菊花CmETR2基因的克隆及功能分析

[目的]本文旨在通过克隆菊花中的乙烯受体基因(CmETR2),分析其表达特征并转入拟南芥中对其调控开花的功能进行研究。[方法]以菊花品种‘神马’为试验材料,克隆CmETR2全长序列,与其他物种进行同源性比对分析,利用荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的相对表达量,以及其对外源乙烯处理后的响应变化。将CmETR2超表达转入拟南芥中,观察其对拟南芥开花时间和莲座叶片数的影响,分析转基因拟南芥中开花相关基因的表达量变化。[结果]克隆获得的CmETR2基因开放阅读框(ORF)全长为2 292 bp,编码氨基酸763个。系统进化分析表明,该基因编码的蛋白与向日葵的ETR3(XP_022030036.1)和刺菜蓟的ETR2-like(XP_024986908.1)亲缘关系最近。组织特异性定量表达分析结果表明,CmETR2在菊花营养生长期间茎和叶中表达量最高,生殖生长期间管状花和根中的表达量较高。亚细胞定位结果表明,CmETR2定位在细胞膜上。外源乙烯处理后3 h CmETR2基因表达量最高。CmETR2超表达植株的开花时间比野生型拟南芥晚3～4 d,开花时莲座叶片数比野生型拟南芥多3片左右。CmETR2超表达植株对乙烯的敏感性增强并表现出更明显的三重反应。在CmETR2超表达植株中,促进开花的基因AtGI、AtSPL3和AtFD在CmETR2超表达植株中的表达量较野生型下降,抑制开花的基因AtFLC和AtTFL在CmETR2超表达植株的表达量上调。[结论]本研究克隆得到菊花CmETR2基因具有延迟拟南芥开花的功能。     

棉籽大小与形状关联标记发掘及候选基因筛选

棉籽在油脂、饲料加工等领域具有重要用途,且影响纤维产量和品质。为发掘棉籽性状遗传位点与候选基因,利用419份具有丰富遗传变异的棉花品种资源构成的自然群体,在2个年度鉴定其棉籽性状,结合群体重测序SNP基因型进行全基因组关联分析。结果发现,供试群体棉籽长度、宽度、长宽比、面积与周长等性状存在较大遗传变异,变异系数3.91%~9.55%;有7个SNPs在2年同时被检测到与棉籽大小和形状关联,有23个SNPs在1年与3个以上棉籽相关性状关联,其中D11染色体D11∶50561153在2年与粒宽、面积和周长关联,D12染色体D12：56031535在2年与粒长、面积和周长关联;同时,D05染色体在2年检测到4个与籽粒长宽比显著关联SNPs,A07染色体检测到10个与粒长、周长和面积关联SNPs,且单倍型间相关性状差异极显著。进一步分析发现,关联位点附近存在21个候选基因随棉花胚珠发育进程表达量呈现增加趋势,其中Gh_D05G0148编码乙烯调控反应的EBF蛋白（EIN3-binding F-box protein）,该基因在棉花开花后1~35 d的胚珠中优势表达,且以开花后10 d表达量最高;同时,候选基因Gh_D05G0144编码胚珠发育相关YABBY转录因子,该基因在棉花开花后20~35 d的胚珠中表达量较高,推测与棉籽后期发育有关。以上结果为棉籽多性状同步改良提供了选择标记与基因,为实现纤维和棉籽性状同步遗传改良奠定了基础。     

外施赤霉素对‘峰后’葡萄坐果及VvAG基因表达的影响

为探明‘峰后’葡萄在赤霉素(GA3)处理促使葡萄座果率增加原因和VvAG基因在葡萄坐果过程中的作用,在开花前10d用0.02mg/g的GA3和赤霉素合成抑制剂PAC处理葡萄花序并通过石蜡切片观察葡萄早期果实发育结构的变化,通过RT-PCR分析了VvAG基因的表达。结果显示:GA3处理提高了葡萄座果率,PAC处理则降低座果率,而PAC+GA3处理可以恢复葡萄正常坐果。GA3处理在开花后0~10d幼果纵横径大于对照,而PAC处理则小于对照。进一步分析发现,GA3处理后中果皮细胞明显大于对照,而PAC处理则小于对照,说明GA3处理导致开花后0~10d幼果增大的原因是由于细胞分裂和中果皮细胞增大的缘故。VvAG基因的表达呈现出组织特异性,VvAG2在叶片,茎和卷须中均有少量表达,VvAG1和VvAG3则表达量很低,在花和果实中VvAG1和VvAG2有较高的表达,表明这2个基因对于葡萄花发育和坐果是必需的。VvAG3在花和果实中的表达量相对较低,但在GA3处理后表达上调;相反,在PAC处理后,VvAG3表达量下调,表明VvAG3在坐果过程中的表达可能受到赤霉素的调控。     

紫苏PfPDCT基因序列特征及表达分析

采用生物信息学技术和在线分析软件对紫苏PfPDCT基因序列及所编码的蛋白质进行分析,并且利用实时荧光定量PCR技术研究该基因在晋紫苏1号种子发育不同时期的表达特性,旨在探究磷脂酰胆碱甘油二脂转磷酸胆碱酶(PDCT)在植物脂肪酸代谢过程的作用。结果表明,紫苏PfPDCT基因c DNA全长序列为2 098 bp,开放阅读框为1 683 bp,编码560个氨基酸残基。生物信息学分析结果表明,PfPDCT蛋白分子量约为59.315 ku,等电点为9.48,不稳定系数为35.00,推测其为稳定蛋白,与已知赤藓PDCT蛋白高度同源。通过荧光定量PCR分析可知,紫苏PfPDCT基因在不同发育时期的种子中均有表达,其中,在开花后20 d表达量最高,为开花后10 d的1.92倍。研究结果可为进一步阐明紫苏PfPDCT基因的功能及作用机制奠定基础。     

转基因油菜 W-4 fad2基因沉默的种子特异性分析

目的：]研究转基因油菜 W鄄4的种子fad2基因受 RNAi干扰的效果及其器官特异性。[方法]采用实时荧光定量 PCR法分析比较了转基因油菜 W鄄4与非转基因对照 Westar开花后第7、14、21、28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的 fad2基因的相对表达量。[结果]对照 Westsr种子中 fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W鄄4种子中 fad2基因的相对表达量在开花后第21、28 d较对照 westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜 W鄄4在种子发育过程中表达的 fad2基因的 dsRNA干扰了 fad2基因表达。W鄄4与westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示：W鄄4种子中油酸脱饱和指数（ODP）平均为0.07较 Westar的0.24下降了75%;但越冬期根、茎、叶中的油酸脱饱和指数两者无显著差异。研究还发现转基因油菜 fad2基因表达下降的时期与 napin基因表达时期同步,均始于开花后21 d左右。[结论]结果表明转基因油菜中 RNAi干扰 fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。表明目标基因的表达受 napin启动子的准确控制。     

转基因油菜 W-4 fad_2基因沉默的种子特异性分析（英文）

目的]研究转基因油菜W-4的种子fad2基因受RNAi干扰的效果及其器官特异性。[方法]采用实时荧光定量PCR法分析比较了转基因油菜W-4与非转基因对照Westar开花后第7、14、21、28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的fad2基因的相对表达量。[结果]对照Westsr种子中fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W-4种子中fad2基因的相对表达量在开花后第21、28 d较对照westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜W-4在种子发育过程中表达的fad2基因的dsRNA干扰了fad2基因表达。W-4与westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示:W-4种子中油酸脱饱和指数(ODP)平均为0.07较Westar的0.24下降了75%;但越冬期根、茎、叶中的油酸脱饱和指数两者无显著差异。研究还发现转基因油菜fad2基因表达下降的时期与napin基因表达时期同步,均始于开花后21 d左右。[结论]结果表明转基因油菜中RNAi干扰fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。表明目标基因的表达受napin启动子的准确控制。     

利用CRISPR/Cas9技术研究玉米ZmFKF1在开花过程中的作用

[目的]FKF1是多种植物开花途径中发挥重要作用的关键基因.为研究玉米FKF1功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将ZmFKF1进行定点编辑,获得ZmFKF1编辑突变体.同时以此为材料,通过表型分析及关键开花基因的表达量变化分析,明确ZmFKF1在玉米开花途径中的作用,为玉米分子育种及遗传改良提供理论依据.[方...     

银杏GbSAD基因对非生物胁迫的响应及原核表达

以悬浮培养的银杏愈伤组织为材料,采用荧光定量RT-PCR研究了Gb SAD基因在高盐和不同外源激素处理条件下的表达模式。结果表明:外施100μmol·L~(-1)水杨酸(SA)后,Gb SAD表达量发生显著变化;外施100μmol·L~(-1)脱落酸(ABA)、40μmol·L~(-1)乙烯利(ETH)、100μmol·L~(-1)茉莉酸甲酯(Me JA),Gb SAD表达量未呈现显著变化;外施200 mmol·L~(-1)氯化钠(Na Cl),Gb SAD表达量小幅度降低。Gb SAD组织表达分析表明基因在根、茎、叶、雄花和雌花中均有表达,在叶中表达量最高。SAD氨基酸序列同源比对发现,Gb SAD与其他被子植物的序列相似度较高,表明Gb SAD在进化上较保守。将银杏Gb SAD克隆到原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)并诱导表达。结果表明,Gb SAD蛋白在1 mmol·L~(-1)IPTG的诱导下,培养2 h即能实现融合蛋白的高效表达,为进一步纯化目的蛋白及研究其功能奠定了基础。     

授粉方式及时间对铁皮石斛蒴果发育的影响

[目的]充分利用福建省铁皮石斛种质资源进行良种选育和种苗生产。[方法]以现有福建省适种的5个种质(TF、TZ、TA、TY、TD)为试验材料,研究了不同授粉方式及授粉时间对铁皮石斛蒴果发育的影响。[结果]铁皮石斛5个种质自花和同株异花授粉结实率均为0,种质间授粉结实率(87.50%～98.67%)高于种质内异株授粉结实率(62.50%～77.78%);开花后2～3 d授粉,座果率可达100%;授粉5～30 d,蒴果快速增长,授粉60 d蒴果大小基本稳定;不同成熟度蒴果的种子形态不同,授粉150 d左右呈粉尘状的种子最适于无菌播种。[结论]开花后2～3 d采用种质间授粉方式能获得更多蒴果;蒴果的发育呈先快后慢至稳定的趋势;授粉150 d左右蒴果较成熟,可用于无菌播种。     

铝毒胁迫下大豆ALMT和MATE基因的特异性表达

[目的]从转录水平揭示ALMT和MATE基因在大豆耐铝中的作用,为遗传改良获得抗性种质提供依据。[方法]对2个大豆品种进行Al处理,取胁迫后6 h(短期)、2 d(中期)和12 d(长期)的根尖提取RNA,采用qRT-PCR检测耐铝相关基因的时空表达。[结果]以MTP和UBC2为内参时,ALMT基因在铝处理2 d后的BX10中表达量与对照相比变化最大,在BD2中处理12 d后的表达量最大;当使用不同的内参校准时,MATE在同一个品种中的表达量存在差异,且在同一品种处理的3个时间点的变化趋势也不一致。[结论]不同的内参基因进行校准时,基因的表达量不同,使用2个或2个以上的内参基因进行校正能够提高结果的准确性,基因的表达变化为研究植物耐铝机制提供理论基础。     

海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析

[目的]海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析.[方法]利用RT-PCR技术,从海岛棉中克隆CONSTANS(CO)的同源基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析基因的组织表达.[结果]从新海14号花后9d的纤维中克隆得到了一个棉花CO蛋白基因,命名为GbCO.GbCO cDNA的ORF为1 008 bp,编码335个氨基酸.序列分析表明GbCO和GhCO的相似性只有78.2;,棉花CO蛋白同蓖麻RcCO、苹果MaCO等亲缘关系较为接近.qRT-PCR结果表明,GbCO基因在棉花的根、茎、叶、花瓣等组织中均有表达,但在叶片中的表达相对较高.并且CbCO在棉花胚珠及纤维发育的起始和伸长阶段都有表达,在开花前1d和开花后5d的胚珠中表达量很高.GbCO基因的表达受到光周期的调节,在夜间表达量高于白天.[结论]GbCO基因可能在陆地棉的开花发育中起着重要的作用.     

高温胁迫下油菜籽粒成熟期基因差异表达分析

利用数字化基因表达谱技术,对花后不同时期及不同环境温度条件下差异表达基因进行统计分析.将3份 甘蓝型油菜于开花后20d移入到40 ℃高温和低温2个环境,分别处理12d和25d后取角果种子提取RNA,对 花后不同时期及不同环境温度条件下差异表达基因进行统计分析.结果再以低温条件为对照,在高温下花后32d 共检测出968个差异表达基因,其中上调表达基因为501个,下调表达基因为467个;在花后45d检测到1064 个差异表达基因,其中上调表达基因为274个,下调表达基因为790个.结果表明,随着角果成熟,绝大多数基 因的表达量减少,少数表达量显著上升的基因值得关注,它们可能与角果储藏物质的合成和角果成熟有关;在籽 粒充实的高峰期(花后32d),高温胁迫下上调表达的基因较多,其中可能有一部分基因与环境应答有关.本研究 结果与前人的结果在一定程度相似,表明本研究所采用的研究方法是可行的,获得的与环境胁迫相关基因为后 续研究奠定了基础.     

陆地棉脂肪酸去饱和酶基因GhFAD2-1的克隆与表达分析

Δ12-脂肪酸去饱和酶基因FAD2-1是控制种子中单不饱和脂肪酸油酸(C18∶1)向多不饱和脂肪酸亚油酸(C18∶2)转化的关键基因,其表达水平决定植物油的营养价值与氧化稳定性。棉花GhFAD2-1基因的深入研究有利于采用脂肪酸代谢基因工程技术对棉仁中脂肪酸成分进行定向修饰和改造。采用同源克隆技术获得棉花品种新陆早33号的GhFAD2-1基因,该基因编码区全长1 158 bp,共编码385个氨基酸;生物信息学分析结果表明,GhFAD2-1基因序列具有1个典型的FAD2结构域和1个FAD2-N端结构,其氨基酸序列与橄榄、芝麻、花生、油茶等作物的FAD2序列相似性较高,在75%～78%之间。利用qRT-PCR技术分析发现,GhFAD2-1基因的表达量随着棉籽的发育呈先升高后降低的趋势,开花后40 d达到其表达峰值。使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定其脂肪酸组成,结果表明,开花后0～40 d,C18∶1含量/C18∶2含量与GhFAD2-1基因表达量变化趋势相反。     

海岛棉GbHCT基因的表达分析

通过海岛棉基因组数据库和GSDS 2.0在线生物信息学软件,分析GbHCT基因的结构,利用实时荧光定量PCR技术,检测GbHCT基因在海岛棉不同组织和棉纤维不同发育时间的表达量。结果表明,该基因DNA序列长度为1 953bp,开放阅读框长度为1 311bp,编码436个氨基酸,在海岛棉基因组中对应scaffold3453序列,含有1个内含子和2个外显子。GbHCT基因在不同组织和纤维发育不同时期中均有表达,在各个组织中,苞叶和花中表达量最高,在棉纤维不同发育时期开花后5d和25d表达量最强。该基因可能参与棉纤维发育伸长期和次生壁增厚期。为深入研究该基因的功能,构建植物表达载体pEGAD-GbHCT并转入根癌农杆菌,为下一步研究奠定试验基础。     

芝麻不同部位开花结蒴规律及蒴果发育特性研究

为明确芝麻纵向不同部位的开花结蒴规律和蒴果发育特性,以郑芝98N09为研究对象,于芝麻盛花期将其植株纵向划分为下部节位(8节位以下)、中部节位(9～20节位)和上部节位(20节位以上),调查了各部位的开花结蒴特性和蒴果发育情况。结果表明,随着节位的增加,郑芝98N09开花和结蒴数目呈先增加后下降的变化趋势。其中,在第15节位开花数目达最大值,为9.3朵/节;在第12节位结蒴数目达最大值,为4.2个/节位。不同部位结蒴能力比较,中部节位结蒴能力最高,开花结蒴率为45.1%;上部节位次之,为30.1%;下部节位仅为25.0%。中部蒴果的长度、宽度、鲜质量和籽粒的鲜质量、干质量以及果皮干质量均高于下部蒴果和上部蒴果;下、中、上部蒴果平均灌浆速率分别为0.003 5、0.004 4、0.003 0g/(蒴.d),表明在蒴果发育过程中光合物质优先供应中部蒴果。     

肉苁蓉蒴果与种子发育研究

以肉苁蓉蒴果和种子为试验材料,研究了肉苁蓉蒴果和种子的发育.结果表明:1)肉苁蓉从开花到蒴果开裂所需时间为35d.肉苁蓉蒴果和种子颜色在发育过程中经历了白色、褐色和黑色的转变,当肉苁蓉蒴果由褐色变为黑色时即花后30 d左右为肉苁蓉种子的适宜采收期.2)肉苁蓉蒴果长度、宽度、鲜重和干重在花后25 d时均达到最大值,分别为17.48 mm、12.33 mm、1.620 g和0.295 g,并且肉苁蓉蒴果发育可分为体积增大期、内部充实期和成熟期3个时期.3)肉苁蓉种子长度和宽度在花后25 d时达到最大值,分别为1.22和0.77 mm,每蒴果种子鲜重在花后20 d达到最大值,为0.768 g;每蒴果种子干重在花后35d时达到最大值,为0.206 g.4)肉苁蓉种子千粒重和饱满度均在花后35 d达到最大,而＜0.5 mm种子所占比例则在花后35 d时最小,分别为0.0867 g、85.99％和10.23％.种子萌发率在花后30 d达到最大值,为53.3％.     

紫苏脂肪酸去饱和酶基因PfFAD2的生物信息学及表达特性分析

为研究脂肪酸去饱和酶基因FAD2在紫苏脂肪酸合成机制中发挥的重要作用,对紫苏FAD2基因及其编码的蛋白质序列进行了详细的生物信息学分析。结果表明,紫苏FAD2基因cDNA全长序列为1 545 bp,ORF为1 149 bp,共编码382个氨基酸残基;紫苏FAD2蛋白属于亲水性蛋白,具有6个典型的跨膜螺旋区,含有PLN02505保守结构域,属于Membrane-FADS-like超蛋白家族;系统进化树分析结果表明,紫苏与芡欧鼠尾草的亲缘关系较近,与红花较远。利用荧光定量PCR技术分析紫苏不同组织以及不同发育时期的种子中FAD2基因的表达特性,结果表明,紫苏FAD2在开花后20 d的种子中表达量最高。研究结果可为进一步阐明紫苏脂肪酸代谢机制奠定理论基础。     

大豆GmSg-5基因的克隆、序列分析及表达分析

[目的]GmSg-5是大豆A类皂苷合成途径的关键酶基因。对大豆GmSg-5基因进行克隆、生物信息学分析及基因表达模式分析,为今后深入研究A类大豆皂苷的合成及大豆品质改良提供参考。[方法]以晋遗30为试验材料,采用ExPASy-Protparam等软件对GmSg-5基因和蛋白质序列进行生物信息学分析,利用PlantCARE对GmSg-5基因启动子序列进行分析,qRT-PCR方法分析GmSg-5基因在根、茎、叶不同组织、籽粒不同发育时期、激素及非生物胁迫诱导的表达情况。[结果]GmSg-5基因CDS全长1 536 bp,编码511个氨基酸,编码蛋白主要由HEME和CPR两个结构域构成,相对分子量为58.6 kD,等电点(pI)为8.95。qRT-PCR分析表明,GmSg-5基因在根中表达量最高;开花后50 d籽粒中GmSg-5基因表达量最高。MJ、ABA诱导根中GmSg-5基因的表达,抑制叶中该基因的表达,H2O2、PEG和NaCl胁迫诱导根和叶中GmSg-5基因的表达。[结论]大豆GmSg-5基因参与多种非生物胁迫应答,在大豆响应和抵制非生物胁迫及激素诱导过程中发挥重要的作用。     

花生油酸脱氢酶基因AhFAD2A和AhFAD2B的时空表达特征

花生Arachis hypogaea油酸脱氢酶AhFAD2是调控花生种子中油酸与亚油酸比值（oleic acid/linoleic acid,O/L）的关键酶,已确定存在2个编码AhFAD2的基因:AhFAD2A和AhFAD2B,但两者在花生中的时空表达特征尚不清楚。选取2个有代表性O/L的花生品种‘山花15’‘Shanhua 15’（O/L为1）和高油酸花生突变体（O/L大于20）为材料,根据AhFAD2A和AhFAD2B基因3'-UTR核苷酸序列的差异,设计了新型、简便的区分两者的特异性引物,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术,对2个花生品种的7个不同组织（根,茎,叶,花,开花后20,40,60 d种子）中AhFAD2A和AhFAD2B的表达特征进行了分析。结果表明:AhFAD2A和AhFAD2B在‘山花15’和高油酸花生突变体7个组织中都有表达;其中,在2个花生品种3个不同发育时期的种子中,AhFAD2A和AhFAD2B在开花后40 d的种子中表达量最高,推测在开花至花后40 d这一阶段种子中FAD2的表达量可能对花生最终O/L起主要的调控作用。另外,‘山花15’种子中AhFAD2B的表达量显著高于AhFAD2A,而在高油酸花生突变体种子中则相反,推测花生中AhFAD2B在催化油酸去饱和生成亚油酸的过程中比AhFAD2A可能起更重要的调控作用。     

金钗石斛开花及座果习性研究

对金钗石斛的花和蒴果的生长习性进行观察研究,以了解金钗石斛开花及座果习性,掌握其人工授粉技术。结果表明:金钗石斛1月抽新芽,长新根,2月上旬从一年生茎节抽花芽,10~15 d后现蕾,10~15 d后开花;始花期3月上旬,盛花期3月中旬至4月中旬,末花期4月下旬;单花寿命8~10 d,鲜花瓶插寿命7~9 d,畸花率1%,开花期整齐。授粉后,花柄保持绿色,第2~3天花瓣开始皱缩。若授粉失败,4~5 d后花瓣萎蔫,子房变黄,7 d后花柄脱落;若授粉成功,7天后花柄不脱落,子房变绿膨大,15 d以后形成蒴果,并迅速膨大。90 d以后根据植株生长情况及时疏果,一般每株保留5~6个蒴果。10~11月种子成熟,可以采收,12月以后蒴果开裂,失去利用价值。得出结论:人工授粉处理极显著优于不授粉;同株自花授粉、同株异花授粉和异株异花授粉处理间差异不显著;开花1~3 d内进行人工授粉效果最好,开花第4天授粉坐果率大幅下降,开花5 d以后,花粉粒失去活性,不宜进行人工授粉。