测序 .结果表明 ,CP基因和 SP基因分别由 96 6和 534个核苷酸组成 .与已发表的一些分离物相比 ,YL分离物 CP基因与我国山东 C分离物和日本 T、M分离物的核苷酸序列一致性在 96 .0 %左右 ,氨基酸序列一致性为 97.0 % ,但从序列一致性和碱基变异方式来看 ,C分离物与 T、M分离物的亲缘关系稍近 .YL 分离物 SP基因和云南 CX分离物之间有 99.0 %的核苷酸序列一致性 ,但与 T、M分离物的核苷酸一致性只有 94 .0 %左右 .可见 ,不同分离物间 SP基因的变异与其地理分布有密切的关系 .     

猪Ⅱ型圆环病毒浙江分离株全基因组的克隆与序列分析

越来越多的证据显示,猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)是断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原之一.本研究克隆了两株PCV2浙江分离株(JS2003和Zhuji2003)的全基因并对其进行测序.序列分析结果表明,这两个基因组全长均为1767nt,与GenBank中的其它24株PCV2相比,核苷酸同源性为94.8%～99.8%,而与4株PCV1的核苷酸同源性仅为76.5%～78.0%.虽然PCV2基因从总体上来说相对稳定,但在不同地区分离到的PCV2中确实存在一定的基因差异.     

Molecular diversity of barley yellow dwarf virus-PAV from China and the Czech Republic

Wheat yellow dwarf disease (BYD), caused by different species of barley/cereal yellow dwarf viruses (B/CYDVs), is one of the most serious cereal diseases in China and the Czech Republic. Because genetic diversity of the virus directly influences disease epidemiology, the molecular diversity and population structure of 24 Chinese isolates and 16 the Czech Republic isolates of BYDV-PAV from different regions in two countries were analyzed by sequencing their coat protein (CP) and readthrough protein (RTP) domain (RTD) genes and comparing the sequences with six CP and 16 RTP sequences of BYDV-PAV isolates from the NCBI database based on nucleotide identity position, phylogenetic analysis and nucleotide diversity. Nucleotide identities between the Chinese and the Czech Republic isolates for the CP were 76.6–99.4%, 73.9–89.1% for RTD (ORF5), respectively. The Chinese and the other country isolates showed 74.7–99.2% nucleotide identity for RTP (ORF3+ORF5). Phylogenetic analysis of CP sequences showed that 20 Chinese isolates clustered in the same clade, but the other four Chinese isolates clustered in another clade with the isolates from the Czech Republic and other counties. The population of BYDV-PAV in China had greater nucleotide variability and was more divergent than that in the Czech Republic. Geographical and ecological factors but not hosts might contribute to the population differences in the two countries.     

猪流行性腹泻病毒陕西渭南株的遗传变异

从陕西省渭南某规模化猪场采集疑似猪流行性腹泻(PED)仔猪病料进行病毒检测,旨在从基因遗传变异方面分析疾病发生的可能原因。通过RT-PCR从疑似仔猪20份小肠样品中检测到9份PED病毒阳性样品,并扩增出PED病毒M、ORF3和S基因的部分序列。序列分析结果表明,与CV777疫苗株对比,样品渭南(WN)株PEDV M基因高度保守,同源性为98.2%;ORF3基因存在11处碱基突变,同源性为98.2%;S基因突变较大,存在4个插入区域,分别是164~166、177~179、181~186和416~418nt,内分核心中和表位区(COE,499~638位氨基酸)存在9个氨基酸突变位点。遗传分析显示,WN株M基因与中国近期分离毒株亲缘关系较近;ORF3基因与同处在G1群中的中国毒株亲缘关系较近,而与CV777疫苗株亲缘关系较远;S基因与中国早期分离毒株及CV777疫苗株亲缘性较远,与当前的流行株亲缘关系密切。这些结果表明,WN株与CV777疫苗株相比,有明显的遗传变异倾向,可能导致目前PEDV疫苗免疫效果下降,PED疫情大规模流行。     

新疆甜菜坏死黄脉病毒RNA5的检测及核苷酸序列分析

利用RT-PCR方法,对12个新疆不同地区的甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)分离物和美国的BN-TX及黑龙江的He分离物进行检测,结果表明,只有库尔勒地区的所有分离物和来自黑龙江的He分离物含有RNA5,其他地区的分离物未检测到RNA5。选K2和He分离物进行序列分析,测得K2分离物长为1323 nt,He分离物长为1300 nt;与国内外报道的中国包头B分离物、呼和浩特H、日本的D5分离物和法国的F72分离物的RNA5序列相比,序列同源性K2为95.0％～96.8％,He为96.0％～99.3％,均含有一个开放阅读框(ORF),由此推导出的各分离物的氨基酸同源性,K2为93.0％～96.5％,He为96.5％～99.6％。其变异主要集中在富含A的区域。     

不同防腐剂处理对甜樱桃生理代谢及保鲜效果的影响(英文)

[目的]探讨不同防腐剂处理对甜樱桃生理代谢和保鲜效果的影响。[方法]以萨米托(Summit)甜樱桃为试材,分别用噻霉酮(benziothiazoli-none)、溶菌酶(Lysozyme)、溶菌酶+NPS多糖(NPS polysaccharide)和清水浸泡处理各5min,捞出沥干,装入衬有0.03mm厚PE袋的纸盒内,在(-0.5±0.5) ℃的条件下贮藏保鲜,以不处理的为对照。[结果]用噻霉酮处理后的第14天苹果酸脱氢酶(MDH)活性出现明显的峰值,其余处理至第 21天时苹果酸脱氢酶活性开始回升;各处理的 POD 活性总体呈下降的趋势;PPO 性至第14天时出现明显的峰值,但清水处理则呈下降的趋势,到第21天时,各处理的PPO 活性出现缓慢的回升迹象;药剂处理后的甜樱桃可滴定酸含量明显高于清水处理和对照;可溶性固形物各处理间以及各处理与对照间没有明显的区别;至第 40天,药剂处理的好果率显著高于清水处理和对照。[结论]噻霉酮、溶菌酶等防腐剂处理对甜樱桃的保鲜、防腐具有较好的作用;溶菌酶处理可在一定时间内降低甜樱桃的苹果酸脱氢酶活性,保持较高的有机酸含量,显著提高好果率。     

柑橘碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

 【目的】了解中国CTLV分离物外壳蛋白（CP）基因的变异情况。【方法】对来源于中国不同地区、不同寄主品种的18个柑橘碎叶病毒（CTLV）分离物进行RT-PCR、克隆、测序,应用DNAMAN软件进行序列分析。【结果】18个分离物的CP基因全长714 nt, 推导的CP含237个氨基酸。CP核苷酸序列及推导的氨基酸序列最大相似性分别为88.5％～99.9％和91.1％～99.6％。与核苷酸序列G289→A或C、A409→C和G414→T的单碱基突变相对应,CTLV外壳蛋白第97、137、138位氨基酸在强、弱毒分离物之间存在差异,多数弱毒分离物为Q97或K97、Q137、H138,而多数强毒分离物为E97、R137或K137、Q138。在根据CP氨基酸序列构建的系统进化树上,本研究获得的18个CTLV分离物至少可以划分为2个组群,其中,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在第Ⅰ组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物划分在第Ⅱ组群。【结论】CTLV外壳蛋白基因相对保守,其第289、409、414位碱基在强、弱毒分离物之间存在差异,可能与病毒致病性相关。