马立克氏病鸡组织中PRNP基因表达量分析

【目的】探明PRNP基因表达量与鸡马立克氏病发病之间的关系.【方法】从甘肃省康乐县某养鸡场采集马立克(MD)病鸡组织样品,通过RT-PCR检测MDV致瘤相关基因Meq和pp38以及病理组织学观察将样品分为MD肿瘤病变鸡、MD无病变鸡与健康鸡,最后通过荧光定量PCR方法分析3组中PRNP基因mRNA水平的相对表达量的差异.【结果】MD无病变鸡中PRNP基因的表达规律与健康鸡基本一致,但与MD肿瘤病变鸡完全不同;除脑外,MD病鸡组织PRNP基因的表达量均高于健康鸡,其中肿瘤病变组织PRNP基因的表达量显著高于无病变组织(P0.05),而且PRNP基因在MD病鸡肿瘤病变组织与健康鸡组织的表达差异与肿瘤病变程度有关.【结论】PRNP基因的表达量与MDV感染存在相关性,PRNP基因在MD肿瘤组织中过表达,且PRNP基因的差异表达与肿瘤病变程度有关.     

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID₅₀/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。     

马立克氏病病毒河南分离株Meq基因的克隆与序列分析

【目的】了解马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)河南分离株Meq基因的分子特性,为中原地区MDV流行情况提供较详细的信息,为更好地防控MD奠定基础。【方法】应用PCR方法分别扩增了17株MDV河南省野毒分离株的Meq基因片段,克隆测序后,将各毒株Meq基因序列与vv+MDV 648A株、vvMDV RBIB株、vMDV GA株、mMDV疫苗株CVI988株和814株的Meq基因序列进行比对分析。【结果】17株分离株中除HNGS201和HNLC503的Meq基因扩增产物较预期稍大外,其余15个的片段长度为1 020bp,与预期长度相符;MDV河南分离株之间及其与参考毒株Meq基因的核苷酸同源性为99.0%~100%,部分毒株Meq基因的氨基酸序列有10个位点的氨基酸存在规律性突变;MDV河南分离株和参考株共组成3个进化分支,其中强毒株GA、RB1B和648A位于一个分支,分离株HNGS201、HNLH304、HNLC503与mMDV毒株CVI988和814位于同一分支,其余14株分离株位于另一个较大的分支。【结论】河南省可能流行着不同毒力的MDV,一些mMDV毒株的Meq蛋白存在59个或60个氨基酸的插入。     

坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立

【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin引物,将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99 以上, 检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA;特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5%;用已建立的方法对临床样品进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。     

鸡马立克氏病毒疫苗的种类和应用

鸡马立克氏病毒（MDV）疫苗目前分为如下5类：血清Ⅰ型马立克氏病毒疫苗,血清Ⅱ型马立克氏病毒疫苗,血清Ⅲ型马立克氏病毒疫苗,马立克氏病毒多价苗,马立克氏病毒基因工程苗。马立克氏病毒疫苗的应用,应结合鸡马立克氏病（MD）的流行病学特点和马立克氏病毒疫苗的特性进行合理选择应用。     

牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列（No. MBU87961,gi9954088）设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR Green I实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。     

一例鸡马立克氏病的诊断及其病毒Meq基因序列分析

为确定四川省乐山市某蛋鸡场病鸡的发病原因,该试验采用临床剖检、 PCR方法对发病鸡进行诊断,并对病毒Meq基因全序列进行PCR扩增、测序和序列分析。剖检结果为病鸡心脏、肝脏和脾脏表面均有白色结节,PCR鉴定结果为马立克氏病病毒（Marek’s disease virus, MDV）阳性。MDV Meq基因全序列长度均为1020bp,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6%～99.9%和98.8%～100%,与MDV参考序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%～99.8%和95.9%～99.4%。4个Meq测序序列存在4个新的氨基酸突变位点,均具有D80Y、 V115A、 T139A、P176R和P217A氨基酸突变位点,符合MDV强毒株的序列特征。系统发育树显示4株乐山市分离毒株测序序列与近年国内大部分参考毒株聚在同一分支上,亲缘关系较近,未形成明显的地理分支,乐山MDV样品132bp重复序列的拷贝数及Meq基因的变异均符合MDV强毒株的序列特征,且存在新的氨基酸突变。     

马立克氏病鸡MDV血清基因的克隆与鉴定

[目的]克隆马立克氏病鸡MDV血清基因,并对其进行鉴定。[方法]从潜伏期感染马立克氏病鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR扩增马立克氏病毒的L-meq基因。将其插入pMD18-T克隆载体并进行测序,并用DNAman软件进行序列分析。[结果]获得的DNA片段的序列与已发表的L-meq基因序列相一致,表明该试验成功获得了目的基因。[结论]该研究可为鸡马立克氏病的预防与治疗提供新思路和新方法。     

新型阿卡斑病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR建立及广西边境地区蚊携带新型阿卡斑病毒调查

【目的】建立检测新型阿卡斑病毒（AKAV）的SYBR Green I荧光定量RT-PCR,并结合序列测定开展广西边境地区蚊携带新型AKAV调查,了解其流行趋势及遗传进化特征,为建立重要蚊媒病毒病预警机制提供技术支持。【方法】分别针对新型AKAV的S基因和M基因主要变异位点设计引物,建立SYBR Green I荧光定量RT-PCR并通过Ct值、标准曲线斜率、相关系数、扩增效率及扩增准确性等指标确定最佳反应体系及扩增程序;以优化的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测2019年6—10月在广西边境地区采集的139份蚊样品,获得的新型AKAV经测序后采用ClustalW构建遗传进化树。【结果】 SYBR Green I荧光定量RT-PCR最佳反应体系: SYBR Premix Ex Taq II 10.0 μL,上、下游引物（4 μmol/L）各1.0 μL,标准品或反转录产物2.0 μL,双蒸水补齐至20.0 μL。扩增程序: 95℃预变性30 s; 95℃ 30 s,64℃（S基因）/66℃（M基因）30 s,72℃ 30 s,进行40个循环。SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测新型AKAVS基因和M基因的极限为1.0×101 copies/μL和1.0×102 copies/μL,对应的扩增效率分别为98.61%和105.81%,但不能扩增蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌;检测S基因和M基因的批内重复试验、批间重复试验变异系数（CV）均低于5.00%。采用建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR成功从广西边境地区防城港市、东兴市、宁明县、大新县及北海市的阿蚊和库蚊中检出新型AKAV,且均属于基因Ia型,尤其与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性。【结论】针对新型AKAV S基因和M基因建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,更适用于检测病毒拷贝数低的样品。此外,从广西边境地区蚊样品中检出的AKAV毒株均为新型AKAV,属于基因Ia型,与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性,推测新型AKAV已在广西周边省份流行。     

转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法,为转基因植物中外源基因拷贝数的检测提供参考.[方法]采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因(GFP)的拷贝数,以烟草单拷贝的内源核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因,建立相对定量的双标准曲线法检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法.[结果]构建RNR2基因、GFP基因实时荧光定量PCR的标准曲线,分别为y=-0.2858x+5.6695和y=0.2826x+2.1048,R2分别为0.9994和0.9989,相关性较高.在检测的5株转基因烟草中GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28和45,非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0.[结论]建立的转基因烟草中外源基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法具有简单、快速、准确等优点,可用于基因工程中对优良转化植株的筛选及外源基因表达量的快速检测和定量分析.     

肉种鸡MDV和REV人工共感染的动态病理学与抗原定位研究

 【目的】深入了解MDV与REV人工共感染肉种鸡后疾病的发生、发展状况,为二者临床复杂的混合感染提供确实的鉴别诊断方法和明确的诊断时间。【方法】MDV和REV强毒株人工共感染1日龄肉种鸡,定期剖检,进行病理组织学、细胞凋亡、免疫组化和肿瘤组织的超微结构观察。【结果】肝、胰腺、腺胃、盲肠扁桃体、心肌在感染后1周出现以小淋巴细胞浸润为主的炎症,2～9周时,大部分实质器官出现以幼稚淋巴细胞、大中小淋巴细胞为主的渐进性增生灶,部分增生灶中可见原始网状细胞和马立克氏病细胞;10周后免疫器官实质细胞出现明显的凋亡;免疫组化显示,肝、脾、法氏囊、胸腺等在2周时呈双抗原阳性;电镜下,肝脏肿瘤组织中可见多形态淋巴细胞,核分裂相和细胞凋亡同时存在,同一细胞中可见MDV和REV两种病毒粒子。【结论】MDV与REV共感染对病程起协同和促进作用,发病早,病变明显;免疫酶及荧光方法可用于共感染的早期诊断（2周以前）;而后期（4周以后）可通过病理组织学进行鉴别诊断,两种病毒粒子、马立克氏病细胞、原始网状细胞、多形态和幼稚淋巴细胞可作为诊断依据。     

猪瘟疫苗病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪瘟疫苗病毒(HCLV)含量的荧光定量PCR方法。【方法】用RT-PCR方法扩增HCLV基因200bp片段,构建含有该基因片段的重组质粒,对此重组质粒进行系列稀释后作为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR模板,绘制定量检测HCLV的标准曲线。【结果】在(6.4×107~6.4×102)copies/μL模板浓度范围内,荧光定量PCR的扩增效率为92.2%,标准曲线的决定系数为0.9997。该方法的精确灵敏度为640copies/μL,重复性试验的变异系数小于2%,对牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性。临床检测结果显示,不同商品猪瘟疫苗之间的病毒载量存在明显差异。【结论】建立了1种具有良好特异性与敏感性的HCLV荧光定量PCR检测方法。     

弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断方法的建立及耐药性分析

根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌ompA基因序列,设计1对特异性引物,PCR扩增弗氏柠檬酸杆菌ompA基因片段,T克隆到pMD-18T载体上构建标准阳性质粒。通过SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件优化,建立弗氏柠檬酸杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR诊断方法,结果显示重复性好、特异性高,灵敏度可达1.0×10~1拷贝/μL,说明建立的弗氏柠檬酸杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法适合于弗氏柠檬酸杆菌病临床疑似病料样品的快速诊断。对分离得到的83株弗氏柠檬酸杆菌进行药敏试验,结果表明冷水鱼养殖中耐药性问题日益严重。     

猪圆环病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种可以定量检测猪圆环病毒3型(PCV3)的荧光定量PCR检测方法。【方法】设计与验证1对PCV3特异性引物,以系列稀释后的PCV3全基因组质粒为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增。【结果】该方法不能检出PCV1与PCV2等常见猪DNA病毒,精确灵敏度至少达到100 copies,所绘制标准曲线回归方程的决定系数为0.999,扩增效率为83.6%,对53份临床样品的检测阳性率高于常规PCR。【结论】建立1种具有良好特异性、敏感性与重复性的定量检测PCV3的荧光定量PCR方法。     

免疫磁珠富集与SYB RGreen荧光定量PCR技术联合检测水体中甲肝病毒

本实验旨在建立一种免疫磁珠与SYBR Green荧光定量PCR技术联合检测水体中甲肝病毒的方法。通过制备特异性甲肝病毒免疫磁珠,优化病毒核酸提取方法,建立了免疫磁珠富集病毒和荧光定量PCR检测水体中甲肝病毒的方法。研究结果显示,1mg免疫磁珠与75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时,有最大抗体偶联量;该偶联后的磁珠富集甲肝病毒效率为92.87%。研究结果还显示,SYBR Green荧光定量PCR检测的标准曲线线性关系良好(R~2=0.999),检测极限低至9.27×10~1拷贝/μL。本研究结果表明,免疫磁珠与SYBR Green荧光定量PCR技术结合,具有特异性强、灵敏度高、可信度强、简便快捷的优点,本方法对水体中甲肝病毒污染状况检测与评价提供了有力的技术支持。     

褐色橘蚜中柑橘衰退病毒实时荧光定量 RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,测定褐色橘蚜（Toxoptera citricida）中柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）含量。【方法】根据CTV CP25保守序列,设计特异性引物HD-F/R,通过优化得到最佳反应条件建立橘蚜中CTV实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性检验,评价该方法的可行性。应用该方法测定单头橘蚜中CTV含量。【结果】该实时荧光定量RT-PCR方法最低检测限为9.0拷贝/μL,其灵敏度是常规RT-PCR的100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关性系数为0.998,扩增效率达104.7%。批内和批间变异系数均小于3.24%,表明该方法重现性好。获毒24 h单头橘蚜中CTV最低含量为2.5×103拷贝,最高含量为1.24×106拷贝。【结论】本研究建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法能够准确检测褐色橘蚜中的CTV,可用于研究褐色橘蚜-CTV-寄主互作关系及CTV的流行。     

MDV引起肉鸡动脉粥样硬化机理的研究

马立克氏病(MD)是由疱疹病毒引起的一种高度接触传染性淋巴组织增生性肿瘤疾病.近年来,许多学者在研究该病时发现感染马立克氏病病毒的鸡发生了冠状动脉粥样硬化(AS),引起国内外临床学界和微生物学界的高度关注.本试验通过人工接种MDV,建立肉仔鸡动脉粥样硬化(AS)的病理模型,从而研究MDV诱发AS的发生机理,为今后在人类医学上预防冠状动脉粥样硬化奠定基础.     

鸡IL-6、IL-17和IFN-γ实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立针对鸡白介素6（IL-6）、白介素17（IL-17）和γ干扰素（IFN-γ）的实时荧光定量PCR检测方法,为细胞因子的定量检测及病毒致病机制的研究奠定基础.[方法]根据GenBank已发表的鸡IL-6、IL-17、IFN-γ和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因保守序列,设计并合成4对相应的特异性引物,以鸡胚成纤维细胞的cDNA为模板构建重组质粒,对退火温度、引物浓度等SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应条件进行优化,建立各基因的标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性试验.[结果]GAPDH、IL-6、IL-17和IFN-γ的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增效率分别是98.2％、99.2％、102.0％和100.8％,相应的标准误差为0.00666、0.00813、0.00365和0.00458.特异性试验结果显示各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰,敏感性试验结果表明各基因的检测下限均为100拷贝,重复性试验结果表明组内变异系数均小于2.00％.[结论]建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、特异性强等特点,为快速检测和定量鸡源IL-6、IL-17和IFN-γ的表达水平提供了技术平台.     

鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

 【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。     

鸡马立克氏病毒蛋白的分离与鉴定

鸡马立克氏病是一种高度接触性、致死性、恶性肿瘤性传染病,一旦发生,损失严重。为快速诊断此病,建立了一种应用SDS-PAGE电泳和Western-blot染色分离鉴定、纯化马立克氏病毒特异性抗原蛋白的方法,并获得了与MDV抗血清特异反应的抗原蛋白。为进一步制备抗MDV特异性单克隆抗体奠定基础。