转基因水稻深加工产品两种荧光定量方法的比较研究

根据转基因水稻中外源基因Cry1A(B)和内源基因SPS设计SYBR Green I引物、TaqMan引物和荧光探针,以内源基因SPS作为内参照,使用两种FQ-PCR方法对水稻深加工产品中转基因水稻的含量进行定量检测.建立了转基因水稻标准品Cry1A(B)和SPS之间的△Ct与样品中转基因水稻含量百分比之间的校正曲线和...     

TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR法检测 转基因植物外源基因拷贝数的差异分析

探讨TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR 2种方法检测转基因植物外源基因的拷贝数方法的差异。以12株T0转基因水稻为材料,分别用TaqMan与SYBR Green实时定量PCR法检测其拷贝数,然后用SAS 9.1软件对2种方法的结果进行t检验分析。通过SAS对2组数据的t检验分析,在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green与TaqMan探针法的结果接近,差异不显著;当内参基因与目的基因扩增效率差异明显时,SYBR Green与TaqMan探针法差异显著。在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green法测定转基因植物外源基因的拷贝数时结果接近TaqMan探针法。     

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID₅₀/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。     

SYBR? Green qPCR Screening Methods for Detection of Anti-herbicide Genes in Genetically Modiifed Processed Products

The use of genetically modified organisms (GMOs) as food products becomes more and more widespread. The European Union has implemented a set of very strict procedures for the approval to grow, import and/or utilize GMOs as food or food ingredients. Thus, analytical methods for detection of GMOs are necessary in order to verify compliance with labelling requirements. There are few effective screening methods for processed GM (genetically modified) products. Three anti-herbicide genes (CP4-EPSPS,BAR andPAT) are common exogenous genes used in commercialized transgenic soybean, maize and rice. In the present study, a new SYBR? Green qPCR screening method was developed to simultaneously detect the three exogenous anti-herbicide genes and one endogenous gene in a run. We tested seven samples of representative processed products (soya lecithin, soya protein powder, chocolate beverage, infant rice cereal, maize protein powder, maize starch, and maize jam) using the developed method, and amplicons of endogenous gene and transgenic fragments were obtained from all the processed products, and the sensitivity was 0.1%. These results indicated that SYBR? Green qPCR screening method was appropriate for qualitative detection of transgenic soybean, maize and rice in processed products.     

SYBR~ GreenI实时PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

利用特殊性引物,应用SYBR Green I实时PCR技术鉴定检测了商业化种植的转基因油菜RT73品系。结果表明,应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为(80.2±0.5)℃,而对其他油菜品系则检测不到荧光信号。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分了特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法。     

Comparison of Two Real-time PCR Technigues for Quantification of GMO Contents in Highly Processed Products of Soybean

The RR soybean was quantitatively detected by ABI Prism 7300 sequence detector with PCR primers and fluorescence probes were designed according to the sequences of endogenous Lectin gene and exogenous CP4-EPSPS gene, and the PCR systems were based on SYBR GreenΙand TaqMan. The standard curve of °Ct between CP4-EPSPS gene and Lectin gene of the RR soybean in standard materials was generated and a linear regression equation was obtained. Quantification methods were optimized through two different real-time PCR chemistries, i.e. SYBR GreenΙand TaqMan, and the RR soybean contents were quantified in five standard samples and seven highly processed products by the two assays. Both methods are proved to be specific, highly sensitive and reliable for both identification and quantification of soybean DNA. The results indicate that the two optimized PCR system can be used for the practical quantitative detection of RR soybean in highly processed products.     

奶牛隐孢子虫SYBR Green Real-time PCR检测方法的建立

为建立一种方便快捷的检测奶牛隐孢子虫的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,根据GenBank中已发表的隐孢子虫18s rRNA基因设计一对引物,并以从卵囊中提取的DNA为模版,初步建立了检测奶牛隐孢子虫的SYBR Green Real-time PCR方法,进而对采集的奶牛粪便进行了特异性、敏感性和重复性检测。结果显示,本研究建立的Real-time PCR方法敏感性高,最低检测阈为10个拷贝的质粒DNA和1g粪便中的10个卵囊,扩增产物的特异性良好,重复性试验的标准差为0.494,重复性良好。研究表明,建立的Real-time PCR快速、特异、敏感,可用于奶牛隐孢子虫病的流行病学调查。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR （RT-PCR）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

Molecular Characterization and SYBR Green Ⅰ-Based Quantitative PCR for Duck Hepatitis Virus Type 1

To determine the genomic sequence of a duck hepatitis virus type 1 (DHV-1) strain,real-time quantitative polyrnerase chain reaction (RTQ-PCR) assay based on SYBR Green Ⅰ technology was developed to target 3D gene of DHV-1.Comparative sequence analysis showed that the genome has a typical picornarivus genetic organization,and strain DHV-1 R genetic organaiztion is 5' untranslated region (UTR)-VPO-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3' UTR,DHV-1 R has close relationship with Parechovirus,and has 95.1-99.1% nucleotide sequence identity with other DHV-1 strains.Based on the DHV-1 sequences in GenBank,three pairs of specific primers were designed to amplify DHV-1 using real-time PCR.The results showed that real-time PCR Tm value is 85.6℃ and the real-time PCR provides a broad dynamic range,detecting from 102 to 109 copies of DHV-1 cDNA per reaction.No cross-reactions were found in specimens containing DPV,AIV and NDV.It is concluded that DHV-1 belongs to a new group of the family Picornaviridae that may form a separate genus most closely related to the genus Parechovirus.All results showed that the real-time PCR has high sensitivity and specificity to detect DHV-1 using SYBR Green Ⅰ dissociation curve analysis,isolates can be distinguished by their melting temperature.These methods are rapid,sensitive,and reliable,and can be readily adapted for detection of DHV-1 from other clinical samples.     

TRIM21基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

三基序蛋白21（TRIM21）与癌症、肿瘤及固有免疫等密切相关。为了快速检测TRIM21基因的表达，根据Genbank中公布的TRIM21基因序列设计引物，通过常规PCR扩增该基因后克隆至pMD-18T载体上，测序并鉴定正确后制备重组质粒，以pMD-18T-TRIM21重组质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线。采用重复性、特异性及灵敏性等试验，成功建立了检测TRIM21基因的荧光定量PCR检测方法。结果显示，该方法灵敏度高，最低检测下限为37.7 copies·μL?1，比普通PCR高出10倍。在3次独立的试验中，组内和组间变异系数较小，具有较高的可重复性，同时，还能检出不同细胞中TRIM21的表达。因此，该荧光定量方法可为TRIM21的检测及临床研究提供技术支持。     

新型阿卡斑病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR建立及广西边境地区蚊携带新型阿卡斑病毒调查

【目的】建立检测新型阿卡斑病毒（AKAV）的SYBR Green I荧光定量RT-PCR,并结合序列测定开展广西边境地区蚊携带新型AKAV调查,了解其流行趋势及遗传进化特征,为建立重要蚊媒病毒病预警机制提供技术支持。【方法】分别针对新型AKAV的S基因和M基因主要变异位点设计引物,建立SYBR Green I荧光定量RT-PCR并通过Ct值、标准曲线斜率、相关系数、扩增效率及扩增准确性等指标确定最佳反应体系及扩增程序;以优化的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测2019年6—10月在广西边境地区采集的139份蚊样品,获得的新型AKAV经测序后采用ClustalW构建遗传进化树。【结果】 SYBR Green I荧光定量RT-PCR最佳反应体系: SYBR Premix Ex Taq II 10.0 μL,上、下游引物（4 μmol/L）各1.0 μL,标准品或反转录产物2.0 μL,双蒸水补齐至20.0 μL。扩增程序: 95℃预变性30 s; 95℃ 30 s,64℃（S基因）/66℃（M基因）30 s,72℃ 30 s,进行40个循环。SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测新型AKAVS基因和M基因的极限为1.0×101 copies/μL和1.0×102 copies/μL,对应的扩增效率分别为98.61%和105.81%,但不能扩增蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌;检测S基因和M基因的批内重复试验、批间重复试验变异系数（CV）均低于5.00%。采用建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR成功从广西边境地区防城港市、东兴市、宁明县、大新县及北海市的阿蚊和库蚊中检出新型AKAV,且均属于基因Ia型,尤其与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性。【结论】针对新型AKAV S基因和M基因建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,更适用于检测病毒拷贝数低的样品。此外,从广西边境地区蚊样品中检出的AKAV毒株均为新型AKAV,属于基因Ia型,与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性,推测新型AKAV已在广西周边省份流行。     

SYBR Green实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数

采用SYBR Green I real-time PCR方法检测转基因大豆中外源基因35S边界基因的拷贝数,以大豆凝集素基因(Lectin)作为内参照基因,以转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,初始浓度为0.43μg·μL-1,进行5倍梯度稀释得到内参照基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线:y=-2.9915x...     

利用SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因的拷贝数

[目的]探讨SYBR Green实时定量PCR技术应用于检测转基因植物外源基因拷贝数的可行性。[方法]使用SYBR Green实时定量PCR技术,以转CYCD3;1的拟南芥为材料,通过CYCD3;1基因与单拷贝内参基因以及转基因株系中的CYCD3;1基因与野生型植株的比较来确定外源基因的拷贝数。[结果]该法计算所得外源基因拷贝数与传统高准确性的Southern blot法结果相符。[结论]使用该法检测外源基因拷贝数简单易行,可操作性强。     

猪圆环病毒2型SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

参考GenBank上的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,根据其开放阅读框ORF1保守序列设计引物,建立基于SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法来检测PCV2.所建立的荧光定量PCR方法最低检测限为82.2拷贝·反应-1,与常规PCR相比,灵敏度高出100倍.扩增产物的融解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,...     

利用SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因的拷贝数

[目的]探讨SYBR Green实时定量PCR技术应用于检测转基因植物外源基因拷贝数的可行性。[方法]使用SYBR Green实时定量PCR技术,以转CYCD3;1的拟南芥为材料,通过CYCD3;1基因与单拷贝内参基因以及转基因株系中的CYCD3;1基因与野生型植株的比较来确定外源基因的拷贝数。[结果]该法计算所得外源基因拷贝数与传统高准确性的Southern blot法结果相符。[结论]使用该法检测外源基因拷贝数简单易行,可操作性强。     

实时荧光定量PCR检测犬GAPDH基因

建立犬3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的qPCR检测体系,为犬功能基因mRNA水平的定量分析提供有用的方法学基础。对反应体系进行优化,建立了基于SYBR GreenI染料技术的real-time PCR方法。结果表明,其标准曲线相关系数达到0.999,扩增效率为105.8%,熔解曲线为特异性单峰,组内变异系数（CV%）为0.25-2.8,组间变异系数（CV%）为1.31-2.85。该研究所建立的荧光定量RT-PCR法灵敏、稳定、高效,为犬GAPDH基因作为内参基因用于犬相关基因定量表达分析奠定了基础。     

鹅细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)NS1基因序列设计合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测GPV核酸的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数达到0.998;对初始模板的检出下限为30个拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;与鸭瘟病毒、犬细小病毒、新城疫病毒和鹅副粘病毒均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于2%。用建立的Real-time PCR检测13例GPV感染阳性病例,GPV阳性检出率为100%。表明建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于GPV的病原检测及定量分析。     

跨膜蛋白39A基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价

为建立一种快速检测跨膜蛋白39A(TMEM39A)基因的方法,根据GenBank中登录的不同种属TMEM39A基因序列的保守区域,设计并合成1对荧光定量通用性引物,经过条件优化,建立了检测TMEM39A基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果显示:标准品模板在3.937×10⁸~3.937×10³拷贝·μL^-1范围内呈良好的线性关系,R²可达0.999;该方法特异性较好,检测灵敏度可达3.937×10² 拷贝·μL^-1;组内和组间变异系数均小于1%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法能够检测出不同细胞中的TMEM39A含量,具有种属通用性。该研究方法的建立为临床上提供了一种TMEM39A的快速检测和定量分析技术。     

花生矮化病毒3种PCR检测方法的建立和比较

建立了花生矮化病毒（PSV）普通RT-PCR、SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR检测方法,并比较了它们的检测灵敏度。结果表明,以阳性对照为样品,普通RT-PCR灵敏度达到10-4,SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR的检测灵敏度相当,相对灵敏度均可达到10-6;检测混有PSV的大豆叶片样品,普通RT-PCR灵敏度为10-1,SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR的检测灵敏度为10-5;SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR方法比直接RT-PCR灵敏度高至少100倍,尤其在带毒植物叶片检测中优势更明显,而且灵敏、简便、同时重复性好。     

应用实时荧光PCR检测甜菜霜霉病菌

【目的】建立用于快速检测甜菜霜霉病菌Peronospora farinosa f．sp．betea Byford的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法。【方法】根据已报道的P．farinosa f．sp．Betea Byford及近似种28S rDNA序列同源性比对结果,设计用于检测甜菜霜霉病菌的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测引物。利用所建立的方法对包括P． farinosa f．sp．Betea在内的6种甜菜上的病原菌和5种其他霜霉病菌基因组DNA及12份甜菜种子样品进行检测,验证该方法的检测特异性、灵敏度及实用性。【结果】所建立的检测方法仅对甜菜霜霉病菌得到阳性扩增,其它参照菌株及阴性对照均无荧光信号扩增,准确排除了甜菜上其他5种病菌的干扰,其检测灵敏度显示最低限量为100 fg病菌DNA,应用该方法对不同来源的12份甜菜种子样品进行检测,田间监测结果一致。【结论】所建立的荧光检测方法能够对甜菜霜霉病菌进行快速筛查,为甜菜霜霉病菌的早期诊断和防控提供了一种技术手段。