表达犬瘟热H基因重组伪狂犬病毒的构建及生物学特性研究

[目的]构建表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,并研究其生物学特性。[方法]通过RT-PCR方法获得Onderstepoort株H基因,插入pcDNA3.1（＋）建立好完整的真核细胞表达盒并将此表达盒亚克隆到转移载体p8AA上。在此基础上再将报告基因LacZ的表达盒插入转移载体,命名为p8AAZH。将p8AAZH与伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株基因组共转染至BHK-21细胞中进行基因重组包装出毒,待细胞病变后收集病毒液。通过蓝色蚀斑筛选、PCR、电镜观察以及Westernblot,筛选纯化重组病毒并鉴定目的基因的表达。同时在BHK-21细胞上测定重组病毒的生长曲线。[结果]获得了表达H蛋白的重组伪狂犬病毒,重组病毒与亲本Bartha-K61株的生长曲线、病变特征相一致。[结论]成功构建了表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,H基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,为犬瘟热活病毒载体疫苗的研制与开发打下基础。     

表达犬瘟热H基因重组伪狂犬病毒的构建及生物学特性研究

[目的]构建表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,并研究其生物学特性。[方法]通过RT-PCR方法获得On-derstepoort株H基因,插入pcDNA3.1（＋）建立好完整的真核细胞表达盒并将此表达盒亚克隆到转移载体p8AA上。在此基础上再将报告基因LacZ的表达盒插入转移载体,命名为p8AAZH。将p8AAZH与伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株基因组共转染至BHK-21细胞中进行基因重组包装出毒,待细胞病变后收集病毒液。通过蓝色蚀斑筛选、PCR、电镜观察以及Western blot,筛选纯化重组病毒并鉴定目的基因的表达。同时在BHK-21细胞上测定重组病毒的生长曲线。[结果]获得了表达H蛋白的重组伪狂犬病毒,重组病毒与亲本Bartha-K61株的生长曲线、病变特征相一致。[结论]成功构建了表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,H基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,为犬瘟热活病毒载体疫苗的研制与开发打下了基础。     

猪Ⅱ型圆环病毒-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建(初报)

根据GenBank发表的PCV2序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2 ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到了表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215(C)。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪Ⅱ型圆环病毒和伪狂犬病毒候选疫苗毒株。     

应用伪狂犬病毒表达载体研制重组疫苗的研究进展

随着分子生物学技术的发展,尤其是DNA重组技术的发展和应用使得疫苗方面的研究正逐渐从传统的灭活和弱毒疫苗向基因工程疫苗过渡,特别是以病毒和细菌为活载体疫苗的研制,以期克服常规疫苗在免疫时出现的毒力返强和散毒、免疫效率较低、过敏反应、用量较大等弊端。随着人们对伪狂犬病病毒分子生物学的深入研究,伪狂犬病毒特殊的基因组结构、宿主的广泛性和生物安全性作为重组病毒载体疫苗株越来越引起人们的关注,以伪狂犬病毒为载体研制基因工程疫苗的研究在国内外已取得了可喜的进展,现就国内外研究概况作一综述。1伪狂犬病毒的分子生物学…     

伪狂犬病毒TK基因缺失通用转移载体的构建及初步应用

以伪狂犬病毒为载体表达其他病原体抗原蛋白是伪狂犬病疫苗研究的一个重要方向。根据已发表的伪狂犬病毒（PRV）Ra株TK基因序列设计2对引物,用PCR方法得到同源左右臂,克隆入PUC19载体中。利用平末端连接的方法将绿色荧光蛋白（EGFP）的基因表达盒插入到缺失位点,并在下游引入1个多克隆位点,构建缺失通用转移载体PUC19TK-EGFP。用脂质体转染试剂盒将PUC19TK-EGFP和PRV-Ra株的基因组共转染BHK细胞,以EGFP为标记基因,用噬斑法得到纯化的重组病毒,命名为TK/EGFP,为研制以伪狂犬病毒为载体的二价或多价基因工程疫苗奠定了物质基础。     

江西省猪伪狂犬病原流行病学调查及其gB、gE及TK基因遗传变异分析

为了解江西省猪伪狂犬病原流行情况及遗传变异情况,对2017—2018年收集的疑似伪狂犬样品,以1对针对猪伪狂犬病毒gE基因的检测引物进行病原检测,并随机挑选15株PRV阳性样品,对PRV病毒复制必需的糖蛋白gB基因和主要毒力基因gE与TK基因克隆测序及遗传进化分析,用以探究其遗传变异关系。临床结果显示:猪伪狂犬病毒检出率由2017年的4.76%PRV gB/gE/TK全基因序列遗传进化分析结果表明:调查的15株伪狂犬病毒毒株与中国株处于同一分支,与美国株Bartha差异较大。核苷酸同源性分析结果表明:15株PRV gB基因相互间同源性为98.9%～100%;与参考毒株的gB基因的同源性96.7%～100%;gE基因相互间同源性为99.1%～100%;与参考毒株的gE基因的同源性98.1%～100%;TK基因变异相对较小,相互间同源性为100%,与参考PRV毒株的gE基因的同源性99.1%～100%。研究结果表明,gB基因和gE基因存在较多的变异,可能是当前流行毒株抗原变异及毒力增强从而使现有疫苗免疫保护力不佳的主要原因。     

猪伪狂犬病毒Real-time PCR检测方法的建立和弱毒疫苗病毒含量的检测

根据伪狂犬病毒的gB基因设计引物,将含gB基因的质粒作为标准品,绘制标准曲线,建立了伪狂犬病毒PRV的荧光定量PCR检测方法。该检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,不与PCV2、PPV、CSFV、JEV和PRRSV发生反应。用该方法对不同滴度病毒液的基因拷贝数进行检测,发现病毒滴度和病毒拷贝数之间存在较好的相关性。采用该方法对7种商品化PRV弱毒疫苗进行病毒含量检测,结果显示不同商品化弱毒疫苗的病毒含量存在显著差异,与说明书标注的病毒含量基本一致。     

猪伪狂犬病毒Real-time PCR检测方法的建立和弱毒疫苗病毒含量的检测

根据伪狂犬病毒的gB基因设计引物,将含gB基因的质粒作为标准品,绘制标准曲线,建立了伪狂犬病毒PRV的荧光定量PCR检测方法。该检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,不与PCV2、PPV、CSFV、JEV和PRRSV发生反应。用该方法对不同滴度病毒液的基因拷贝数进行检测,发现病毒滴度和病毒拷贝数之间存在较好的相关性。采用该方法对7种商品化PRV弱毒疫苗进行病毒含量检测,结果显示不同商品化弱毒疫苗的病毒含量存在显著差异,与说明书标注的病毒含量基本一致。     

基因重组技术在猪伪狂犬病毒基因工程疫苗中的研究进展

猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的急性高度接触性传染病,可造成不同日龄的猪发病,给养猪业造成了严重的经济损失。预防、控制甚至消灭猪伪狂犬病的主要措施之一是疫苗免疫接种。通过基因重组技术对PRV关键毒力基因进行改造,敲除毒力基因或插入免疫增强基因,是降低PRV毒力或提高病毒免疫保护效果的有效方法之一,也是研制安全高效PRV基因工程疫苗的重要手段。从基因同源重组、Cre/lox P位点特异性重组、细菌人工染色体和CRISPR基因编辑等不同基因重组技术应用方面对猪PRV基因工程疫苗的研制进行综述,为PRV重组疫苗的进一步深入研究提供参考。     

猪伪狂犬病毒免疫机制简述

<正>猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒引起的包括猪、羊、牛等动物的共患传染性疾病。伪狂犬病病毒(PRV)又称奥耶斯基病病毒或猪I型疱疹病毒,与人单纯疱疹病毒(HSV-1)以及带状疱疹病毒(VZV)同属α疱疹病毒。早在1813年,国外就出现了关于伪狂犬病的报道,初期称之为"奇痒病"。猪伪狂犬病毒只有一个血清型,但是不同毒株之间的生物学特性和毒力存在差异。本文简要介绍了猪伪狂犬病毒免疫机制。     

猪瘟伪狂犬病重组病毒SA215(A)疫苗株的构建(初报)

采用磷酸钙转染系统 ,将伪狂犬病三基因缺失疫苗SA2 15株DNA与PP6 3LacZE2DNA共转染Vero细胞 ,获得SA2 15 (A) 1、SA2 15 (A) 2和SA2 15 (A) 3等 12个重组病毒株。以光生物素标记的HCVE2基因为探针进行初步鉴定后 ,挑选SA2 15 (A) 1株作BamHⅠ酶切和southern转印杂交鉴定 ,结果表明构建是成功的 ,将其命名为SA2 15(A)。直接荧光抗体检测、SDS -PAGE电泳和western免疫印迹检测结果表明HCVE2基因在重组病毒内获得表达 ,产生大小约 5 1kd的蛋白。对SA2 15 (A)株进行部分生物学特性研究 ,培养特性观察试验表明该毒株可适应Vero、BHK2 1和鸡胚成纤维细胞等多种细胞 ,但对不同细胞系表现有一定的差异。     

表达猪2型圆环病毒ORF2蛋白的重组伪狂犬病毒的生物学特性研究

为了探讨重组伪狂犬病毒TK-/gG-/ORF2 作为疫苗候选株的潜在价值,对该病毒的增殖特性、遗传稳定性、安全性、免疫原性及保护力进行了研究.结果表明:重组病毒的增殖滴度与亲本株相当,遗传稳定性良好,以100倍的免疫剂量接种小鼠时对小鼠是安全的;重组病毒在免疫小鼠后可诱导小鼠产生针对PRV和PCV2的特异性免疫应答,并且对致死剂量(100LD50)PRV Ea株强毒的攻击具有100%的免疫保护效果.     

鸡痘病毒载体研究进展

本文就鸡痘病毒作为基因工程重组疫苗的重要载体研究的进展作以综述，主要包括鸡痘病毒表达载体的构建，外源基因在重组鸡痘病毒中的表达及免疫效果，并对鸡痘病毒载体的研究及开发应用前景加以展望。     

表达小反刍兽疫病毒H基因的山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

［目的］研制小反刍兽疫羊痘活载体疫苗。［方法］利用PCR技术扩增小反刍兽疫病毒H基因,克隆到pGEM-T easy载体,Nhe Ⅰ和Hin-d Ⅲ双酶切重组质粒,将目的片段插入到真核表达载体pEGFP-N1-P7.5中,得到重组载体pEGFP-N1-P7.5-H,重组载体Hin-d Ⅲ、NheⅠ双酶切片段EGFP-P7.5 H平末端连接到KpnⅠ 酶切后的载体pUC119-TK中,得到通用转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-H。［结果］经酶切鉴定及PCR扩增检测,表明构建载体正确。pUC119-TK-EGFP-P7.5-H转染羊痘病毒感染的BHK21细胞,48 h后报告基因表达。［结论］该研究为研制小反刍兽疫基因工程活载体疫苗奠定基础。     

表达小反刍兽疫病毒H基因的山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

笔者以山羊痘病弱毒疫苗毒株TK基因内KpnI为插入位点,构建了表达绿色荧光蛋白和小反刍兽疫（PPR）H基因的重组山羊痘病毒通用转移载体,为今后研究羊痘病毒活载体疫苗奠定基础。     

表达小反刍兽疫病毒H基因的山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定(英文)

[Objective] This study was to develop a live vector vaccine of goat pox virus of Peste des petits ruminants(PPR). [Method] Using PCR amplification technique, PPR H gene was obtained, then ligated into pGEM-T easy vector; the recombinants were digested by Nhe Ⅰ and Hind Ⅲ, and ligated into pEGFP-N1-P7.5, yielding the recombinant vector pEGFP-N1-P7.5-H; next the expression cassette EGFP-N1-P7.5-H was first released from recombinant vector pEGFP-N1-P7.5-H by double digestion of Hind Ⅲ and Nhe Ⅰ and ligated into pUC119-TK that was digested by Kpn Ⅰ, yielding the transfer vector pUC119-TK-EGFP-P7.5-H. [Result] Identification and double enzyme digestion showed that the transfer vector pUC119-TK-EGFP-P7.5-H was correctly constructed. From the transfer vector transfected BHK-21 cells which infected GTPV AV41, specific fluorescence was observed at 48th h of transfection. [Conclusion] The construction of goat poxvirus live vector laid a foundation for the live vector vaccine of PPR vaccine.