猪繁殖与呼吸综合征病毒相关猪microRNA的初步筛选

本试验旨在初步筛选出与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染相关的猪microRNA(miRNA)。采用生物信息学方法预测可能与PRRSV 3′非编码区(3′utr)产生相互作用的猪miRNA,构建PRRSV 3′utr的双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK-utr,同时合成预测到的miRNA(ssc-miR-323、ssc-miR-105-1)及其相应的抑制物,共转染猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVEC),检测双荧光素酶活性。结果发现,ssc-miR-323与psiCHECK-utr共转染后,荧光比率略有升高,ssc-miR-105-1与psiCHECK-utr共转染后,荧光比率降低。初步判定ssc-miR-323对PRRSV 3′utr没有抑制作用,而ssc-miR-105-1对PRRSV3′utr有一定的抑制作用。     

KLF3基因3′-UTR区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定

试验旨在构建锌指蛋白3(KLF3)基因3′-UTR区双荧光素酶基因报告载体及其突变载体,初步分析可能调控KLF3基因表达的miRNAs。首先通过PCR方法扩增KLF3基因的3′-UTR序列,将其克隆到经XhoⅠ、NotⅠ双酶切的双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与KLF3基因3′-UTR相互作用的miRNA;使用脂质体2000转染试剂将miRNAs mimics与构建好的KLF3基因3′-UTR段双荧光素酶报告载体或突变载体共转染于常规培养的293T细胞中,检测荧光素酶活性。结果表明,KLF3基因3′-UTR可能是miR-21的作用靶位点;双荧光报告显示,miR-21 mimics组(0.6900±0.0144)比突变组(1.000±0.0688)和空白对照组(1.000±0.0159)KLF3基因3′-UTR双荧光素酶基因报告载体和突变载体的活性降低了31%(P0.01)。本试验成功构建了含有KLF3基因3′-UTR段双荧光素酶基因报告载体与突变载体,初步证实miR-21对KLF3基因有调控作用。     

猪miR-199a-3p对mTOR基因表达的调控

通过生物信息学预测miR-199a-3p与mTOR-3′UTR的结合位点,人工合成猪mTOR-3′UTR及突变型片段克隆至双荧光素酶载体上,构建野生型(psiCHECK-2-W-mTOR-3′-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-mTOR-3′-UTR)双荧光素酶报告质粒。给PK-15细胞分别转染miR-199a-3p mimics、negative control和mTOR-3′-UTR野生型/突变型双荧光素酶报告载体,用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,分别采用RT-qPCR和Western blot检测mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含mTOR-3′-UTR的野生型和突变型双荧光素酶报告质粒与miR-199a-3p mimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P0.05);转染miR-199a-3p mimics能显著下调mTOR基因mRNA和蛋白的表达(P0.05),而转染miR-199a-3p Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,mTOR基因蛋白表达差异不显著(P0.05)。成功构建了猪野生型及突变型mTOR-3′-UTR双荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶试验、RT-qPCR及Western blot证实miR-199a-3p与猪mTOR-3′-UTR存在靶向调控关系。     

靶向猪ATGL基因的miRNA预测及鉴定

本试验旨在初步筛选出调控猪脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL)的miRNA。利用生物信息学分析预测10条靶向ATGL基因的猪miRNAs,然后通过装载含猪ATGL基因3′UTR序列来构建pMIR-Luc报告基因载体,以及通过装载含反向miRNA种子区对应的3′UTR序列来构建3个突变载体作为阴性对照,以pRL-TK载体作为内参,与候选miRNA模拟物共转染HEK 293T细胞,最终利用双荧光素酶报告基因法来检测荧光素酶活性。试验成功构建了含猪ATGL基因3′UTR序列的重组载体pMIR-ATGL-3′UTR,双荧光素酶报告基因试验显示sscmiR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下调293T细胞中pMIR-ATGL-3′UTR的荧光素酶活性,而点突变试验证实了ssc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p能通过与猪ATGL基因3′UTR上预测的种子区结合下调荧光素酶活性。结果表明,sc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p通过靶向结合3′UTR对猪ATGL基因有下调作用。     

山羊DCT基因启动子活性区及其转录因子调控探究

旨在探究山羊DCT基因启动子活性区及相关转录因子对该基因的调控作用,为山羊DCT基因的表达调控提供理论依据。通过对山羊DCT基因5′侧翼区序列及第一外显子区序列进行生物信息学分析,并与人和小鼠DCT基因启动子序列进行比对,同时结合在线启动子预测结果,采用快速克隆的方法构建5个5′系列缺失序列的启动子报告基因载体,以此为基础构建3′缺失序列的6个报告基因载体,并构建SOX10、MITF和OTX2转录因子结合位点点突变的6个报告基因载体,以瞬时转染的方法转染A375细胞,双荧光素酶检测试剂盒检测缺失片段和点突变片段的启动子活性。结果表明,成功构建了山羊DCT基因11个不同长度的启动子报告基因载体,-990~+232bp的P3片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01),基于P3构建的3′系列缺失片段中-881~-154bp的P8片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01)。转录因子SOX10结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著降低(P0.01),MITF和OTX2结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著增强(P0.01)。山羊DCT基因启动子核心调控区位于-881~-154bp区域,转录因子SOX10对山羊DCT基因发挥正调控作用,而转录因子MITF和OTX2对山羊DCT基因的调控作用尚需深入研究。     

牛bta-miR-26b靶基因EphA2的鉴定

利用miRNA靶基因预测数据库TargetScan,RNA22对bta-miR-26b的靶基因进行预测,并鉴定bta-miR-26b的靶基因。生物信息学分析结果显示,在EphA2基因3′非编码区域（3′-UTR）有bta-miR-26b的保守结合种子序列。扩增含有bta-miR-26b结合位点的靶基因的3′-UTR区,插入双荧光素酶报告载体pmirGLo Dual-LuciferasemiRNA Target Expression vector,与bta-miR-26bmimics共转染Hela细胞后检测荧光素酶的活性变化。通过荧光素酶活性检测证明在体外bta-miR-26b可以与EphA2基因结合,证明EphA2可能为bta-miR-26b的一个靶基因。     

牛GHR基因与miR-139靶向关系的验证

旨在构建牛生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)基因3′非翻译区(Untranslated region,UTR)双荧光素酶载体,并确定miR-139与牛GHR基因的靶向关系。本研究采用生物信息学方法预测miR-139与牛GHR基因3′UTR的结合位点;人工合成牛GHR基因3′UTR及突变型片段并克隆至双荧光素酶载体psiCHECK-2上,构建野生型(psiCHECK2-GHR-W 3′UTR)及突变型(psiCHECK2-GHR-M 3′UTR)双荧光素酶报告质粒。将培养的Hela细胞分为4组,分别共转染miR-139mimic或阴性对照和psiCHECK2-GHR-W 3′UTR重组质粒或psiCHECK2-GHR-M 3′UTR重组质粒,然后用双荧光素酶检测试剂盒检测4组细胞中荧光素酶活性。之后培养奶牛乳腺上皮细胞,分别设对照组、阴性对照组、miR-139 mimic及miR-139inhibitor组,对阴性对照组、miR-139mimic组及miR-139inhibitor组分别转染阴性对照、miR-139mimic或miR-139inhibitor,利用qPCR(Realtime quantitative PCR)进一步检测各组miR-139及GHR基因的mRNA表达。结果,通过双酶切试验证实成功构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和psiCHECK2-GHR-M 3′UTR;当野生型重组质粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和miR-139mimic共转染Hela细胞后,双荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其他处理组(P0.05)。qPCR进一步证实miR-139能显著下调奶牛乳腺上皮细胞中GHR基因mRNA的表达(P0.05)。本研究成功构建了牛野生型及突变型GHR基因3′UTR双荧光素酶报告质粒;双荧光素酶试验及qPCR证实miR-139与牛GHR基因3′UTR存在靶向关系。     

鸭CD8α基因启动子区的克隆及荧光素酶报告基因重组体的构建

旨在了解分化群α基因可能的调控序列及其转录调控机制。本研究利用基因组步移技术扩增鸭CD8α基因的启动子区序列,使用在线软件进行序列分析;分别将鸭肝炎易感组和抗性组的CD8α基因启动子区定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic中,利用酶切与测序技术进行鉴定;并瞬时转染细胞,采用荧光素酶报告基因系统检测启动子载体的活性。结果,扩增出一条长度为2 480bp的片段(包含第一外显子56bp,启动子区2 424bp)。经序列分析,鸭CD8α基因启动子区具有典型的TATA-box、GC-box和CAAT-box,其转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-406bp处,且发现了CdxA、Nkx-2、GATA-1、SRY等41个潜在转录因子结合位点。经酶切与测序鉴定,成功构建了鸭CD8α基因荧光素酶报告基因重组体。荧光素酶报告基因检测系统显示,构建的鸭肝炎易感组和抗性组的报告基因启动子载体具有相当的活性。研究结果为进一步探讨CD8α基因的转录调控奠定了基础。     

miR-R-203在鸡成肌细胞中靶向抑制EIFEIF4E基因表达的研究

为了进一步研究和探索mi R-203在鸡骨骼肌发育中的作用,本研究通过对mi R-203进行靶标预测,发现真核起始因子4E(EIF4E)基因的3′UTR区存在mi R-203的潜在靶标位点。通过构建连接有EIF4E 3′UTR和靶位点突变的EIF4E 3′UTR-MUT的双荧光素酶靶标验证载体,将其分别转染到已过表达mi R-203或阴性对照鸡的DF-1细胞中,检测其中的荧光素酶活性。结果显示,mi R-203能显著抑制EIF4E 3′UTR载体的荧光素酶活性,但不影响EIF4E 3′UTR-MUT载体的荧光素酶活性,mi R-203能靶向调控鸡EIF4E的表达,研究结果为深入分析miR-203在鸡骨骼肌中的功能和作用机制奠定基础。     

猪附红细胞体病

猪附红细胞体病是由立克次氏体引起猪牛羊貂等动物的一种热性、溶血性疾病。表现为发热、贫血、黄疸、消化和呼吸功能障碍。仔猪患病后死亡率极高,常给养猪业生产造成重大损失,是近年来新发现的一种人畜共患病。1流行病学猪附红细胞病多由折光性较强的小附红细胞体引起发病,对由无折光性的大附红细胞体引起发病的较为少见。该病可经子宫、胎盘垂直传播,也可由虱、蚤、螨等吸血昆虫和被污染的注射器具(如针头等)水平传播。一年四季均可发生,以春季多发,气候突变,饲养不良,长途运输,患其它疫病,导致体质下降等原因,是本病诱因。该病侵害初生仔…     

猪流感

猪流感病毒是目前最常见的猪呼吸道病致病因子之一。常由于与其它病原的混合感染而给猪场造成一定的损失，并且该病毒易发生变异，对人和其它动物健康有深刻的影响。 １ 病原 猪流感病毒为单股负链ＲＮＡ病毒，属正粘病毒科流感病毒属Ａ型流感病毒。病毒粒子多数呈球形，直径约为 ８０－１２０纳米。该病毒在初分离时，时常呈长短不一的丝状体。在体外培养传代后变成球形。该病毒有囊膜。囊膜上有糖蛋白纤突，呈棒状者为血凝素（ＨＡ）．呈蘑菇状者为神经氨酸酶（ＮＡ）。ＨＡ含有中和抗体所作用的主要表位，能与细胞表面的唾液酸受体结合，…     

猪流行性感冒

猪流感（Swine infl uenza,SI）是由猪流感病毒（Swine infl uenza virus,SIV）引起的一种猪的高度接触性、急性的具有传染性的群发性猪呼吸道疾病,该病毒属于正黏病毒科A型流感病毒属。该病的主要特征为突然发病、呼吸困难、咳嗽、发烧、疲劳倦怠及传播迅速、康复快、死亡率低。由于传播速度快、发病急,如果在一个发病初期治疗不及时,容易继发支气管炎、肺炎、胸膜炎、副猪嗜血杆菌感染等疾病,导致猪的死淘率增高,给养猪场户造成比较大的经济损失。文章将根据猪流感病毒的相关知识,从其病原学、临床症状等方面做出综述,并针对其特点讨论治疗及防控方法。     

猪布氏杆菌病的血清学调查

采取试管凝集的方法对西宁市某种猪场的741头种猪进行了猪布氏杆菌病的血清学调查。结果表明：该猪场布氏杆菌病的试管凝集反应的阳性率为0．54％。     

猪布氏杆菌病的血清学调查

采取试管凝集的方法对西宁市某种猪场的741头种猪进行了猪布氏杆菌病的血清学调查.结果表明该猪场布氏杆菌病的试管凝集反应的阳性率为0.54%.