苹果MdLsi1基因的克隆及生物信息学分析

以"秦冠"苹果叶片为试材,采用RT-PCR技术,克隆了苹果硅转运蛋白基因MdLsi1,并应用生物信息学分析其特征,以期为进一步深入研究硅促进苹果植株生长的分子机制提供参考依据。结果表明:MdLsi1基因全长873 bp,编码290个氨基酸,相对分子量为30.456 kDa。MdLsi1蛋白包含已知硅转运蛋白所具有的特征结构,6个跨膜结构域,2个天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸序列(Asn-Pro-Ala,NPA模体),1个由甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-精氨酸(GRGS)组成的ar/R选择性过滤器,并且2个NPA模体之间间隔108个氨基酸。MdLsi1基因起始编码位点前1 500 bp序列中除了包含有基本的基因启动子元件外,还含有与多种逆境胁迫相关的顺式调控元件。以上结果提示MdLsi1在苹果植株硅的积累及植株抵御逆境胁迫中发挥重要功能。     

苹果锚蛋白基因ANK家族生物信息学鉴定分析

 利用生物信息学方法对苹果ANK基因家族成员及分类鉴定,同时对其染色体定位、系统进化关系及芯片表达特性进行了分析。苹果MdANK家族包含351个基因,根据蛋白结构域差异分为16个类别,ANK-M类型最为庞大,有143个ANK蛋白;苹果的17条染色体均有ANK家族基因分布,其中第2条染色体上分布最多,有36个ANK基因。MdANK编码的蛋白在72 ~ 2 429个氨基酸范围内,等电点在4.30 ~ 11.13之间。芯片分析发现,在苹果果实成熟时期及砧木接穗互作过程中,多数MdANK基因的表达都有不同程度变化。     

苹果MdGLRs家族基因生物信息学鉴定和表达分析

 利用生物信息学策略对苹果MdGLRs家族基因编码蛋白的氨基酸序列的基本特征、二级结构、跨膜区域、亲疏水性、基因亚细胞定位及保守结构域进行了预测和分析,与拟南芥AtGLRs家族的20个基因进行了氨基酸序列比对和进化树分析,并对这些基因在不同营养生长器官中进行了表达分析。结果表明,苹果MdGLRs家族包含32个基因,分为3个亚族,大部分基因编码800个氨基酸以上,多含有3个跨膜区域,二级结构主要以α–螺旋、无规则卷曲、折叠延伸链为主;亚细胞定位预测发现,MdGLRs蛋白主要定位在内质网和质膜上;MdGLRs蛋白的保守结构域是S1-M1-M2-M3-S2-M4;大多数基因在根、茎、叶中普遍都有表达,在叶中的表达量最高。     

苹果乙烯信号转导相关基因MdEIL1的克隆及功能鉴定

以苹果‘嘎拉’（Malus × domestic‘Royal Gala’）为试材,分离了乙烯信号转导相关的MdEIL1基因（基因序列号：MDP0000423881）。序列分析表明,该基因包含长为1 980 bp完整的开放阅读框,编码658个氨基酸的蛋白。进化树分析表明MdEIL1属于EIN3/EIL转录因子家族蛋白。定量分析显示,MdEIL1基因在苹果的根、茎、叶、花和果实中有不同程度的表达,而且它的表达也受到乙烯、生长素和细胞分裂素的诱导。通过原核表达试验体外诱导MdEIL1蛋白成功,为后续蛋白功能鉴定奠定了基础。MdEIL1基因在拟南芥中异位表达,增强其乙烯响应,在暗处表现为下胚轴变短,并且AtERF1的表达量上升,显示转基因植株对乙烯的敏感性提高。     

苹果MdNAC9的克隆及其调控黄酮醇合成功能的鉴定

为了探究红肉苹果黄酮醇合成机理,分析通路相关基因,从成熟期红肉苹果中克隆了1个NAC转录因子基因Md NAC9。通过Real-TimePCR、酵母单杂交和荧光素酶报告试验,探究Md NAC9与苹果黄酮醇积累的相关性。结果表明,在苹果果实和过表达Md NAC9的愈伤组织(OENAC9)中Md NAC9表达量变化与黄酮醇合成相关基因Md FLS表达量变化趋势一致。酵母单杂交试验证明,Md NAC9具有转录激活功能,能够特异结合Md FLS基因启动子。荧光素酶报告试验显示,Md NAC9对Md FLS的启动子有激活作用,促进Md FLS的表达。Md NAC9可能通过激活Md FLS促进苹果黄酮醇积累。     

苹果MdMYB2基因的克隆及功能鉴定

以‘嘎拉’苹果为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了苹果基因MdMYB2(基因序列号:MDP0000823458)。MdMYB2的开放阅读框(ORF)长度为873 bp,编码含有290个氨基酸的蛋白,预测其蛋白质分子量为32.92 kD,等电点为4.91。系统进化树分析显示,苹果MYB2与梨MYBL2亲缘关系最近,同源性最高。组织表达分析表明,MdMYB2在苹果的各个组织均有表达,在茎和果实中表达相对较高。MdMYB2的表达明显受盐胁迫的诱导。构建了MdMYB2的表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化得到了转基因苹果愈伤和转基因拟南芥植株。抗性试验表明,过量表达MdMYB2明显提高了转基因苹果愈伤对盐胁迫的抗性。此外,异位表达MdMYB2也能提高拟南芥对盐胁迫的抗性,以上试验结果表明MdMYB2在植物盐胁迫响应中发挥重要作用。     

郁金香花青素合成酶基因TgANS的克隆与功能鉴定

以红色的郁金香品种‘纯火’为材料,采用高效液相色谱技术对其4个花期的花青素苷含量进行了测定,结果表明,随着花朵的发育,花青素苷的含量逐渐升高,在盛开期含量最高,达3 002.75μg·g-1 FW。从花中克隆出结构基因Tg ANS,GenBank登录号为MZ442383,开放阅读框长1 071 bp,编码356个氨基酸,TgANS基因表达水平在不同花期存在显著差异,随着花发育逐渐升高,表达趋势与花青素苷的积累趋势基本一致。将Tg ANS导入烟草进行异源表达,转基因株系花色明显变红,Tg ANS表达量显著增加,花青素苷含量增加,进一步对这些株系内源的NtCHS、NtCHI、NtFLS、NtF3H、NtF3’H和NtDFR表达进行分析,NtF3H、NtF3’H和NtDFR表达量显著上升,NtCHS和NtCHI表达量下降。表明郁金香Tg ANS参与了花青素苷的合成。     

抗苹果斑点落叶病基因Mal d 1的克隆及功能鉴定

以苹果叶片总RNA为模板,通过克隆获得抗苹果斑点落叶病基因Mal d 1。Mal d 1开放阅读框长度为480 bp,编码159个氨基酸残基,包含2个外显子和1个内含子。蛋白结构分析显示,Mal d 1蛋白包含bet v 1-like结构域。荧光定量PCR分析结果表明,Mal d 1在苹果叶、花、果皮、果肉中均有表达,但各器官中表达水平存在差异;在不同发育时期的果皮中都有表达,表达水平随时间呈现先上升后下降的趋势;在抗性品种叶片中表达水平较高;在叶片人工接种病菌条件下表达量随时间的延长明显高于对照组。利用PRI101-AN载体和农杆菌介导的遗传转化方法转化苹果愈伤组织,转基因愈伤组织的抗病鉴定结果显示,Mal d 1过量表达增强愈伤组织对苹果斑点落叶病的抗性。     

甜菜蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及序列分析

甜菜蔗糖磷酸合成酶（Beta vulgaris sucrose phosphate synthase,BvSPS）是甜菜体内控制蔗糖合成的关键酶之一。根据Genbank上的BvSPS序列（Genbank accession no.X X81975）,利用RT-PCR方法,从甜菜体内扩增获得了BvSPS基因的cDNA全长,并将其连接到pMD 18-T载体上。通过利用PstI、XbaI和EcoRI对重组质粒pMD 18-T-BvSPS进行酶切鉴定,进一步确定了重组质粒的正确性。利用生物信息学软件分析结果表明,该基因cDNA全长为3138bp,编码1045个氨基酸,蛋白质分子量为118.18kDa,等电点为6.15,该蛋白被预测定位于细胞核内。     

芋淀粉合成酶AGPase基因的克隆及表达分析

通过对‘靖江香沙芋’转录组数据进行功能注释,克隆获得‘靖江香沙芋’淀粉合成酶AGPase的基因,序列全长为1 596 bp,命名为CeApS1（NCBI：Colocasia KU288757,未公布）。该基因编码532个氨基酸,蛋白含有1个NTP_transf_3结构域（Gly¹⁰⁴ ~ Pro³⁰⁶）和1个PbH1结构域（Gly⁴⁷³ ~ Ser⁵¹⁵）,编码产生AGPase小亚基,等电点和分子量分别为6.73和57.6 kD。ApS1在单子叶和双子叶植物中广泛存在,CeApS1与紫萍（AIZ00992.1）中相应蛋白的亲缘关系最近,相似性为83.4%,与草莓（AAS00541.1）、苜蓿（XP_003617925.1）、水稻（AAK27313.1）和小麦（CAA46879.1）等植物中相应蛋白的亲缘关系较远。CeApS1在‘靖江香沙芋’的母芋和子孙芋中表达量较高,在叶片、叶柄和根中低表达。芋球茎中的CeApS1表达水平与球茎发育密切相关,在播种160 d后达到最大值。该基因的表达模式与球茎淀粉含量的积累显著正相关。     

“云红梨1号”HY5基因的克隆及生物信息学分析

以云红梨1号的外果皮为试材,采用PCR技术,克隆出云红梨1号HY5基因cDNA的序列,进行生物信息学分析,研究了HY5基因的长度、编码、分子量、蛋白结构,并对HY5基因编码蛋白同源性进行了比较,以期为进一步对云红梨1号HY5基因功能和依光型花青素合成的机理研究奠定基础。结果表明:云红梨1号HY5基因全长为495 bp,编码164个氨基酸,其分子量为17.90 kD,为亲水蛋白,具有bZIP结构域;与苹果HY5基因具有高度的同源性,编码蛋白相似性为93%,表明其具有相类似或相同的功能。     

苹果MdCBL3基因的克隆与功能鉴定

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆MdCBL3(序列号:MDP0000155124),长852 bp。系统进化树分析表明,苹果MdCBL3与白梨亲缘关系最近。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件预测分析,MdCBL3启动子序列中存在干旱、低温、光、生长素、防御等响应元件。构建MdCBL3表达载体并利用农杆菌介导法侵染苹果愈伤组织和拟南芥。半定量RT-PCR证明MdCBL3在转基因愈伤组织中过量表达,在拟南芥中得到异源表达。表型分析发现,在盐胁迫中,与野生型相比,转基因愈伤组织和拟南芥成龄苗生长更好,盐胁迫的抗性更强。在拟南芥中异源表达MdCBL3,能提高拟南芥对干旱和低温的抗性。     

苹果MdGA20ox1 基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

 以苹果砧木SH40[（Malus × domestica）× M. honanensis]为试材,采用RT-PCR 结合RACE 技术从SH40 茎尖中克隆得到一个赤霉素合成关键酶基因（GA20–氧化酶基因）,命名为MdGA20ox1, 其cDNA 全长1 579 bp,编码392 个氨基酸。该基因在GenBank 登录号为KC493633。氨基酸序列同源性 分析表明：MdGA20ox1 与玉米、拟南芥、梨等植物GA20ox 具有55.9% ~ 96.7%的相似性。洋葱表皮细 胞瞬时表达显示,MdGA20ox1 蛋白定位于细胞核与细胞质膜。植株生长量测定和相对定量表达结果表明, MdGA20ox1 基因在砧木SH28、SH40 和M26 自根苗的表达呈先下降再上升然后下降的趋势,这与其生长 动态基本一致。嘎啦/SH28 的植株生长量和MdGA20ox1 表达量最高,嘎啦/M26 次之,嘎啦/SH40 最低, 初步表明该基因的表达有与苹果植株矮化程度呈负相关的趋势。MdGA20ox1 在嘎啦/SH40 和嘎啦/SH28 不同组织中的表达模式一致,且半矮化类型砧木SH28 嫁接‘嘎啦’,其茎尖、幼叶、成熟叶和枝皮中的 表达量均高于矮化类型SH40 嫁接‘嘎啦’。     

白姜花倍半萜合成酶基因的克隆及表达

以白姜花的叶片为材料,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,克隆到一个倍半萜合成酶基因的cDNA序列,其全长为1 932 bp,基因编码区共1 653 bp,编码551个氨基酸,命名为Hc-Sesqui。该基因编码蛋白的氨基酸序列与姜和玉米中的倍半萜合成酶有较高的同源性,并且含有DDXXD保守序列。通过Clustal.X进行序列分析,确定该基因属于植物萜类合成酶基因家族中的Tps-a亚族。Northern杂交的结果表明,该基因在茎、叶和萼片中均有表达。     

苹果NBS-LRR1 基因的鉴定与表达分析

 NBS-LRR 蛋白是植物细胞内普遍存在的主要抗性蛋白家族,该家族的蛋白包含有NBS 结构域和LRR 结构基序,在植物抵御各种病原物的侵袭中发挥重要作用。从‘嘎啦’苹果中鉴定了一个NBS-LRR 类基因,命名为MdNBS-LRR1,（GenBank 登录号：JX126858）。该基因全长为3 116 bp,包含一个2 826 bp 的开放读码框,编码包含941 个氨基酸残基的蛋白质;其氨基酸序列含有典型的NBS-LRR类抗病基因所具有的NB-ARC 结构域。Blast 分析发现MdNBS-LRR1 与大豆NBS-LRR 类抗性蛋白具有较高的氨基酸序列一致性（60%）。RT-PCR 分析结果表明,MdNBS-LRR1 在‘嘎啦’苹果的幼叶、茎、功能叶、芽、皮和花等组织中均有表达,在幼叶中的表达量最高,茎中最低。苹果轮纹病病原菌侵染可促进MdNBS-LRR1 基因表达上调,接种后24 d 表达量最高,是对照的10.6 倍左右,另外,在‘嘎啦’苹果幼苗叶片中,SA、MeJA 和ACC 均可诱导该基因的表达,表明MdNBS-LRR1 基因的表达受到与抗病相关信号转导途径的调控。     

木薯可溶性淀粉合成酶基因SSII克隆及生物学分析

以木薯品种SC124为试材,采用RT-PCR的方法,克隆了木薯可溶性淀粉合成酶基因SSII的全长,并对其进行生物学分析。结果表明:克隆的基因全长包含完整的开放阅读框2 256bp,编码751个氨基酸,通过核苷酸序列同源性分析,该cDNA与基因库中登录的木薯SSII(登录号为:EF667961.1)序列同源性达到99%,但与其它植物的同源性较低,为77%~84%。对木薯SSII多态性分析可知,在木薯基因组内存在等位基因及旁系同源基因。     

扁桃SFB基因的克隆及其生物信息学分析

以新疆扁桃栽培品种麻壳的花药为材料,利用RT-PCR和RACE技术,克隆到了一个全长为1131bp的SFB基因(Genbank登录号为:EU909685),命名为AcSFB10。该基因编码376个氨基酸,在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F-box基序。经生物信息学分析,推测AcSFB10蛋白的分子式为C2000H3033N517O558S23,相对分子质量为43985.5,等电点为6.02,二级结构以α螺旋为主;理论推导半衰期大约为30h,不稳定参数为53.21,属于不稳定蛋白;并且推测此蛋白为亲水性、非分泌型蛋白,在基质内起裂合酶的作用,特异性的识别底物,正好吻合了F-box蛋白的作用。     

哈密瓜ACC合成酶基因cDNA的克隆及全序列分析

 以新疆哈密瓜(Cucumis melo L. ) 幼叶为材料, 根据已报道的甜瓜ACC合成酶3(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase, ACS) 基因片段设计特异引物, 采用RT-PCR和RACE (Rapid Amplification cDNA Ends, cDNA末端快速扩增) 等技术, 克隆得到编码哈密瓜CM e2ACS3基因的全长cDNA 序列,长1 895 bp, 编码482个氨基酸, 分子量约为54.12 kD, 等电点8.45, GenBank登录号为FJ383171。利用软件MEGA4构建进化树, 发现哈密瓜ACS3基因与黄瓜中的同类基因亲缘关系最近。哈密瓜CMe-ACS3基因的克隆及序列分析为认识此基因在甜瓜中的功能研究奠定基础。     

雏菊rbcL基因的克隆及其生物信息学分析

以雏菊为试验材料,采用PCR方法扩增雏菊rbcL基因并测序,并用DNAstar、PAML等生物软件对该基因进行生物信息学及其适应性进化研究。结果表明:雏菊rbcL基因序列全长1 508bp,编码区全长1 458bp,共编码485个氨基酸,与基因库中菊科其它属植物比较,核苷酸和氨基酸序列的同源性均超过了96%。rbcL蛋白二级结构主要有20个α螺旋、17个β折叠、33个转角以及一些无规则卷曲,适应性进化检测发现共有3个正选择氨基酸位点(94E,149Q,309M)。获得完整雏菊rbcL基因有助于更深地研究雏菊对其生境的适应,rbcL蛋白大亚基正选择位点的空间结构对于维持核酮糖结构具有重要的作用。     

马蔺DFR基因的克隆及生物信息学特征分析

以马蔺花瓣为试材,通过转录组测序,应用PCR技术克隆马蔺花青素生物合成关键酶二羟黄酮醇-4-还原酶(dihydvroflavonol-4-reductase,DFR)基因并获得其生物信息学特征。结果表明:马蔺DFR基因全长1 427bp,共编码357个氨基酸(该基因命名为IlDFR,GenBank登录号为KY907171)。该基因在氨基酸水平上与多种植物的DFR具有较高的同源性,在系统进化上与同属的荷兰鸢尾(Iris hollandica)的DFR亲缘关系较近;预测其蛋白质相对分子质量为39.99kDa,等电点为5.89,主要由α-螺旋和β-折叠构成,定位于细胞质,属于酸性亲水不含信号肽的不稳定类蛋白质。马蔺IlDFR有一段氨基酸序列‘VTGASGYVGSWLVMKLLRDGY’与大部分物种的DFR特有相对保守的NADPH结合域非常相似,只有4个氨基酸残基有所差异。