Lyz-GFP双元基因在苜蓿愈伤组织中的转化

利用农杆菌介导法将溶菌酶(Lyz)与绿色荧光蛋白(GFP)基因转入"甘农1号"杂花苜蓿(Medicago sativa Martyn)和"甘农3号"紫花苜蓿(Medicagosativa L.)品种中,获得含有该双元基因的苜蓿转基因愈伤组织;采用荧光检测和PCR扩增技术,检测到溶菌酶Lyz和绿色荧光蛋白GFP基因在苜蓿愈伤细胞中的表达;研究该双元基因在苜蓿品种"甘农1号"和"甘农3号"中转化的若干影响因素,确定适宜的转化条件以期提高基因转化效率。结果表明:75 mg·L^-1的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长具有显著抑制效应;300mg·L^-1头孢霉素能够有效地抑制农杆菌LBA4404的生长;OD₆₀₀值为0.4-0.5的农杆菌适宜的侵染时间是10min;经预培养3-4d的材料侵染后再共培养3d之后,在愈伤组织诱导培养基MS₊2,4-D 2.0mg·L^-1+KT0.5 mg·L^-1+0.6%琼脂+2.5%蔗糖的培养基上诱导出抗性愈伤组织;"甘农1号"和"甘农3号"的抗性愈伤组织诱导率分别为35%和32%。     

miR396-MsGRFs参与调控紫花苜蓿愈伤组织再生

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)愈伤组织再生率受基因型限制,是影响苜蓿遗传转化效率的主要因素之一。研究发现,GRF转录因子家族基因在提高多种植物愈伤再生中起着重要促进作用。本试验以拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGRF序列为模板,在紫花苜蓿基因组序列中查找,获得了含有miR396靶点的9个MsGRFs基因。除MsGRF3a和MsGRF4a外,其余7个MsGRFs在紫花苜蓿胚性愈伤组织中的表达量均显著高于非胚性愈伤。为了进一步研究MsGRFs对紫花苜蓿愈伤再生效率的影响,我们在紫花苜蓿中转入MIM396基因,降低miR396的表达。结果显示：MIM396植株叶片愈伤组织再生时间显著缩短,再生率显著提高;与野生型愈伤组织相比,在MIM396植株叶片诱导的愈伤组织中,除MsGRF3a外,其余MsGRFs显著高表达。以上研究表明,miR396-MsGRF通路对苜蓿愈伤组织再生起着重要调控作用,这为提高苜蓿再生效率,并打破基因型对不同苜蓿品种再生的限制提供候选基因。     

新疆大叶紫花苜蓿BADH基因转化体系的研究

以新疆大叶苜蓿（Medicago sativa ‘Xinjiang Daye’）叶片作为转化受体,利用农杆菌介导法将从梭梭（Haloxylon ammodendron）中获得的甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）转化紫花苜蓿,研究选择剂卡那霉素对愈伤组织分化的影响,并采用正交试验设计优化了影响紫花苜蓿转化的4个主要因子,建立了农杆菌介导的紫花苜蓿高效转化体系,获得了转基因植株。结果表明：卡那霉素在愈伤组织分化培养时的上限浓度以50 mg·L^-1为宜;转化过程中当浸染时间为5 min,菌液浓度OD₆₀₀为0.2,外植体预培养6 d,共培养后清洗外植体的头孢雷素（Cef）浓度为800 mg·L^-1是最佳转化方案,抗性芽分化率达到65.5%;4个因子中菌液浓度对转化率影响最大,清洗外植体的Cef浓度和浸染时间影响次之,外植体预培养时间的影响最小。经PCR和RT-PCR检测,初步证明了BADH基因已经整合到紫花苜蓿中,转化率为16.0%。     

脱水素基因转化紫花苜蓿及其初步抗旱性分析

为了获得抗旱性较强的转基因苜蓿,试验以紫花苜蓿品种"中苜2号"作为基因转化受体,将沙冬青脱水素基因通过农杆菌介导,转化到"中苜2号"中。试验结果表明,子叶和下胚轴作为外植体愈伤组织诱导频率最高,外植体与农杆菌的共培养时间以5d为最佳,试验共获得126株抗性再生植株;PCR和RT-PCR鉴定后,得到了11株阳性转基因苜蓿;通过干旱处理后,经初步的表型和脯氨酸分析显示,转基因苜蓿具有较强的抗旱能力。     

农杆菌介导的朝鲜碱茅PuP5CS基因转化紫花苜蓿的研究

为提高紫花苜蓿(Medicago sativa)的抗逆性,利用在朝鲜碱茅(Puccinellia chinampoensis)已克隆的Pu P5CS基因成功构建了p CAMBIA3300-Pu P5CS表达载体,以子叶为外植体,通过农杆菌介导共培养法转化紫花苜蓿"公农5号"(M.sativa cv.Gongnong No.5),并以2.0 mg·L-1的草铵膦进行筛选,抗性愈伤组织诱导率为22.4%,经草铵膦筛选的植株进行PCR检测和RT-PCR检测。结果显示,共获得11株转化植株,表明Pu P5CS基因已转入T0紫花苜蓿植株,且能够在RNA水平上正常表达。     

CPB-LAR-GFP表达载体的构建及其在紫花苜蓿愈伤组织中的表达

以无色花青素还原酶编码基因LAR为靶序列,构建携带绿色荧光蛋白GFP和抗除草剂bar基因的双标记选择植物表达载体,通过农杆菌介导法对紫花苜蓿进行遗传转化,经PCR检测和PPT筛选出抗性愈伤组织,转基因紫花苜蓿愈伤组织的缩合单宁含量比对照高30.8%。试验证明重组基因已转化至紫花苜蓿愈伤组织中并发挥生理功能,为研究缩合单宁合成与代谢的分子调控机制和培育具有抗除草剂和抗臌胀病的牧草新品种奠定基础。     

农杆菌介导的PSAG12-IPT基因转化柳枝稷研究

为延长生物能源作物柳枝稷(Panicum virgatum)的叶片功能期,以柳枝稷‘西稷1号’品系的成熟胚诱导的愈伤组织为受体,采用农杆菌介导法转化叶片衰老延缓基因P_SAG12-IPT.结果表明:经过农杆菌转化,共培养,抗性愈伤组织筛选、再生和生根培养,在农杆菌介导处理的8500块愈伤组织中共获得了320株转化植株;经PCR检测分析,转化植株中共有19株植株扩增出标记基因潮霉素B磷酸转移酶基因的目标片段,初步表明P_SAG12-IPT基因已整合到柳枝稷基因组中,转化率为0.223%.对柳枝稷转基因植株的叶片叶绿素含量、净光合速率、胞间CO₂浓度和气孔导度进行测定,表明P_SAG12-IPT基因在部分转基因植株中已经表达.     

农杆菌介导的Lyz-GFP基因对匍匐翦股颖Peen A-1 转化和表达的研究

 以匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ-１成熟胚为供试材料,建立了其植株高效再生体系。利用农杆菌介导法将溶菌酶与绿色荧光蛋白Ｌｙｚ-ＧＦＰ双元基因转入匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ-１ 胚性愈伤组织中,经培养获得抗病转基因植株。并对Ｌｙｚ-ＧＦＰ双元基因转化ＰｅｎｎＡ-１的适宜条件进行了研究。研究结果表明,在２．０ｍｇ／Ｌ２,４ Ｄ＋０．１ ｍｇ／Ｌ６-ＢＡ的ＭＳ培养基上ＰｅｎｎＡ-１愈伤组织诱导率最高,可达３６％,且质量最好。愈伤组织在ＭＳＯ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ 上分化率最高,达４２．５％;浓度为３００ｍｇ／Ｌ 的头孢霉素（Ｃｅｆ）可抑制农杆菌ＬＢＡ４４０４的生长;ＰｅｎｎＡ-１胚性愈伤组织经携有ｐＢＩ１２１-Ｌｙｚ-ＧＦＰ的农杆菌ＬＢＡ４４０４ （ＯＤ６００值０．３～０．５）侵染１０～１５ｍｉｎ,共培养３ｄ后,转化愈伤组织生长状况良好,转化率达１２．５％,且在后期的生长和转化苗的再生中有良好的表现,转化苗再生率为２７．５％;转化植株有较强的荧光表达量,并经ＰＣＲ 检测,获得的２株匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ-１转化植株中均扩增出７５０ｂｐ的目标基因片断。     

农杆菌介导的匍匐翦股颖胚性愈伤组织的转化和转CBF1基因植株的获得

以匍匐翦股颖成熟胚诱导的胚性愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法就不同的菌液浓度、共培养条件和真空处理等对愈伤组织的转化效率进行研究.结果表明,适宜的农杆菌侵染浓度光密度OD600nm为0.8～1.2,真空处理加全光照的共培养条件有助于提高转化效率;CBF1基因是来源于拟南芥的与抗逆相关的转录因子基因,在匍匐翦股颖中实现了其转化,通过PCR检测,50株转基因植株中32株扩增出640bp的目标片断,部分转基因植株生长缓慢,表现出矮化性状.非胁迫条件下,转基因植株游离脯氨酸含量为对照的5倍.断水处理5d后,转基因植株生长基本正常,脯氨酸含量增加约2倍,比对照植株高2～3倍.     

紫花苜蓿基因转化的影响因素分析

通过农杆菌介导法对紫花苜蓿不同品种植株进行了抗旱基因转化的研究,得到了一套紫花苜蓿基因转化的优化体系。研究表明,100 mg/L的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长有着显著的抑制效应。250 mg/L头孢霉素能够有效地抑制农杆菌菌株LBA4404的生长。紫花苜蓿供试材料被切后直接用OD600值为0.3~0.5的农杆菌LBA4404菌液侵染10~15 min;培养材料共培养3 d后在愈伤组织诱导培养基MS 2 mg/L 2,4-D 0.5 mg/LKT 30 g/L蔗糖 9 g/L琼脂 250 mg/L Cef上诱导出愈伤组织;在体细胞胚分化培养基MS 1.0 mg/L BA 0.3 mg/L NAA 30 g/L蔗糖 9 g/L琼脂 50 mg/L Kan 250 mg/L Cef上促进体细胞胚的分化;分化出的体细胞胚在再生培养基上(同分化培养基,Kan为80 mg/L)进一步发育成抗性转化苗;转化的无根小苗在生根培养基1/2 MS 1.0 mg/L IBA 1%蔗糖 0.8%琼脂 100 mg/L卡那霉素上可生长出根系。     

抗冻蛋白基因AFP表达载体构建及转化紫花苜蓿初报

以胡萝卜基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-T Easy Vector载体上,经XbalⅠ和SacⅠ双酶切,将目的片段连接到PBI121工程质粒上,通过农杆菌介导法转化和田苜蓿,为提高紫花苜蓿的抗冻性奠定基础.结果表明,成功克隆出抗冻蛋白基因AFP,并构建成AFP植物表达载体.获得了具有卡那霉素抗性的苜蓿愈伤组织,和田苜蓿愈伤组织的最佳Kan筛选浓度为60 mg/L.经PCR技术鉴定,AFP抗冻蛋白基因已整合到苜蓿基因组中.     

口蹄疫病毒抗原决定簇融合基因转化苜蓿

摘要：通过农杆菌的介导,以携带O型和A型口蹄疫抗原决定簇融合基因O21 O14 A21 HBcAg的植物表达载体转化苜蓿(Medicago sativa)愈伤组织,并再生得到抗性植株。试验建立了苜蓿甘农1号愈伤组织再生系统;优化了农杆菌介导的苜蓿遗传转化系统;获得抗性再生植株4棵;GUS报告基因在转化的愈伤组织中得到瞬时表达;抗性植株PCR检测结果证实目的基因已经成功整合到苜蓿基因组中。     

BADH/pepB双价基因无选择标记表达载体转化苜蓿的初步研究

选用公农1号紫花苜蓿,以5～7d莆龄的无菌子叶为外植体,通过农杆菌介导法将含有甜菜碱醛脱氢酶(BADH)和酸性蛋白酶(pepB)双价基因的无选择标记表达载体导入苜蓿子叶中,并用含有Na2CO3和NaHCO3碱性盐溶液的培养基进行筛选,得到抗盐碱转化植株.碱性盐浓度48mmol/L宜于子叶愈伤诱导,有利于转化植株的获得.对转化植株进行PCR检测,初步证明目的基囚序列已经整合剑苜楷基因组中.移栽成活的13棵碱性盐抗性植株经PCR检测有3棵植株呈阳性.     

影响中苜2号苜蓿愈伤组织诱导的主要因素分析

以MS为基本培养基,采用L16(45)正交试验设计,研究不同外植体类型及植物生长调节物质对中苜2号愈伤组织生长情况、诱导率的影响,筛选适合中苜2号愈伤组织诱导的最佳外植体类型和最优激素配比.结果表明.以下胚轴为外植体诱导的愈伤组织生长状况良好,诱导率高,为诱导愈伤组织的最佳外植体;2,4-D浓度是影响愈伤组织诱导率的最主要因素,其次是外植体类型;诱导中苜2号愈伤组织的最佳培养基为:MS+2,4-D 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L+6-BA 1mg/L+KT 0.2mg/L.     

紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导与增殖的研究

为在不同栽培苜蓿(Medicago sativa)品种上，建立稳定、快速且高效的组织培养体系，本试验以品种'游客’、'Paola’和'Sardi7’为研究材料，探究了苜蓿外植体、激素配比及金属离子(Cu²⁺、Ag⁺)，对其胚性愈伤组织的诱导效果。结果表明：下胚轴为诱导愈伤组织的最佳外植体；MS+1 mg·L^-12,4-D+0.2 mg·L^-1 KT为培养基时'游客’和'Paola’胚性愈伤诱导率分别为24.7%，16.7%；MS+2 mg·L^-12,4-D+0.2 mg·L^-1 KT为培养基时'Sardi7’胚性愈伤诱导效果最佳为27.3%；1 μmol·L^-1 和5 μmol·L^-1 Cu²⁺均能显著促进'Sardi7’'游客’和'Paola’愈伤组织的诱导；5 μmol·L^-1 Ag⁺显著诱导'游客’和'Paola’形成胚性愈伤组织，诱导率分别提高25.3%,46.7%(P<0.05)。本研究探索了诱导苜蓿愈伤组织的最佳外植体及其培养条件、金属离子促进不同苜蓿品种再生的作用，为突破同源四倍体栽培苜蓿品种基因型上的限制、提高胚性愈伤组织出愈率提供了思路。     

农杆菌介导的smt1富硒基因转化紫花苜蓿研究

利用遗传转化,将硒富基因转入紫花苜蓿（Medicago sativa）是提高苜蓿富硒能力,解决当前硒不足问题的有效途径之一。本研究以“中苜1号”紫花苜蓿为受体材料,通过农杆菌介导法将来自硒超富集植物二沟黄芪(Astragalus bisulcatus)的硒代半胱氨酸甲基转移酶基因(smt1)转入苜蓿,并以3 mg·L-1潮霉素进行筛选,获得转化植株10株。结果表明,5株均能扩增出与smt1基因大小相符的条带。RT PCR检测结果表明,2株目的基因表达呈阳性,这表明smt1基因已成功转入紫花苜蓿基因组中,且可以在植株中正常表达。